최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

요약

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

초록

Zebrafish 대규모 유전과 화학 스크린을 통해 기본적인 발달 생물학에 걸친 다양 한 인간 질병 및 실험 연구의 증가 범위에 대 한 유용한 도구 강력한 모델로 떠오르고 있다. 그러나, 많은 실험, 특히 감염 및이 종이 식 모델에 관련 된 microinjection와 배아와 힘 드는 기법 기술 및 전문 지식이 필요로 하는 애벌레의 이미지에 의존 합니다. 정밀도 현재 microinjection 기법의 처리량을 개선 하기 위해, 우리는 이전에 복 부, 등, 또는 측면 방향 동양 zebrafish 태아 2 일 게시물 수정 (dpf)에 안정화를 microstructured 장치의 시리즈를 개발 합니다 절차입니다. 배아의 이미징에 도움, 우리는 또한 채널 4 zebrafish 유리 커버 슬립에 대 한 동시에 옆 방향으로 간단한 장치 설계. 함께, 우리가 여기 제시 도구 zebrafish 기술의 최적화를 위한 유용한 장치를 생성 하기 위해 photolithographic 접근의 효과 보여 줍니다.

서문

Zebrafish의 기본적인 발달 생물학 대규모 유전 연구에서 다양 한 분야에 대 한 강력한 모델로 등장 하 고 화학 스크린^1,2. 일상적인 유전자 조작, 유전자 overexpression, 최저, CRISPR/Cas9 mutagenesis, transgenesis 등 상업적으로 간단한, 쉬운--사용의 개발을 주도하 고 있다 단일 셀 zygote에 유전 물질의 microinjection에 의존 방향을 사출³계란 안정화를 사용할 수 있는 도구. 감염, 이식 등 다른 접근으로 나중 단계 태아 그리고 애벌레 더 큰 게이지 모 세관 바늘⁴를 사용 하 여 microinjection을 해야 하는 경우가 많습니다. 그러나, 더 큰 계기 바늘의 사용으로 밀거나 태아 롤링 없이 표적 조직에 침투 하기 어려운 중요 한 기술적 과제, 선물. 이러한 조건에서 절차 동안 건조를 방지 하는 것은 어렵다, 하는 동안 태아를 안정화 하는 데 필요한 적절 한 물 긴장 및 배아 수 있습니다 이상적으로 표적 조직에 주입에 대 한 지향.

Microinjection, 다음 그것이 주입된 태아 성공적으로 주입 되어, 그를 선택 하 고 초기 시간 포인트의 이미지를 캡처 화면 종종 유용 합니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 microinjection⁵, 그리고 빠른 이미지 기반 심사 후 주입을 위한 다양 한 방향에서 2 dpf 배아를 안정화 하는 데 도움이 microstructured 장치의 범위를 개발 했습니다.

이 장치에 충분 한 구조 해상도 얻으려면, 우리는 photolithographic 기술을 활용. 최근 미세 제작 추정 마이크로 전자 산업 등에서 일반적으로 사용 되는, 이러한 접근 1-1000 µ m, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 조작에 적합 한 규모에서에서 배열 하는 수직 구조를 얻을 수 있습니다. 모든 장치입니다 (PDMS), 저렴 한, 생물학으로 비활성, 육체적으로 강력 하 고 투명 한은 사용 하 여 날조 되었다.

Microstructured 표면 배열 (MSAs) 꽃무늬 최고 표면 PDMS의 블록으로 포맷 했다, 계란 microinjection 위해 간단한 채널 agarose 블록에 유사한 일반적으로 사용. 포스트 주입 심사에 대 한 이미징 장치 6 표준 유리 바닥 6 잘 플레이트에 배열할 수 있다. 이 소자는 배아의 쉬운 로딩을 위한, 언로드 절차 편리 하 게 이미지 기반 구조 촉진 특정 배아의 수에 의해 개발 된 이전 그 장치 보다 더 많은 사용자 친화적인 방식으로 접근을 차단 합니다 비비 실험실⁶.

프로토콜

애벌레의 microinjection 프로토콜 2011N000127에서 매사 추세 츠 종합 병원 분과 연구 동물 관리에 의해 승인 되었다.

1. 장치 제조

참고: 모든 컴퓨터 보조 그리기 (CAD) 파일 여기에서 설명 하는 사진 평판 마스크를 디자인 하는 데 사용 (그림 1) 다운로드를 위해 사용할 수 있습니다. 링크 테이블의 자료를 참조 하십시오.

1. 표준 photolithographic 기법⁷를 사용 하 여 클래스 1000 클린 룸에 마스터 형 웨이퍼를 조작. 미세 배열 및 채널에 대 한 제조업체의 지침에 따라 순차적으로 3 별도 마스크를 사용 하 여 3 계층에 에폭시 기반 부정적인 감광 제 패턴: 얕은 기능에 대 한 100 µ m, 중간 기능에 대 한 200 µ m 및 400 µ m에 대 한 깊은 기능. 이미징 장치에 대 한 두 가지 패턴 레이어 얕은 기능과 깊은 기능에 대 한 600 µ m에 대 한 400 µ m를 사용 하 여 경우
2. 15 cm (그림 2)을 주조에 대 한 페 트리 접시의 기초를 완성 된 웨이퍼를 테이프.

2. Microstructured 표면 배열-PDMS의 준비

1. 장치를 사용할 수 있도록입니다 (PDMS), 금형으로 마스터 웨이퍼를 사용 하 여 캐스팅. 초기자의 5 g PDMS 단위체의 50 g을 결합 하 고 플라스틱 플라스틱 포크와 접시의 무게에 철저 하 게 혼합.
2. 신중 하 게 금형 혼합물을 따르십시오.
3. 1 시간에 16-25 inHg (54-85 kPa)에서 진공 desiccator에 드.
4. 치료는 PDMS, 적어도 3 h 65 ° C에서 구워. PDMS 확고 하지만 유연한 고체를 치료 한다.
5. 메스의 팁과 웨이퍼 표면 사이 접촉을 유지 하는 메스를 사용 하 여 마스터 웨이퍼 장치 주위 잘라 신중 하 게 합니다. 집게를 사용 하 여, 웨이퍼와 깨끗 한 10 cm 배양 접시, 기능 쪽 (그림 3)에 PDMS 복제 껍질.
6. 산소 플라즈마 35 플라즈마 오븐을 사용 하 여 장치 취급 hydrophobicity를 줄이기 위해 s.
7. Zebrafish 태아 매체 (E3) 168 mg/L 에틸 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5)의 포함 된 커버. 전송 피 펫을 사용 하 여 장치의 표면에 물이 흐르는 깊은 기능에서 모든 거품을 제거 합니다.

3. Microstructured 표면 배열-Agarose의 준비

1. 네거티브 PDMS 몰드를 만들기 위해 먼저 산소 플라즈마와 PDMS 장치 취급.
2. 1H, 1H, 2H, 불활성 표면⁸만들려고 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) 실 란 증기 PDMS 장치 취급. 간단히:
   1. 수 처리 기능-사이드 업 연기 후드 내에서 진공 챔버에 PDMS를 놓습니다.
   2. PDMS, 옆 작은 오픈 유리 또는 알루미늄 접시를 놓고 신중 하 게 PFDTS의 200 µ L 플라스틱 (98 %silane) 접시에.
      주의: PFDTS silane 높은 휘발성은, 물으로 강력 하 게 반응, 가연성 이며 접촉에 심각한 피부 및 안구 손상의 원인. 사용 하기 전에 자세히 읽기 MSDS입니다.
   3. 진공 챔버를 닫고 진공 15-30 분, 또는 PFDTS silane 완전히 증발 때까지 적용 합니다.
3. 장치를 페 트리 접시에 놓고 2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 준비 신선한 PDMS 몰드로 사용 합니다.
4. 적어도 3 h, 65 ° C에서 구워 다음 처리 장치에서 신선한 PDMS의 전체 레이어를 껍질과 신선한 배양 접시에 놓습니다. 이 다음 agarose를 부정적인 형으로 사용할 수 있습니다.
5. Agarose를 준비 하려면 낮은 고 온도 agarose E3에서 전자 레인지에서의 2% 솔루션은 agarose는 완전히 녹아 때까지 끓인 다.
6. 부정적인 PDMS 몰드에 붓는 뜨거운 agarose 고 흐르는 뜨거운 agarose에 의해 전송 피 펫을 사용 하 여 기능 장치 취재 agarose에서 모든 거품을 제거 합니다.
7. 일단 거품이 제거 되는 agarose 설정 하 4 ° C에서 냉동.
8. 손으로 밑에서 PDMS를 변형 하 여 부정적인 PDMS 몰드에서 agarose 블록을 제거, 새로운 배양 접시, 및 MS-222를 포함 하는 e 3와 젖은 agarose 블록을 전송 합니다.

4입니다. PDMS 이미징 장치 준비

1. 장치를 사용할 수 있도록, PDMS, 금형으로 마스터 웨이퍼를 사용 하 여 캐스팅. PDMS 단위체의 50 g 5 g (동일 단계 2.1에서에서 사용) 초기자 및 플라스틱 플라스틱 포크와 접시의 무게에 철저 하 게 혼합 결합.
2. 신중 하 게 금형 혼합물을 따르십시오.
3. 1 시간에 16-25 inHg (54-85 kPa)에서 진공 desiccator에 드.
4. 치료는 PDMS, 적어도 3 h 65 ° C에서 구워. PDMS 확고 하지만 유연한 고체를 치료 한다.
5. 마스터 웨이퍼에서 소자를 잘라내어 포트 1.5 m m 펀치를 사용 하 여 밖으로 펀치.
6. 치료 장치 및 6-잘 유리 하단 잘 산소 플라즈마 35 접시 s, 단계 2.6에에서 설명 된 대로.
7. 10 분 동안 85 ° C 열판에 그것을 배치 하 여 한 장치 기능-사이드-아래 6 잘 플레이트의 각 유리 coverslip에 본드.
   참고: 확인 하 고 성공적인 결합, 한쪽 집게를 사용 하 여 보 세 장치 회사 압력을 적용. 장치는 유리 coverslip에 연결 된 유지 되어야 합니다.

5. 제 브라 문화

1. 표준 기술³를 사용 하 여 2 dpf 문화 zebrafish 태아.
2. Dechorionate 배아 포 셉 또는 1 mg/mL 효소를 사용 하 여 그들을 수 있도록 장치에 로드 하기 전에 적어도 30-60 분 (참조 자료 테이블)³ 을 혼합.
3. 배아는 E3 (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) 25 X의 1 mL을 추가 하 여 재고 솔루션을 사용 하 여 그들의 페 트리 접시에 anaesthetize

6. Microstructured 표면-디벗 배열에 Zebrafish의 방향

1. 배아의 쉽게 조작할 수 있는 e 3의 얇은 (1-2 m m) 층에 의해 포함 되는 그것의 페 트리 접시에 2.7 (그림 3A) 단계에서 PDMS 블록을 준비 합니다.
2. 전송 피 펫을 사용 하 여 PDMS 블록의 표면에 배아 (조건 당 일반적으로 10-20)의 필요한 수를 전송 합니다.
3. Micromanipulation 도구를 사용 하 여 (머리 루프 또는 이와 유사한), 배아 microstructured divots (그림 3A)에 밀어. Divots의 사용은 지 느 러 미 및 복 부 방향에 특히 적합 합니다.
   참고:와 엄격한 divots (지 느 러 미 및 복 부)에 맞게, 배아, 디벗을 병렬로 블록의 표면에 위치 하 고 머리 루프를 사용 하 여 위치에 그들을 압 연. 깊이 디벗으로 그들을 밀어 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 됩니다.

7. Microstructured 표면-에서 Zebrafish의 방향을 Microstructured 채널

1. E3 PDMS 블록 microstructured 채널 (그림 3B) e 3의 수준, 블록의 가장자리 아래로 떨어지면 하지만 여전히 존재 저수지와 채널에는 PDMS에 얇은 층에서 때까지 전송 피 펫을 사용 하 여 패턴을 그립니다.
2. 가장자리를 오버플로 하지 않도록 주의 되 고 전송 피 펫을 사용 하 여 저수지에 단계의 5.3 10 배아를 전송.
3. 머리 루프를 사용 하 여 적절 한 채널의 입구에 깔때기에 각 배아를 조작 하 고 태아의 머리는 채널 쪽으로 고 태아는 적절 한 방향으로 채널 입력 되도록 방향.
4. 각 태아 orienting microfeatures 장소에 그것을 유지 하는 데 도움이 채널 벽에 도달할 때까지 머리 루프를 사용 하 여 채널 아래로 슬라이드. Microstructured 채널의 사용은 특히 측면 방향에 대 한 권장 됩니다.
   참고: microinjection 중 슬라이딩 배아를 줄이기 위해, 저수지에서 e 3를 그려서 표면 장력의 양을 조정 해보십시오.

8입니다. 제 브라 microinjection

1. Microinjection 바늘을 준비 합니다.
   1. 앞에서 설명한⁴micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 붕 규 산 유리 microcapillary 바늘을 확인 합니다. 결과 바늘 약 10 m m의 테이퍼 길이 한쪽 끝 지점으로 테이퍼 합니다.
   2. 이 경우 100 nM chemoattractant에 주입 하는 솔루션을 준비 (N-Formylmethionine-leucyl-페닐알라닌 (fMLP) 또는 Leukotriene b 4 (LTB4))와 100 nM 70 kDa Rhodamine dextran 추적 프로그램 PBS에.
   3. 가늘게 가늘게 한 피 펫을 사용 하 여 바늘에 솔루션의 5 µ L 로드 팁 (자료 표 참조).
   4. 마그네틱 스탠드에 장착 하 고 picopump microinjector에 연결 된 micromanipulator에 바늘을 탑재 합니다.
2. 집게와 테이퍼 팁을 곤란 하 게 하 여 45 ° 각도로 바늘의 팁을 휴식.
3. 1 주입 bolus 크기 조정 picopump 컨트롤러에 주입 시간을 조정 하 여 nL.
4. Microinjection 바늘의 각도 조정 합니다. Micromanipulation 컨트롤러에 45 °의 바늘 각도 일반적으로 태아의 길이에 평행 하 게 바늘으로 좋은 출발점. 험한 각도 microinjection 동안 태아의 측면 움직임을 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다.
5. 왼손으로 페 트리 접시와 오른쪽으로 바늘 micromanipulator controlling, microinjection,이 경우 otic 소포의 의도 사이트로 최대한 바늘 가까이 가져.
   참고: otic 소포 직사각형 기관 후부 두 작은 뚜렷한 어두운 직사각형 구조 (otoliths)를 포함 하는 눈으로 확인할 수 있습니다.
6. Micromanipulation 컨트롤러를 사용 하는 바늘의 팁, 소포 내 (이 경우 otic 소포)에 대상 조직을 관통 하 고 picopump 발 스위치를 사용 하 여 미리 설정 된 볼륨을 주입.
   참고: 조직 침투를 저항 하는 경우 부드럽게 micromanipulation 컨트롤러 노브 도청 보십시오.
7. 배아를 출시, E3 표면 위쪽에서 전송 피 펫을 사용 하 여 아래쪽 또는 배아 주변 E3에 출시 되는 접시를 소용돌이 흐름.
8. MS-222 전송 피 펫을 사용 하 여 없이 e 3의 복구 접시에 배아를 전송.

9. 장치 이미징 PDMS를 사용 하 여 배아의 심사

1. 포트를 통해 흐르는 E3 (+ MS-222) 단계의 4.7 장치 프라임. 이 행 해질 수 있다 1000 µ L 피 펫 또는 좁은 팁 전송 피 펫을 사용 하 여.
2. 채워 잘 e 3 + MS-222 장치 덮여 때까지.
3. 잘 사용 하 여 각 전송 피 펫에 8.7 단계에서 4 삽입 된 배아를 제공 합니다. E3 + MS-222 (5.3 단계)를 로드 하기 전에 1-2 분 동안 배양 하 여 배아 미리 마 취 될 수 있습니다.
4. Micromanipulation 도구를 사용 하 여 (머리 루프 또는 이와 유사한), 동양 (꼬리 1 또는 머리-첫 번째, 사용 하는 장치에 따라), 원하는 방향으로 영상 채널의 입구에서 배아 및 장치 (그림 4A)에 부분적으로 그들을 밀어. 이 장치에 균등 하 게 그들을 그릴 데 도움이 됩니다.
5. 배아 채널 (그림 4B) 이미징에 대 한 올바른 방향으로 그려집니다 때까지 1000 µ L 피 펫 또는 전송 피 펫을 사용 하 여 포트에서 장치를 통해 E3를 그립니다.
   참고: 트래핑 지점 과거 배아를 빨 아 하지 않도록 주의 하십시오,이 배아를 손상 하 고 그들의 방향을 변경 합니다.
6. (그림 4C) 이미징을 위한 현미경을 잘 플레이트를 전송 합니다.
7. 이미지를 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여입니다.
   1. 적절 한 렌즈를 선택 하 여 확대를 조정 합니다. 10 배는 일반적으로 이미징 zebrafish 호 중구 마이그레이션에 대 한 유용한 확대.
   2. 각 신호는 분명, 하지만 하지 포화 되도록 광원 강도 및 각 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.
   3. 각 채널에 대 한 이미지를 캡처하십시오. 여기, 우리가 사용 하는 녹색 형광 단백질 (GFP, 예: 470/22, Em: 525/50), 텍사스 레드 (TxRed, 예: 585/29, Em: 628/32) 채널을 전송. 멀티 채널 이미지 후 처리 하는 동안 결합 될 수 있다 (그림 4B-I).

결과

여기서 설명 하는 접근은 (그림 1)의 설계 및 제조 2 dpf zebrafish, photolithographic (그림 2)와 소프트 리소 그래피 (그림 3) 기법을 사용 하 여 함께 사용 하기 위해 장치를 보여 줍니다. 이 방법을 사용 하면 많은 설계 반복 및 수정, 빠른 테스트 하 고 변경 및 개발의 다른 단계에서 제 브라와 함께 사용 하기 위해 ...

토론

여기, 우리는 사용 설명 장치 우리는 최근 2 dpf zebrafish microinjection의⁵, 촉진 하기 위하여 소개 하는 배아의 편리한 이미징에 대 한 간단한 agarose 무료 장착 장치 개발. 이러한 도구는 zebrafish 기법에 대 한 유용한 장치 제조를 위한 photolithographic 기술의 유틸리티를 강조 표시합니다.

우리는 발견 MSA 장치 특히 유용 세포 또는 입자의 주입을 위해 microinjection 바늘 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki