Microstructurées dispositifs pour Microinjection optimisée et l’imagerie des larves de poisson zèbre

Résumé

Microinjection des embryons de poisson-zèbre et des larves est une technique cruciale mais difficile utilisée dans de nombreux modèles de poisson-zèbre. Nous présentons ici une gamme d’outils de micro-échelle pour aider à la stabilisation et l’orientation du poisson-zèbre pour microinjection et l’imagerie.

Résumé

Poisson zèbre sont apparus comme un puissant modèle de diverses maladies humaines et un outil utile pour un nombre croissant d’études expérimentales, s’étendant sur la biologie du développement fondamentale grâce aux grands écrans chimiques et génétiques. Cependant, beaucoup d’expériences, en particulier celles relatives à l’infection et des modèles de xénogreffes, dépendre de la microinjection et l’imagerie des embryons et des larves, qui sont laborieux techniques qui requièrent des compétences et l’expertise. Afin d’améliorer la précision et le débit des cours techniques de microinjection, nous avons développé une série de dispositifs microstructurées à orienter et à stabiliser les embryons de poisson-zèbre à 2 jours après la fécondation (dpf) en orientation ventrale, dorsale ou latérale avant le mode opératoire. Pour vous aider dans l’imagerie des embryons, nous avons également conçu un appareil simple avec les canaux qui orientent le poisson-zèbre 4 latéralement en parallèle contre une lamelle de verre. Ensemble, les outils que nous vous présentons ici démontrent l’efficacité des approches photolithographiques pour générer des dispositifs utiles pour l’optimisation des techniques de poisson-zèbre.

Introduction

Poisson zèbre ont émergé comme un puissant modèle pour beaucoup de domaines, des études fondamentales biologie du développement à grande échelle génétique et chimique écrans^1,2. Les manipulations génétiques courantes, telles que la surexpression du gène, précipitation, CRISPR/Cas9 mutagénèse et transgénèse dépendent de la microinjection de matériel génétique dans le zygote unicellulaire, qui a conduit au développement de simple, facile à utiliser, dans le commerce outils disponibles pour orienter et stabiliser les oeufs pour injection³. Autres approches, notamment la transplantation et l’infection, nécessitent souvent la microinjection dans plus tard stade embryons et des larves à l’aide de la plus grande jauge aiguilles capillaire⁴. Cependant, l’utilisation d’aiguilles de calibre plus gros présente des défis techniques importants, car il est plus difficile de pénétrer le tissu cible sans pousser ou rouler l’embryon. Dans ces conditions, obtenir la tension de l’eau approprié pour stabiliser l’embryon tout en évitant le séchage au cours de la procédure est difficile et les embryons peut-être être pas idéalement orienté pour injection dans le tissu cible.

Après microinjection, il est souvent utile dépister des embryons injectées pour sélectionner celles qui ont été injectés avec succès et de capturer des images de l’instant initial. Pour relever ces défis, nous avons développé une gamme d’appareils microstructurées qui aident à stabiliser les 2 embryons dpf dans différentes orientations pour microinjection⁵, ainsi que pour le dépistage rapide basé sur une image après l’injection.

Pour obtenir une résolution structurelle suffisante dans ces dispositifs, nous avons utilisé des techniques photolithographiques. Couramment utilisé dans les industries microélectroniques et plus récemment extrapolés à la fabrication de la microfluidique, ces approches peuvent atteindre les structures verticales allant de 1-1 000 µm, une échelle, bien adaptée à la manipulation des embryons de poisson-zèbre et des larves. Tous les appareils ont été fabriqués à l’aide de polydiméthylsiloxane (PDMS), ce qui est bon marché, physiquement robuste, biologiquement inerte et transparent.

Tableaux de surfaces microstructurées (MSAs) ont été mis en forme comme des blocs de PDMS avec une surface supérieure à motifs, analogue aux canaux simples dans les blocs d’agarose couramment utilisés pour le microinjection d’oeuf. Pour le dépistage après l’injection, 6 appareils d’imagerie peuvent être disposés dans un plat de 6 puits à fond de verre standard. Ces appareils sont conçus pour faciliter le chargement des embryons, alors que la procédure de déchargement permet idéalement sauvetage d’embryons spécifiques, facilitant l’imageur approches de dépistage d’une manière plus conviviale que ces dispositifs précédemment développé par le Beebe laboratoire⁶.

Protocole

Microinjection des larves a été approuvée par le sous-comité d’hôpital général Massachusetts sur recherche animalier sous protocole 2011N000127.

1. Fabrication de dispositifs

Remarque : Tous les assistée par ordinateur (CAD) fichiers de dessin utilisés pour la conception des masques de photolithographie décrites ici (Figure 1) sont disponibles en téléchargement. Voir Table des matières pour les liens.

1. Fabriquer la plaquette maître moule dans une salle blanche de classe 1 000 à l’aide de techniques photolithographiques standard⁷. Pour les tableaux de la microstructure et les canaux, mires de la résine photosensible négative axée sur l’époxy séquentiellement en 3 couches à l’aide de 3 masques séparés, selon les instructions du fabricant : 100 µm pour les fonctionnalités peu profondes, 200 µm pour les caractéristiques moyennes et 400 µm pour les caractéristiques profondes. Pour l’appareil d’imagerie, modèle deux couches à l’aide de 400 µm pour les fonctionnalités peu profondes et 600 µm pour les caractéristiques profondes.
2. Scotchez la gaufrette dûment remplie à la base d’un 15 cm boîte de Pétri pour effectuer le cast (Figure 2).

2. préparation des tableaux de surfaces microstructurées - PDMS

1. Pour fabriquer des dispositifs utilisables, cast polydiméthylsiloxane (PDMS), à l’aide de la plaquette maître comme un moule. Mélanger 50 g de monomère PDMS avec 5 g de l’initiateur et bien mélanger dans un plastique pesant plat avec une fourchette en plastique.
2. Versez le mélange soigneusement sur le moule.
3. Dégazer dans un dessiccateur à vide à 16-25 inHg (54-85 kPa) pendant 1 h.
4. Pour guérir le PDMS, cuire au four à 65 ° C pendant au moins 3 h. Le PDMS devrait guérir en solide ferme mais souple.
5. Découpez soigneusement autour de l’appareil sur la plaquette maître à l’aide d’un scalpel, en veillant à maintenir le contact entre la pointe du scalpel et la surface de gaufrette. À l’aide de pinces, éplucher la réplique PDMS loin de la plaquette et le transfert à un propre 10 cm boîte de Pétri, côté fonctionnalité haut (Figure 3).
6. Traiter l’appareil avec le plasma d’oxygène à l’aide d’un four à plasma pour 35 s pour réduire l’hydrophobicité.
7. Couvrir avec une moyenne d’embryon de poisson zèbre (E3) 168 mg/l de méthanesulfonate d’éthyle le 3-aminobenoate (MS-222, pH 7,5). Enlever toutes les bulles de caractéristiques plus profonds par l’écoulement de l’eau sur la surface de l’appareil à l’aide d’une pipette de transfert.

3. préparation des tableaux de surfaces microstructurées - Agarose

1. Pour faire un moule négatif de PDMS, tout d’abord traiter un dispositif PDMS avec le plasma d’oxygène.
2. Traiter l’appareil PDMS avec 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) vapeur de silane pour créer une surface inerte⁸. Brièvement :
   1. Placez le PDMS pour être traité fonctionnalité-côté-vers le haut dans une chambre à vide dans une hotte aspirante.
   2. À côté du PDMS, placez un petit plat en verre ou en aluminium ouvert, et soigneusement Pipeter 200 µL de PFDTS (silane de 98 %) dans le plat.
      ATTENTION : PFDTS silane est très volatil, réagit violemment avec l’eau, inflammable et cause de graves dommages de la peau et les yeux au contact. FS de lire en détail avant de l’utiliser.
   3. Fermer la chambre à vide et vide pendant 15-30 min, ou jusqu'à ce que le silane PFDTS disparaisse complètement.
3. Placez l’appareil dans une boîte de Pétri et utiliser comme un moule pour PDMS frais, préparé comme indiqué au point 2.1 à 2.3.
4. Cuire au four à 65 ° C pendant au moins 3 h, puis peler la couche entière de PDMS fraîches depuis le périphérique traité et placer dans un plat de Pétri fraîches. Cela peut alors servir un moule négatif pour effectuer un cast d’agarose.
5. Pour préparer un gel d’agarose, faire bouillir une solution de 2 % d’agarose gélifiant dans E3 température faible dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que l’agarose est entièrement dissous.
6. Versez l’agarose chaud sur la moule négatif de PDMS et éliminez les bulles dans le gel d’agarose couvrant l’appareil en agarose chaud qui coule sur les fonctionnalités avec une pipette de transfert.
7. Une fois que les bulles disparaissent, conserver au réfrigérateur à 4 ° C pour définir l’agarose.
8. Supprimez le bloc d’agarose du moule négatif de PDMS en se déformant les PDMS de dessous à la main, transvaser le bloc d’agarose dans une nouvelle boîte de Pétri et humide avec E3 contenant MS-222.

