Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Resumo

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Resumo

Zebrafish emergiram como um poderoso modelo de várias doenças humanas e uma ferramenta útil para uma gama crescente de estudos experimentais, abrangendo fundamentais da biologia do desenvolvimento através de telas em grande escala de genéticas e químicas. No entanto, muitas experiências, especialmente aqueles relacionados à infecção e modelos de enxerto heterólogo, dependem de microinjeção e imagem latente de embriões e larvas, que são técnicas laboriosas que exigem habilidade e experiência. Para melhorar a precisão e a taxa de transferência de técnicas de microinjeção atuais, desenvolvemos uma série de dispositivos microstructured orientar e estabilizar o zebrafish embriões na fertilização de post 2 dias (dpf) em orientação lateral, ventral ou dorsal, antes do procedimento. Para ajudar à imagem de embriões, criamos um dispositivo simples com canais que orientar 4 zebrafish lateralmente em paralelo contra uma lamela de vidro. Juntos, as ferramentas que apresentamos aqui demonstram a eficácia das abordagens fotolitográfica para gerar dispositivos úteis para a otimização das técnicas de zebrafish.

Introdução

Zebrafish emergiram como um poderoso modelo para muitos campos, a partir de estudos de fundamental biologia do desenvolvimento de grande escala genética e química telas^1,2. Rotina manipulações genéticas, tais como a superexpressão do gene, nocaute, CRISPR/Cas9 mutagênese e transgênese dependem de microinjeção de material genético para o zigoto unicelular, que levou ao desenvolvimento de simples, fácil de usar, comercialmente ferramentas disponíveis para orientar e estabilizar os ovos para injeção³. Outras abordagens, tais como transplante e infecção, muitas vezes exigem microinjection em posterior fase de embriões e larvas usando maior calibre capilar agulhas⁴. No entanto, a utilização de agulhas de calibre maiores apresenta desafios técnicos significativos, como é mais difícil de penetrar o tecido-alvo sem empurrar ou rolando o embrião. Nestas condições, obtendo a água adequada a tensão necessária para estabilizar o embrião enquanto evitando a secagem durante o procedimento é difícil e embriões não pode ser idealmente orientado para injeção no tecido-alvo.

Após microinjeção, é frequentemente útil para embriões injetados para selecionar aqueles que foram injetados com êxito e para capturar imagens do ponto inicial tempo de tela. Para enfrentar estes desafios, desenvolvemos uma gama de dispositivos microstructured que ajudam a estabilizar 2 embriões dpf em várias orientações para microinjeção⁵e para pós-injeção rápida triagem baseada em imagem.

Para obter uma resolução estrutural suficiente nestes dispositivos, utilizamos técnicas fotolitográfica. Comumente utilizado em indústrias de microeletrônicos e mais recentemente extrapolada para fabricação de microfluidic, essas abordagens podem alcançar estruturas verticais que variam de 1-1.000 µm, numa escala adequada para manipulação de zebrafish embriões e larvas. Todos os dispositivos foram fabricados usando polydimethylsiloxane (PDMS), que é mais barato, robusto fisicamente, biologicamente inerte e transparente.

Matrizes de superfície microstructured (MSAs) foram formatados como blocos de PDMS com uma superfície superior padronizada, análogo dos canais simples em blocos de agarose comumente usado para microinjeção de ovo. Para rastreio pós-injeção, 6 dispositivos de imagem podem ser dispostos em uma padrão com fundo de vidro 6 placa de. Estes dispositivos são projetados para facilitar o carregamento de embriões, enquanto o procedimento de descarga convenientemente permite resgate de embriões específicos, facilitando baseada em imagem abordagens de rastreio de uma forma mais amigável do que aqueles dispositivos anteriormente desenvolvido pela Beebe laboratório⁶.

Protocolo

Microinjeção de larvas foi aprovada pelo Massachusetts General Hospital Subcomissão de pesquisa cuidado de Animal sob protocolo 2011N000127.

1. dispositivo fabricação

Nota: Todos os computador assistida (CAD) arquivos de desenho utilizados para a concepção de máscaras de fotolitografia descritas aqui (Figura 1) estão disponíveis para download. Consulte tabela de materiais para links.

1. Fabrica a bolacha de molde mestre em uma sala limpa de classe 1.000 usando técnicas padrão fotolitográfica⁷. Para os canais e matrizes de microestrutura, padrão o fotorresiste negativa baseada em epóxi sequencialmente em 3 camadas usando 3 máscaras separadas, de acordo com as instruções do fabricante: 100 µm para as características superficiais, 200 µm para as características médias e 400 µm para as características profundas. Para o dispositivo de imagem, padrão de duas camadas usando 400 µm para as características superficiais e 600 µm para os recursos do fundo.
2. Fita a bolacha concluída para a base de um prato de Petri para fundição (Figura 2) de 15 cm.

2. preparação de matrizes de superfície Microstructured - PDMS

1. Para tornar utilizáveis dispositivos, elenco polydimethylsiloxane (PDMS), usando a bolacha mestre como um molde. Combine 50 g de monômero PDMS com 5 g de iniciador e misture bem em um plástico, prato de pesagem com um garfo de plástico.
2. Despeje a mistura sobre o molde com cuidado.
3. Desgaseificar num exsicador de vácuo no 16-25 pol Hg (54-85 kPa) por 1h.
4. Para curar o PDMS, asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h. O PDMS deve curar a um sólido, firme, mas flexível.
5. Corte cuidadosamente ao redor do dispositivo sobre a bolacha mestre usando um bisturi, certificando-se de manter o contato entre a ponta do bisturi e a superfície da bolacha. Usando fórceps, descasque a réplica PDMS longe da bolacha e a transferência para um limpo cm 10 placa de Petri, lado de recurso para cima (Figura 3).
6. Tratar o dispositivo com plasma de oxigênio utilizando um forno de plasma para 35 s para reduzir a hidrofobicidade.
7. Cubra com meio de embrião de zebrafish (E3) contendo 168 mg/L de Metanossulfonato de etila 3-aminobenoate (MS-222, pH 7,5). Remover quaisquer bolhas de características mais profundas pelo fluxo de água sobre a superfície do dispositivo usando uma pipeta de transferência.

3. preparação de matrizes de superfície Microstructured - Agarose

1. Para fazer um molde negativo de PDMS, primeiro trate um dispositivo PDMS com plasma de oxigênio.
2. Trate o dispositivo PDMS com 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) vapor de silano para criar uma superfície inerte⁸. Brevemente:
   1. Coloque o PDMS para ser tratada característica-lado-para cima em uma câmara de vácuo dentro de uma coifa.
   2. Ao lado do PDMS, coloque um pequeno prato de vidro ou alumínio aberto, e cuidadosamente Pipetar 200 µ l de PFDTS (98% silano) no prato.
      Cuidado: Silano PFDTS é altamente volátil, reage violentamente com a água, é inflamável e provoca graves danos de pele e olho no contato. MSDS de leitura em detalhe antes do uso.
   3. Fechar a câmara de vácuo e aplicar vácuo durante 15-30 minutos, ou até que o silano PFDTS é completamente evaporado.
3. Coloque o dispositivo em um prato de Petri e usar como um molde para PDMS fresco, preparado como descrito no passo 2.1-2.3.
4. Asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h, em seguida, descascar toda a camada de PDMS fresco do dispositivo de tratados e coloque em um prato de Petri fresco. Este então pode ser usado como um molde negativo para converter agarose.
5. Para preparar a agarose, ferva uma solução de 2% de baixo coaguladas agarose de temperatura na E3 no microondas até a agarose é totalmente dissolvido.
6. Despeje o agarose quente sobre o molde negativo de PDMS e remover quaisquer bolhas no agarose cobrindo o dispositivo por agarose quente fluindo sobre as características de uma pipeta de transferência.
7. Uma vez que as bolhas são removidas, refrigere a 4 ° C, para definir o agarose.
8. Retire o molde negativo de PDMS por deformar o PDMS de baixo com a mão o bloco de agarose, transferir o bloco de agarose para uma nova placa de Petri e molhado com E3 contendo MS-222.

4. preparação de PDMS dispositivos de imagem

1. Para tornar utilizáveis dispositivos, elenco PDMS, usando a bolacha mestre como um molde. 50 g de monômero PDMS aliam 5g de iniciador (o mesmo que usou na etapa 2.1) e misture cuidadosamente em um plástico, prato de pesagem com um garfo de plástico.
2. Despeje a mistura sobre o molde com cuidado.
3. Desgaseificar num exsicador de vácuo no 16-25 pol Hg (54-85 kPa) por 1h.
4. Para curar o PDMS, asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h. O PDMS deve curar a um sólido, firme, mas flexível.
5. Corte os dispositivos a bolacha de mestre e um soco para fora de portas usando um soco de 1,5 mm.
6. Tratar os dispositivos e um vidro de 6-poços-fundo bem placa com plasma de oxigênio por 35 s, conforme descrito na etapa 2.6.
7. Ligação de um dispositivo característica-lado-para baixo para cada lamela de vidro da placa 6-poços, colocando-o sobre uma chapa de 85 ° C por 10 min.
   Nota: Para confirmar a ligação bem sucedida, aplique pressão firme ao lado do dispositivo ligado usando fórceps. O dispositivo deve permanecer anexado para a lamela de vidro.

5. Zebrafish cultura

1. Embriões de zebrafish cultura para dpf 2 usando técnicas padrão³.
2. Dechorionate de embriões utilizando protease fórceps ou 1 mg/mL misturar (veja a tabela dos materiais)³ pelo menos 30 a 60 minutos antes da carga de dispositivo, que permita a endireitar.
3. Anestesiar embriões utilizando solução-mãe (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5), adicionando 1 mL de 25 X para a E3 em sua placa de Petri.

6. orientação do Zebrafish na superfície Microstructured - matrizes do torrão

1. Prepare o bloco PDMS da etapa 2.7 (Figura 3A) em sua placa de Petri, tal que é coberto por uma camada fina (1-2 mm) da E3, que permite a fácil manipulação de embriões.
2. Transferi o número necessário de embriões (geralmente de 10-20 por condição) para a superfície do bloco de PDMS utilizando uma pipeta de transferência.
3. Usando uma ferramenta de micromanipulação (laço de cabelo ou similar), empurrar os embriões para os divots microstructured (Figura 3A). Uso de divots é particularmente adequado para orientações dorsais e ventrais.
   Nota: Para os divots com um apertado caber (dorsal e ventral), tente os embriões de posicionamento na superfície do bloco em paralelo para o guardião e então rolá-los em posição usando um laço de cabelo. A empurrá-los mais profundo para o guardião irá ajudar a mantê-los estáveis.

7. orientação do Zebrafish na superfície Microstructured - canais Microstructured

1. Retirar o bloco PDMS estampado com microstructured canais (Figura 3B), utilizando uma pipeta de transferência até que o nível de E3 gotas abaixo da borda do bloco, mas ainda está presente no reservatório e canais e em uma camada fina sobre o PDMS E3.
2. Transferi 10 embriões da etapa 5.3 para o reservatório, usando uma pipeta de transferência, tomando cuidado para não transbordar as bordas.
3. Usando um laço de cabelo, manipular cada embrião dentro do funil na entrada do canal apropriado e orientar tais que a cabeça do embrião é em direção do canal e o embrião tem a orientação apropriada que entra o canal.
4. Deslize cada embrião para baixo o canal usando um laço de cabelo até que ele atinja o orientador microfeatures das paredes do canal que ajudam a mantê-lo no lugar. Utilização de canais microstructured é particularmente recomendada para a orientação lateral.
   Nota: Para reduzir o embrião durante a microinjeção, tente ajustar a quantidade de tensão superficial por desenho E3 do reservatório.

8. microinjection de Zebrafish

1. Prepare a agulha microinjeção.
   1. Fazer conta de vidro de borosilicato agulhas usando um extrator de micropipeta como descrito anteriormente,⁴. As agulhas resultantes devem ser estreitadas a um ponto em uma extremidade, com um comprimento do atarraxamento de cerca de 10 mm.
   2. Preparar a solução a ser injetada, no presente caso 100 nM quimiotático (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanina (fMLP) ou o leucotrieno B4 (LTB4)) e 100 nM de 70 kDa tracer de dextrano de rodamina em PBS.
   3. Carregar 5 µ l de solução para a agulha usando uma pipeta finamente cônico ponta (ver tabela de materiais).
   4. Monte a agulha em um micromanipulador montado num suporte magnético e conectado a um microinjector de picopump.
2. Quebre a ponta da agulha em um ângulo de 45 ° beliscando a ponta cónica com fórceps.
3. Ajustar tamanho de injeção em bolus de 1 nL, ajustando o tempo de injeção no controlador de picopump.
4. Ajuste o ângulo da agulha microinjeção. Um ângulo da agulha de 45 ° no controlador de micromanipulação geralmente é um bom ponto de partida, com a agulha paralela ao comprimento do embrião. Um ângulo mais íngreme pode ser usado para minimizar o movimento lateral do embrião durante a microinjeção.
5. Controlando a placa de Petri com a mão esquerda e o micromanipulador de agulha com o direito, trazer a agulha tão próximo quanto possível para o local pretendido da microinjeção, neste caso a vesícula ótica.
   Nota: A vesícula ótica pode ser identificada como o órgão oblongo posterior ao olho contendo dois menores distintas escuras oblongas estruturas (otólitos).
6. Usando o controlador de micromanipulação, penetrar o tecido-alvo (no caso da vesícula ótica) tal que a ponta da agulha está dentro da vesícula e injetar o volume predefinido utilizando o interruptor de pé picopump.
   Nota: Se o tecido resiste à penetração, tente tocar suavemente o botão controlador de micromanipulação.
7. Para liberar os embriões, fluxo E3 sobre a superfície de cima para baixo usando uma pipeta de transferência, ou agitando o prato tal que os embriões são libertados para a E3 circundante.
8. Transferi os embriões para um prato de recuperação da E3 sem MS-222, usando uma pipeta de transferência.

9. seleção de embriões utilizando o dispositivo de imagem PDMS

1. Prime o dispositivo da etapa 4.7 por fluxo E3 (+ MS-222) através da porta. Isso pode ser feito usando uma pipeta de 1.000 µ l ou uma pipeta de transferência de ponta estreita.
2. Encha o poço com E3 + MS-222, até que o dispositivo é coberto.
3. Entrega 4 embriões injetados da etapa 8,7 em cada poço usando uma pipeta de transferência. Embriões podem ser previamente anestesiados se desejado incubando na E3 + MS-222 por 1-2 min antes de carregar (etapa 5.3).
4. Usando uma ferramenta de micromanipulação (laço de cabelo ou similar), orientar os embriões nas entradas dos canais de imagem na orientação desejada (posição invertida ou cabeça primeiro, dependendo do dispositivo utilizado) e empurrá-los parcialmente no dispositivo (Figura 4A). Isso ajudará a atraí-los para o dispositivo uniformemente.
5. Desenhe E3 através do dispositivo da porta, utilizando uma pipeta de 1.000 µ l ou pipeta de transferência até que os embriões são atraídos para os canais na orientação correta para a imagem (Figura 4B).
   Nota: Tenha cuidado para não chupar os embriões além do ponto de interceptação, isto danificará os embriões e alterar sua orientação.
6. Transferência placa para microscópio de imagem (Figura 4).
7. Imagem usando um microscópio fluorescente invertido.
   1. Ajuste a ampliação selecionando a lente adequada. 10 X é geralmente uma ampliação útil para imagem latente do zebrafish migração dos neutrófilos.
   2. Ajuste a intensidade da fonte de luz e tempo de exposição para cada canal para que cada sinal é claro, mas não saturado.
   3. Capture imagens para cada canal. Aqui, usamos proteína verde fluorescente (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) e transmitidos canais. Imagens multicanais podem ser combinadas durante o pós-processamento (Figura 4B-eu).

Resultados

A abordagem descrita aqui demonstra o projeto (Figura 1) e fabricação de dispositivos para uso com 2 dpf zebrafish, usando fotolitográfica (Figura 2) e técnicas de macio-litografia (Figura 3). Este método permite testes rápidos de muitas iterações de projeto e as modificações e alterações e otimização de dimensões de microestrutura para uso com zebrafish em outras fases do desenvolvime...

Discussão

Aqui, descrevemos o uso de dispositivos recentemente desenvolvemos para facilitar 2 dpf zebrafish microinjeção⁵e introduzir um dispositivo de montagem simples de agarose-livre para a imagem latente conveniente de embriões. Estas ferramentas destacam-se o utilitário de fotolitográfica técnicas para a fabricação de dispositivos úteis para as técnicas de zebrafish.

Encontramos dispositivos MSA particularmente útil para a injeção de células ou partículas prop...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184  Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize  zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki