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要約

Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ ツールの範囲とインジェクションとイメージングのゼブラフィッシュの方向を提案します。

要約

ゼブラフィッシュは、大規模な遺伝的・化学的画面を通じて基本的な発生生物学にまたがるさまざまな疾患や実験的研究の増加の範囲のための便利なツールの強力なモデルとして浮上しています。しかし、多くの実験、特にこれらの感染症と異種移植モデルに関連はマイクロインジェクションや胚とスキルと専門知識を必要とする困難な技術である幼虫の画像に依存します。精度と現在のマイクロインジェクション技術のスループットを向上させるため前、腹側、背側、または横方向に向き、2 日間ポスト受精 (dpf) でゼブラフィッシュ胚を安定させる微細構造デバイスのシリーズを開発、プロシージャ。胚のイメージングを支援、またオリエントのガラス製カバー スリップに対して平行に横方向に 4 ゼブラフィッシュ チャンネル付きシンプルなデバイスを設計しました。一緒に、ここで紹介するツールは、ゼブラフィッシュ技術の最適化のための有用なデバイスを生成するフォトリソグラフィー アプローチの有効性を示しています。

概要

ゼブラフィッシュ遺伝子を大規模の根本的な発生生物学の研究から多くの分野で強力なモデルとして浮上しているし、化学スクリーン1,2。単一細胞の受精卵は、商業的、簡単・使いやすいの開発につながっているに遺伝物質のマイクロインジェクションに依存して遺伝子の過剰発現、ノックダウン、CRISPR/Cas9 変異、遺伝子導入などのルーチンの遺伝子操作定位と注入3卵の安定化に使用できるツール。移植と感染症などの他のアプローチは、後の段階の胚およびより大きいゲージ キャピラリー針4を使用して幼虫にマイクロインジェクションを必要があります。但しより大きいゲージの針を使用は、押すか、または胚を圧延することがなく標的組織に浸透するより困難だと重要な技術的な課題を示します。これらの条件の下でプロシージャの間に乾燥を避けることは難しい、胎児を安定させるために必要な適切な水分張力と胚を取得できない場合があります理想的な標的組織への注入を指向。

次の顕微注入、注入された胚初期時点の画像をキャプチャして選択する正常に挿入されていることを画面に便利です。これらの課題に対応するマイクロインジェクション5とイメージ ベースの迅速なスクリーニング後注入の両方のさまざまな方向に 2 の dpf 胚を安定させるのに役立ちます微細構造デバイスの範囲を開発しました。

これらのデバイスに十分な構造の解像度を得るためには、我々 は写真平版の技術を活用しました。よく最近マイクロ加工に外挿するマイクロ エレクトロニクス産業で使用される、これらのアプローチは 1 1,000 μ m、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の操作に最適なスケールに至る垂直構造を実現できます。安く、物理的に堅牢な生物学的に不活性で透明なポリジメチルシロキサン (PDMS) を使用してすべてのデバイスを作製しました。

微細加工表面のアレイ (MSAs) PDMS のパターン表面でのブロックとしてフォーマットされた、卵マイクロインジェクションをアガロース ブロックで簡単なチャンネルに似ています一般的に使用します。投与後検診 6 イメージング デバイスに標準ガラス底 6 ウェル プレートに配置できます。これらのデバイスは、胚のイージーローディング向け、アンロード ・ プロシージャは、便利なイメージ ベースの促進、特定胚の救助を可能にする間これらのデバイスよりもより使いやすい方法でスクリーニングのアプローチで作られた、ビービ研究室6。

プロトコル

幼虫の研究動物のケアに関するマサチューセッツ総合病院小委員会プロトコル 2011N000127 の下で承認されました。

1. デバイスの作製

注: すべてコンピューター支援図面 (CAD) ファイルここで説明フォトリソグラフィ マスクを設計するために使用 (図 1)、ダウンロード可能。リンクの材料表を参照してください。

  1. 標準写真平版の技術7を使用してクラス 1,000 のクリーン ルーム内マスター金型ウェハを作製します。組織アレイとチャンネルは、製造元の指示に従って 3 別のマスクを使用して 3 層の順番にエポキシ系ネガ型フォトレジストをパターン: 浅い機能 100 μ m、200 μ m の機能のため、400 μ m の深層の特徴。イメージング デバイスの 2 つのパターン層の浅い機能および深層の特徴の 600 μ m の 400 μ m を使用します。
  2. 15 cm (図 2) を鋳造用シャーレのベースに完成したウェハーをテープします。

2. 微細加工表面のアレイ - PDMS の準備

  1. 使用可能なデバイスを作る金型としてマスターのウエハーを用いたポリジメチルシロキサン (PDMS) をキャストします。イニシエーターの 5 g と 50 g の PDMS モノマーを組み合わせるし、プラスチック製のプラスチック フォークで皿の重さで徹底的にミックスします。
  2. 慎重に型に混合物を注ぐ。
  3. 1 h の 16-25 inHg (54-85 kPa) で真空デシケータでガスを抜き。
  4. PDMS を治すためには、少なくとも 3 時間は 65 ° C で焼きます。PDMS を企業が柔軟な固体を治す必要があります。
  5. 慎重にメス、メスの先端とウェーハ表面間の接触を維持するために必ずマスター基板上装置の周りカットします。鉗子を使用して、ウェハとクリーンの 10 cm シャーレ (図 3) を機能面への転送から PDMS レプリカの皮をむきます。
  6. 35 プラズマ オーブンを用いた酸素プラズマとデバイスを扱う s 疎水性を削減します。
  7. エチル 3-aminobenoate メタンスルホン酸 (MS-222、pH 7.5) 168 mg/L を添加したゼブラフィッシュ胚培地 (E3) でカバーします。転送ピペットを使用してデバイスの表面に水の流れることによって深い機能から任意の泡を削除します。

3. 微細加工表面のアレイ - アガロースの準備

  1. マイナスモールド PDMS をするためには、まず酸素プラズマによる PDMS デバイスを扱います。
  2. 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) シラン蒸気8不活性表面を作成すると PDMS デバイスを扱います。簡潔に。
    1. ヒューム フード内真空チャンバー内で扱われた機能側アップする PDMS を配置します。
    2. PDMS、横に小さなオープン ガラスやアルミ皿を置き、慎重に PFDTS の 200 μ L をピペット (98% シラン) 皿に。
      注意: PFDTS シラン揮発性の高い水と激しく反応する、可燃性があり、接触皮膚や眼の損傷を引き起こします。使用前に詳細に MSDS を参照。
    3. 真空チャンバーを閉じ、15-30 分または PFDTS シランが完全に蒸発するまで真空を適用します。
  3. ペトリ皿にデバイスを配置し、新鮮な PDMS、2.1 から 2.3 の手順で説明されている金型として使用します。
  4. 少なくとも 3 時間、65 ° C で焼く治療デバイスから新鮮な PDMS のレイヤー全体の皮をむくし、新鮮なペトリ皿に配置。その後、アガロースをキャストする否定的な金型として使用これができます。
  5. アガロースを準備するには、agarose が完全に溶解するまで低ゲル化温度の agarose E3 で電子レンジでの 2% 溶液を沸騰します。
  6. ホット アガロースを注ぐ PDMS マイナスモールドと転送ピペットと機能を流れる熱い agarose によってデバイスをカバー agarose 任意の泡を削除します。
  7. 泡を取り外したら、agarose を設定するのには 4 ° C で冷蔵庫で冷やします。
  8. 下から PDMS を手で変形によって負の PDMS 金型からアガロース ブロックを削除、新しいペトリ皿と MS 222 を含む E3 とウェットにアガロース ブロックを転送します。

4. PDMS イメージング デバイスの準備

  1. 使用可能なデバイスを作る金型としてマスターのウエハーを用いた PDMS をキャストします。(ステップ 2.1 で使用した同じ) イニシエーターとプラスチック製のプラスチック フォークで皿の重さを徹底的にミックスの 5 g と PDMS モノマーの 50 g を組み合わせます。
  2. 慎重に型に混合物を注ぐ。
  3. 1 h の 16-25 inHg (54-85 kPa) で真空デシケータでガスを抜き。
  4. PDMS を治すためには、少なくとも 3 時間は 65 ° C で焼きます。PDMS を企業が柔軟な固体を治す必要があります。
  5. マスターのウェハからデバイスを切り取って 1.5 mm パンチを使用してポートをパンチします。
  6. 治療デバイスと 6 ウェルのガラス底も 35 の酸素プラズマを用いたプレート s、2.6 の手順で説明されているようです。
  7. 10 分の 85 ° C のホット プレートにすることで 1 つデバイス機能を 6 ウェル プレートの各ガラス基盤を接着します。
    注: 成功した結合を確認するため、鉗子を用いた接合デバイスの 1 つの側面にしっかり圧力を適用されます。デバイスは、ガラス基板に接続されたままする必要があります。

5. ゼブラフィッシュ文化

  1. 3標準的な技術を使用して 2 の dpf に文化ゼブラフィッシュ胚。
  2. 鉗子または 1 mg/mL のプロテアーゼを用いた Dechorionate 胚ミックス (参照材料表)3まっすぐにそれらを許可するようにデバイスにロードする前に、少なくとも 30 〜 60 分。
  3. そのペトリ皿に、e3 (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) 25 X の 1 つの mL を追加して原液を用いた胚を anaesthetize します。

6. 微細構造面・ ディボット配列のゼブラフィッシュの向き

  1. それは胚を簡単に操作できるように、E3 の薄い (1-2 mm) 層で覆われているようなそのペトリ皿のステップ 2.7 (図 3 a) から PDMS ブロックを準備します。
  2. 転送ピペットを使用して PDMS ブロックの表面に必要な数 (通常 10-20 1 つの条件) の胚を転送します。
  3. マイクロマニピュレーション ツールを使用 (毛のループまたは類似)、胚を押し込みます (図 3 a) の微細構造の芝生。芝生の使用、背側と腹側の向きに特に適しています。
    注: より厳しいと芝生 (背側と腹側) に合わせて、ディボットに平行にブロックの表面に胚を位置決めし、毛のループを使用して位置にそれらを圧延します。それらを安定した保つを助ける、ディボットに深くそれらを押してします。

7. 微細表面 - ゼブラフィッシュの方向微細加工チャンネル

  1. E3 を PDMS ブロックで微細加工チャンネル (図 3 b) E3 のレベルを下回ると、ブロックの端は、PDMS の薄層、貯留層およびチャネルでまだ存在まで転送ピペットを使用してパターンを描画します。
  2. エッジをオーバーフローしないように注意して転送ピペットを用いた貯留層にステップ 5.3 から 10 の胚を転送します。
  3. 毛のループを使用して、適切なチャネルの入り口に漏斗にそれぞれの胚を操作し、よう、胚の頭は、チャネルとチャネルに入ると、胚は適切な方向に回転します。
  4. 場所で保つを助けるチャネル壁の方向づけの microfeatures に到達するまで、毛のループを使用してチャネルをそれぞれの胚をスライドさせます。横方向微細チャンネルの使用が特に推奨されます。
    注: 胚マイクロインジェクション中にスライディングを減らすためには、貯水池から E3 を描画することによって表面張力の量を調整してください。

8. ゼブラフィッシュのマイクロインジェクション

  1. マイクロインジェクション針を準備します。
    1. 前述4としてマイクロ ピペットの引き手を使用してホウケイ酸ガラス マイクロキャピ ラリー針を作る。結果針は、テーパ長さ約 10 mm の一方の端にポイントにテーパする必要があります。
    2. この場合 100 nM の走化性因子で注入されるべきソリューションを準備 (N-Formylmethionine-ロイシル-フェニルアラニン (fMLP) やロイコトリエン B4 (LTB4)) と 100 nM の PBS で 70 kDa ローダミン デキストラン トレーサー。
    3. 細かくテーパー ピペットを使用して針にソリューションの 5 μ L を読み込むヒント (材料表を参照してください)。
    4. マグネット スタンドにマウントされているし、picopump マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに針をマウントします。
  2. 鉗子でテーパーの先端をつまんで 45 ° の角度で針の先端を破る。
  3. 1 ボーラス注入サイズを調整する picopump コント ローラーで射出時間を調整することによって nL。
  4. マイクロインジェクション針の角度を調整します。針角 45 ° マイクロ コント ローラーには一般的に胚の長さに平行の針の良い出発点です。急な角度マイクロインジェクションの間に胚の横方向の動きを最小限に抑えるためのもの。
  5. 左の手でシャーレと権限を持つ針マニピュレーターを制御する、この場合は耳胞のインジェクションの目的のサイトにできるだけ近くに針をもたらします。
    注: 耳胞は 2 つ小さい異なる暗い楕円形の構造 (耳石) を含む目の後方の長方形の器官として識別できます。
  6. マイクロ コント ローラーを使用すると、針の先端が、小胞内になるように (この場合は耳胞) でターゲット組織を貫通し、picopump フット スイッチを使用してプリセット ボリュームを挿入します。
    注意: 組織の浸透に耐える場合、は、マイクロ コント ローラーのノブをやさしくタッピングみてください。
  7. 胚を解放するには、胚が周囲の E3 に解放されるように皿を旋回、上から転送ピペットを使用して下の表面で E3 はフローします。
  8. MS 222 転送ピペットを使用せず、E3 の回復料理に胚を転送します。

9. デバイスをイメージング PDMS を用いた胚のスクリーニング

  1. ポートを介して流れる E3 (+ MS 222) ステップ 4.7 からデバイスを首相します。これを行うことができます 1,000 μ L ピペットまたは狭ヒント転送ピペットを使用しています。
  2. デバイスが覆われるまでは、E3 + MS 222 井戸を埋めます。
  3. まあ転送ピペットを使用して各ステップ 8.7 から 4 注入された胚を提供します。胚は、E3 + MS 222 (ステップ 5.3) を読み込む前に 1 〜 2 分のために培養が必要な場合事前麻酔することができます。
  4. マイクロマニピュレーション ツールを使用 (毛のループまたは類似)、(尾最初または使用するデバイスに応じて先頭) 希望する方向の画像チャネルの入り口で胚の向き、デバイス (図 4 a) に部分的にそれらをプッシュします。均等にデバイスにそれらを描画に役立ちます。
  5. 胚はの画像 (図 4 b) の向きが正しいチャンネルに描画されるまで、1,000 μ L ピペットまたは転送ピペットを使用してポートからデバイスを介して E3 を描画します。
    注: 過去のトラップ ポイント胚を吸うように注意して、これは胚を損傷し、その向きを変更します。
  6. (図 4) をイメージングのための顕微鏡にもプレートを転送します。
  7. 倒立蛍光顕微鏡を使用してイメージ。
    1. 適切なレンズを選択することで倍率を調整します。10 X は通常ゼブラフィッシュ好中球移行のイメージングのための有用な倍率です。
    2. 各信号は明確なしかし、飽和していないように、光源強度と各チャンネル用の露光時間を調整します。
    3. 各チャンネルのイメージをキャプチャします。ここで、緑色蛍光タンパク質を使用 (GFP、Ex: 470/22 Em: 525/50)、テキサス赤 (TxRed、Ex: 585/29 Em: 628/32) チャンネルを送信します。ポスト処理中にマルチ チャンネル画像を組み合わせることができます (図 4 b-私)。

結果

ここで説明している方法は、デザイン (図 1) および 2 dpf ゼブラフィッシュ、フォトリソグラフィー (図 2) とソフト平版 (図 3) の技術を使用して使用デバイスの作製を示します。このメソッドを使用する多くの設計イテレーションおよび変更の迅速検査、変更および開発の他の段階でゼブラフィッシュ...

ディスカッション

ここに述べる使用デバイスの最近行った dpf ゼブラフィッシュ マイクロインジェクション52 を容易にし胚の便利な画像の単純な agarose フリー実装デバイスを導入します。これらのツールは、ゼブラフィッシュのテクニックの有用なデバイスの作製に写真平版の技術の有用性を強調表示します。

我々 MSA デバイス特に有用な発見した細胞や粒子の射出用マ...

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

著者は気前よく水槽スペースを提供するためデビッド Langenau を感謝したいです。エリック ・ ストーン、ジョン c. ムーア、秦唐は、ここで使用されるゼブラフィッシュ系統を調達のレナード ・ ゾンのラボからエリオット懸アン ・ ロバートソンと試薬、ゼブラフィッシュ メンテナンスを支援します。彼らはまたオクタビオ ウルタドのフォトリソグラフィー技術に関するアドバイスをありがとうしたいと思います。FE は、子供とアメリカのオーストラリア連合の Shriner の病院からの奨学金で賄われていた。この仕事 NIH によって資金が供給された GM92804 を付与します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth Adhsives184 SIL ELAST KIT 0.5KGFor casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agaroseSigma AldrichA9414-10GFor casting agarose devices
PFDTS silaneSigma Aldrich448931-10GFor casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)Sigma AldrichE10521-10GTo anesthetize zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 DaThermoFisherD1818To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)Cayman Chemicals20110Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)Sigma AldrichF3506-50MGNeutrophil chemoattractant
15 cm Petri dishFisher scientific08-757-148For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well platesMatTekP06G-0-20-FFor imaging devices
Borosilicate glass microcapillariesWorld Scientific InstrumentsTW-100-4For microinjection needles
Transfer pipettesSigma AldrichZ350796For transferring zebrafish embryos
Microloader tipsFisher scientificE5242956003For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punchTed Pella Inc.15111-15To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 ScalpelFine Science Tools10011-00For cutting PDMS
Dumont No. 5 ForcepsFine Science Tools11252-10For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser MicromanipulatorASIMM33-RFor manipulating microinjection needle
Magnetic standMSCSPI - 87242624For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controllerASIMPPI-3To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscopeThermoFisherEVOS FLTo image injected embryos
Dissecting microscopeNikonSMZ745For visualizing microinjecion
AutoCAD softwareAutodeskDownload AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki  

参考文献

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