4. préparation du PDMS, dispositifs d’imagerie

1. Pour fabriquer des dispositifs utilisables, cast PDMS, en utilisant la plaquette maître comme un moule. Mélanger 50 g de monomère PDMS avec 5 g d’initiateur (même que celui utilisé à l’étape 2.1) et mélanger soigneusement dans un plastique pesant plat avec une fourchette en plastique.
2. Versez le mélange soigneusement sur le moule.
3. Dégazer dans un dessiccateur à vide à 16-25 inHg (54-85 kPa) pendant 1 h.
4. Pour guérir le PDMS, cuire au four à 65 ° C pendant au moins 3 h. Le PDMS devrait guérir en solide ferme mais souple.
5. Couper les appareils de la plaquette du Master et poinçonner des ports à l’aide d’un poinçon de 1,5 mm.
6. Traiter les appareils et un fond en verre 6 puits bien plate avec le plasma d’oxygène pour 35 s, comme indiqué au point 2.6.
7. Coller un dispositif caractéristique incliné à chaque lamelle de verre de la plaque 6 puits en le plaçant sur une plaque de cuisson 85 ° C pendant 10 min.
   Remarque : Pour confirmer une liaison réussie, appliquer une pression ferme sur le côté de l’appareil collé à l’aide de pinces. L’appareil doit rester attachée à la lamelle de verre.

5. Culture de poisson-zèbre

1. Embryons de poisson-zèbre culture à dpf 2 à l’aide de techniques standard³.
2. Les embryons de Dechorionate à l’aide de forceps ou 1 mg/mL de protéase mélangent (voir Table des matières)³ au moins 30 à 60 minutes avant le chargement de dispositif, pour leur permettre de redresser.
3. Anesthésier les embryons à l’aide de solution mère (168 mg/L) : MS-222 (pH 7.5) en ajoutant 1 mL de 25 X à l’E3 dans leur boîte de Pétri.

6. orientation du poisson-zèbre sur surfaces microstructurées - Divot tableaux

1. Préparer le bloc PDMS de l’étape 2.7 (Figure 3 a) dans sa boîte de Pétri, telle qu’elle est couverte par une couche mince (1-2 mm) de l’E3, ce qui permet une manipulation plus facile des embryons.
2. Transfert obligatoire nombre d’embryons (généralement 10 à 20 par État) sur la surface du bloc PDMS à l’aide d’une pipette de transfert.
3. À l’aide d’un outil de micromanipulation (boucle de cheveux ou similaire), poussez les embryons dans les mottes de gazon microstructurées (Figure 3 a). Utilisation des mottes de gazon est particulièrement adaptée aux orientations dorsale et ventrale.
   Remarque : Pour les mottes de gazon avec un resserrement fit (dorsale et ventrale), essayez les embryons de positionnement sur la surface du bloc en parallèle à la fourchettes et puis les rouler en position à l’aide d’une boucle de cheveux. Poussant plus profondément dans les fourchettes à gazon vont aidera à garder stable.

7. orientation du poisson-zèbre sur surfaces microstructurées - canaux microstructurés

1. Retirer le bloc PDMS à motifs avec chaînes microstructurées (Figure 3 b) à l’aide d’une pipette de transfert jusqu'à ce que le niveau de l’E3 descend en dessous du bord du bloc, mais est toujours présent dans le réservoir et les canaux et en couche mince sur le PDMS de E3.
2. Transférer 10 embryons d’étape 5.3 dans le réservoir à l’aide d’une pipette, en veillant à ne pas faire déborder les bords.
3. À l’aide d’une boucle de cheveux, manipuler chaque embryon dans l’entonnoir à l’entrée du canal approprié et orienter de telle sorte que la tête de l’embryon est vers le canal et l’embryon a l’orientation appropriée à son entrée dans le canal.
4. Glissez chaque embryon vers le bas de la chaîne à l’aide d’une boucle de cheveux jusqu'à ce qu’il atteigne l’orientation micro-caractéristiques dans les parois du canal qui aident à maintenir en place. Utilisation des canaux microstructurées est particulièrement recommandée pour l’orientation latérale.
   Remarque : Pour réduire l’embryon glisser durant la microinjection, essayez de régler le montant de la tension superficielle en puisant E3 dans le réservoir.

8. la microinjection de poisson-zèbre

1. Préparer les aiguilles de microinjection.
   1. Faites de verre borosilicaté microcapillaire aiguilles utilisant un micropipettes comme décrit précédemment⁴. Les aiguilles qui en résulte doivent être conique jusqu'à un point situé à une extrémité, avec une longueur conique d’environ 10 mm.
   2. Préparer la solution à doser, dans ce cas 100 nM chemoattractant (N-formylméthionine-leucyl-phénylalanine (fMLP) ou leukotriène B4 (LTB4)) et 100 nM de 70 kDa, traceur des dextran Rhodamine dans du PBS.
   3. Charger 5 µL de solution dans l’aiguille à l’aide d’une pipette finement effilée Astuce (voir table des matières).
   4. Monter l’aiguille dans un micromanipulateur monté sur un support magnétique et relié à un microinjector de picopump.
2. Briser la pointe de l’aiguille à un angle de 45 ° en pinçant l’extrémité effilée avec une pince.
3. Ajuster la taille d’un bolus injection 1 nL en réglant le temps d’injection sur le contrôleur de picopump.
4. Ajustez l’angle de l’aiguille de microinjection. Un angle de l’aiguille de 45 ° sur le contrôleur de micromanipulation est généralement un bon point de départ, avec l’aiguille parallèle à la longueur de l’embryon. Un angle plus raide peut être utilisé pour minimiser le mouvement latéral de l’embryon au cours de la microinjection.
5. Contrôle de la boîte de Pétri avec la main gauche et le micromanipulateur aiguille avec la droite, amener l’aiguille aussi près que possible au lieu prévu de microinjection, dans ce cas la vésicule otique.
   Remarque : La vésicule otique peut être identifiée comme l’orgue oblongue postérieure de le œil contenant deux petits sombres oblongues structures distinctes (otolithes).
6. En utilisant le contrôleur de micromanipulation, pénétrer le tissu cible (dans ce cas la vésicule otique) tel que la pointe de l’aiguille est dans la vésicule et injecter le volume prédéfini à l’aide de la pédale de commande picopump.
   Remarque : Si le tissu résiste à la pénétration, essayez tapotant doucement le bouton de contrôleur de micromanipulation.
7. Pour libérer les embryons, flux E3 sur toute la surface du haut vers le bas à l’aide d’une pipette de transfert, ou en agitant le plat tel que les embryons sont libérés dans l’E3 environnantes.
8. Transférer les embryons dans un plat de recouvrement de l’E3 sans MS-222, à l’aide d’une pipette de transfert.

9. sélection des embryons utilisant le PDMS dispositif d’imagerie

1. Amorcer le dispositif de l’étape 4.7 par écoulement E3 (+ MS-222) via le port. Cela peut être fait en utilisant une pipette 1 000 µL ou une pipette en pointe étroite.
2. Remplir le puits avec E3 + MS-222, jusqu'à ce que l’appareil est couvert.
3. Remettre les 4 embryons injectées d’étape 8,7 dans chaque bien en utilisant une pipette de transfert. Les embryons peuvent être anesthésiés avant si vous le souhaitez en incubant en E3 + MS-222 pendant 1-2 min avant le chargement (étape 5.3).
4. À l’aide d’un outil de micromanipulation (boucle de cheveux ou similaire), orienter les embryons à l’entrée des canaux d’imagerie dans l’orientation désirée (queue en premier ou tête la première, selon l’appareil utilisé) et poussez-les partiellement dans l’appareil (Figure 4 a). Cela aidera à attirer uniformément dans l’appareil.
5. Dessiner E3 à travers le dispositif du port à l’aide d’une pipette de µL 1 000 ou d’une pipette de transfert jusqu'à ce que les embryons sont entraînés dans les chaînes dans le bon sens d’imagerie (Figure 4 b).
   Remarque : Attention à ne pas sucer les embryons au-delà du point de piégeage, cela endommagera les embryons et modifier leur orientation.
6. Transfert de puits-plaque à microscope pour l’imagerie (Figure 4).
7. Image à l’aide d’un microscope inversé à fluorescent.
   1. Régler un grossissement en choisissant l’objectif approprié. 10 X est généralement un grossissement utile d’imagerie zebrafish migration neutrophiles.
   2. Ajuster l’intensité de la source lumineuse et la durée d’exposition pour chaque canal afin que chaque signal est clair, mais pas saturé.
   3. Capturer des images pour chaque canal. Ici, nous avons utilisé la protéine fluorescente verte (GFP, Ex : 470/22, Em : 525/50), Texas Red (TxRed, Ex : 585/29, Em : 628/32) et les canaux de transmission. Multicanal images peuvent être combinées au cours de post-traitement (Figure 4 b-I).

Résultats

L’approche décrite ici illustre la conception (Figure 1) et la fabrication de dispositifs à utiliser avec 2 dpf zebrafish, utilisant photolithographique (Figure 2) et techniques de soft-lithographiques (Figure 3). Cette méthode permet de tester rapidement de nombreuses itérations de conception et les modifications et altérations et optimisation des dimensions de la microstructure à utiliser a...

Discussion

Nous décrivons ici l’utilisation de périphériques, nous avons développé récemment pour faciliter 2 dpf zebrafish microinjection⁵et mettre en place un dispositif simple montage sans gel d’agarose pour l’imagerie commode d’embryons. Ces outils mettent en évidence l’utilité des techniques photolithographiques pour la fabrication de dispositifs utiles pour les techniques de poisson-zèbre.

Nous avons identifié les dispositifs MSA particulièrement utile p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184  Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize  zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki