أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

Summary

Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.

Abstract

وظهرت الزرد كنموذج قوي من مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان وأداة مفيدة لمجموعة متزايدة من الدراسات التجريبية، التي تغطي الأساسية علم الأحياء التنموي من خلال شاشات الجينية والكيميائية على نطاق واسع. ومع ذلك، العديد من التجارب، لا سيما تلك المتعلقة بالعدوى ونماذج إكسينوجرافت، وتعتمد على microinjection وتصوير الأجنة واليرقات، وهي تقنيات الشاقة التي تتطلب مهارة وخبرة. لتحسين الدقة والإنتاجية الحالية microinjection التقنيات، قمنا بتطوير سلسلة من الأجهزة ميكروستروكتوريد لتوجيه واستقرار الأجنة الزرد في 2 يوما بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) في اتجاه البطني أو الظهرية الجانبية قبل الإجراء. للمساعدة في تصوير الأجنة، صممنا أيضا جهاز بسيط مع القنوات التي توجه الزرد 4 أفقياً جنبا إلى جنب ضد زلة غطاء زجاج. معا، والأدوات التي نحن الحاضرين هنا تبين فعالية النهج فوتوليثوغرفيك لإنشاء الأجهزة مفيدة لتعظيم الاستفادة تقنيات الزرد.

Introduction

الزرد ظهرت كنموذج قوي للعديد من المجالات، من الدراسات الأساسية البيولوجيا التنموية على نطاق واسع الوراثية والكيميائية شاشات^1،2. التلاعبات الجينية الروتينية، مثل ترانسجينيسيس والطفرات كريسبر/Cas9، overexpression الجينات وضربه قاضية تعتمد على microinjection المواد الوراثية في اقحه خلية واحدة، مما أدى إلى وضع بسيطة وسهلة الاستخدام، تجارياً الأدوات المتاحة لتوجيه واستقرار البيض لحقن³. الطرق الأخرى، مثل زرع الأعضاء، والعدوى، غالباً ما تتطلب microinjection في وقت لاحق مرحلة الأجنة واليرقات باستخدام الإبر الشعرية قياس أكبر⁴. ومع ذلك، استخدام إبر قياس أكبر تحديات كبيرة التقنية، كما أنها أكثر صعوبة لاختراق الأنسجة المستهدفة دون دفع أو المتداول الجنين. في ظل هذه الظروف، قد لا يكون الحصول على التوتر المياه المناسبة المطلوبة لتثبيت الجنين في حين يصعب تفادي التجفيف أثناء الإجراء، والأجنة المنحى المثالي لحقن الأنسجة المستهدفة.

بعد microinjection، يكون من المفيد غالباً الشاشة حقن الأجنة لتحديد تلك التي قد تم حقنه بنجاح، والتقاط الصور للمرة الأولى النقطة. لمواجهة هذه التحديات، قمنا بتطوير مجموعة من الأجهزة ميكروستروكتوريد التي تساعد على استقرار 2 من الأجنة إدارة الشرطة الاتحادية في التوجهات المختلفة سواء microinjection⁵، وللفرز السريع القائم على الصورة بعد الحقن.

للحصول على قرار الهيكلية الكافية في هذه الأجهزة، ونحن تستخدم تقنيات فوتوليثوغرفيك. يشيع استخدامها في الصناعات الإلكترونية الدقيقة وأكثر مؤخرا باستقراء لتلفيق موائع جزيئية، يمكن تحقيق هذه النهج الهياكل العمودية تتراوح بين 1-1,000 ميكرون، نطاق مناسب تماما للتلاعب بالأجنة الزرد واليرقات. كانت ملفقة كافة الأجهزة باستخدام بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، ورخيصة وقوية جسديا وبيولوجيا الخاملة وشفافة.

ميكروستروكتوريد صفائف السطحية (MSAs) تم تنسيقها ككتل PDMS مع سطح العلوي منقوشة، مماثلة لقنوات بسيطة في كتل [اغروس] شائع الاستخدام microinjection البيض. لفحص ما بعد الحقن، يمكن صفت 6 أجهزة تصوير في لوحة 6-جيدا زجاجية قياسية. صممت هذه الأجهزة لتحميل سهل للأجنة، بينما مريح يسمح الإجراء تفريغ إنقاذ الأجنة محددة، تيسير المستندة إلى الصور فحص النهج بطريقة أكثر سهولة من تلك الأجهزة وضعت سابقا مختبر بيب⁶.

Protocol

وأقر microinjection يرقات "ماساشوستس العام مستشفى اللجنة الفرعية" المعنية "أبحاث رعاية الحيوان" تحت بروتوكول 2011N000127.

1. تصنيع الجهاز

ملاحظة: جميع بمساعدة الكمبيوتر (CAD) ملفات الرسم المستخدمة لتصميم الأقنعة التصويرية الموصوفة هنا (الشكل 1) متوفرة للتحميل. انظر "الجدول للمواد" للروابط.

1. اختﻻق يفر العفن الرئيسي في غرفة نظيفة 1,000 فئة باستخدام التقنيات القياسية فوتوليثوغرفيك⁷. للمصفوفات المجهرية وقنوات، نمط مقاوم الضوء السلبية على أساس الإيبوكسي التتابع في 3 طبقات باستخدام أقنعة منفصلة 3، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة: 100 ميكرومتر للميزات الضحلة و 200 ميكرومتر ميزات متوسطة 400 ميكرون ل ميزات العميق. لجهاز التصوير، طبقات النمط الثاني باستخدام 400 ميكرون للميزات الضحلة و 600 ميكرون للميزات العميق.
2. الشريط يفر المكتملة إلى قاعدة 15 سم طبق بيتري الصب (الشكل 2).

2-إعداد المصفوفات السطحية ميكروستروكتوريد-PDMS

1. لجعل الأجهزة صالحة للاستعمال، ويلقي بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، باستخدام رقاقة رئيسية كالعفن. الجمع بين 50 جرام مونومر PDMS مع 5 غ بادئ ومزيج دقيق في بلاستيك وزنها الطبق مع شوكة بلاستيكية.
2. صب الخليط بعناية أكثر من العفن.
3. ديغا في مجفف فراغ في إينهج 16-25 (54-85 كيلو باسكال) ح 1.
4. لعلاج PDMS، خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح. ينبغي علاج PDMS إلى مادة صلبة ثابتة ولكنها مرنة.
5. قص بعناية حول الجهاز على رقاقة رئيسية باستخدام مشرط، مع التأكد من الحفاظ على الاتصال بين طرف دون مشرط والسطح ويفر. استخدام الملقط، قشر النسخة المتماثلة PDMS بعيداً عن ويفر، ونقل إلى سم 10 نظيفة طبق بيتري، ميزة الجانب الأعلى (الشكل 3).
6. التعامل مع الجهاز بالبلازما الأكسجين باستخدام فرن بلازما مقابل 35 ثانية للحد من هيدروفوبيسيتي.
7. تغطية مع الزرد الجنين المتوسطة (E3) الذي يحتوي على 168 مغ/لتر من إيثيل 3-أمينوبينواتي ميثانيسولفوناتي (مرض التصلب العصبي المتعدد-222، الرقم الهيدروجيني 7.5). إزالة أي فقاعات من أعمق من الميزات التي تتدفق المياه عبر سطح الجهاز باستخدام ماصة نقل.

3-إعداد المصفوفات السطحية ميكروستروكتوريد-[اغروس]

1. جعل العفن PDMS سلبية، أول علاج جهاز PDMS مع الأكسجين في البلازما.
2. علاج الجهاز PDMS مع 1ح، 1ح، 2ح،ح2-بيرفلوروكتيلتريثوكسيسيلاني (بفدتس) سيلاني البخار لإنشاء سطح خامل⁸. باختصار:
   1. ضع PDMS أن تكون ميزة-الجانب-متابعة المعالجة في فراغ غرفة داخل غطاء دخان.
   2. بجوار PDMS، ضع طبق الزجاج أو الألومنيوم مفتوحة صغيرة، وعناية "الماصة؛" 200 ميليلتر من بفدتس (silane 98 ٪) في الطبق.
      تنبيه: silane بفدتس هو درجة عالية من التقلب، وعنف ويتفاعل مع الماء، القابلة للاشتعال، ويسبب أضرارا بالغة في العين والجلد على الاتصال. قراءة العظمية بالتفصيل قبل الاستخدام.
   3. إغلاق الدائرة فراغ وتطبيق فراغ لمدة 15-30 دقيقة، أو حتى يتبخر silane بفدتس تماما.
3. ضع الجهاز في طبق بتري واستخدامه كقالب ل PDMS الطازجة، إعداد كما هو موضح في الخطوة 2، 2، 1-3.
4. خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح، ثم قشر الطبقة بأكملها من PDMS جديدة من جهاز المعالجة ووضع في طبق بتري طازجة. وهذا يمكن ثم استخدامها كالعفن سلبية يلقي [اغروس].
5. إعداد [اغروس]، غلى حل 2% لانخفاض مجمد درجة الحرارة [اغروس] في E3 في فرن ميكروويف حتى يذوب تماما [اغروس].
6. صب [اغروس] الساخنة على القالب PDMS السلبية وإزالة أي فقاعات في [اغروس] تغطي الجهاز قبل [اغروس] الساخن يتدفق أكثر الميزات مع ماصة نقل.
7. حالما تتم إزالة فقاعات، الثلاجة عند درجة 4 مئوية لتعيين [اغروس].
8. إزالة الكتلة [اغروس] من العفن PDMS السلبية بتشويه PDMS من تحت من جهة، ونقل الكتلة [اغروس] إلى طبق بتري الجديدة، والرطب مع E3 التي تحتوي على مرض التصلب العصبي المتعدد-222.

4-إعداد PDMS أجهزة تصوير

1. لجعل الأجهزة قابلة للاستخدام، يلقي PDMS، استخدام رقاقة رئيسية كقالب. الجمع بين 50 جرام مونومر PDMS مع 5 غ من البادئ (نفس المستخدمة في الخطوة 2، 1) ومزيج دقيق في بلاستيك وزنها الطبق مع شوكة بلاستيكية.
2. صب الخليط بعناية أكثر من العفن.
3. ديغا في مجفف فراغ في إينهج 16-25 (54-85 كيلو باسكال) ح 1.
4. لعلاج PDMS، خبز عند 65 درجة مئوية على الأقل 3 ح. ينبغي علاج PDMS إلى مادة صلبة ثابتة ولكنها مرنة.
5. قطع الأجهزة من يفر الرئيسي ولكمه على منافذ باستخدام لكمه 1.5 مم.
6. علاج الأجهزة وزجاج 6-جيدا-قاع لوحة جيدا مع الأكسجين في البلازما ل 35 s، كما هو موضح في الخطوة 2، 6.
7. السندات واحد الجهاز ميزة الجانب-لأسفل لكل ساترة زجاج لوحة 6-جيدا بوضعه في هوتبلت 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: لتأكيد الترابط الناجح، تطبيق الضغط الثابت إلى جانب واحد من الجهاز المرتهن باستخدام الملقط. ينبغي أن يظل الجهاز المرفقة إلى ساترة زجاجية.

5-الزرد الثقافة

1. الثقافة الزرد الأجنة إلى 2 إدارة الشرطة الاتحادية باستخدام التقنيات القياسية³.
2. مزيج الأجنة ديتشوريوناتي استخدام الملقط أو 1 مغ/مل مبطلات (انظر الجدول المواد)³ على الأقل 30-60 دقيقة قبل تحميلها على الجهاز، للسماح لهم بتصويب.
3. تخدير الأجنة استخدام الحل (168 مغ/لتر) مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (درجة الحموضة 7.5) بإضافة 1 مل 25 X الأسهم إلى E3 في طبق بتري بهم.

6-توجه الزرد على سطح ميكروستروكتوريد-صفائف ديفت

1. إعداد كتلة PDMS من الخطوة 2.7 (الشكل 3A) في طبق بتري به أن كان مغطى بطبقة رقيقة (1-2 مم) من E3، مما يتيح سهولة التلاعب بالأجنة.
2. نقل العدد المطلوب من الأجنة (عادة 10-20 كل الظروف) على سطح كتلة PDMS استخدام ماصة نقل.
3. باستخدام أداة ميكرومانيبوليشن (حلقة الشعر أو ما شابه ذلك)، دفع الأجنة في ديفوتس ميكروستروكتوريد (الشكل 3A). استخدام ديفوتس مناسبة خاصة لتوجهات الظهرية والبطني.
   ملاحظة: ديفوتس مع أشد تناسب (الظهري والبطني)، حاول الأجنة لتحديد المواقع على سطح الكتلة بالتوازي مع ديفت، والمتداول ثم منها إلى موضع استخدام حلقة شعر. دفعهم أعمق في ديفوت ستساعد على إبقائها مستقرة.

7-توجه الزرد على سطح ميكروستروكتوريد-قنوات ميكروستروكتوريد

1. رسم E3 قبالة كتلة PDMS منقوشة مع قنوات ميكروستروكتوريد (الشكل 3B) باستخدام ماصة نقل حتى مستوى E3 يسقط تحت حافة الكتلة، ولكن لا تزال موجودة في الخزان والقنوات وفي طبقة رقيقة على PDMS.
2. نقل الأجنة 10 من الخطوة 5.3 إلى الخزان باستخدام ماصة نقل، مع الحرص على عدم تجاوز الحواف.
3. استخدام حلقة شعر، التعامل مع كل جنين إلى القمع عند مدخل القناة الملائمة وتوجيه رأس الجنين اتجاه القناة والجنين بالاتجاه المناسب لأنه يدخل القناة.
4. حرك كل الجنين إلى أسفل القناة باستخدام حلقة شعر حتى تصل إلى ميكروفيتوريس توجه في جدران القناة التي تساعد على الاحتفاظ به في مكان. يوصي باستخدام القنوات ميكروستروكتوريد خاصة للاتجاه الأفقي.
   ملاحظة: للحد من انزلاق أثناء microinjection الجنين، حاول ضبط مقدار التوتر السطحي بالرسم E3 من الخزان.

8-microinjection الزرد

1. إعداد إبرة microinjection.
   1. جعل الإبر ميكروكابيلاري البورسليكات الزجاج باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي كما هو موضح سابقا⁴. ينبغي مدبب الإبر الناتجة إلى نقطة نهاية واحدة، تفتق طولها حوالي 10 مم.
   2. إعداد الحل بالحقن، في هذه الحالة 100 نانومتر chemoattractant (N-فورميلميثيونيني-لوسيل-فينيلالاناين (فملب) أو Leukotriene B4 (LTB4)) و 100 نانومتر من 70 كاتشين والرودامين ديكستران الراسم في برنامج تلفزيوني.
   3. تحميل 5 ميليلتر من الحل في إبرة ماصة مدبب ناعما استخدام تلميح (انظر الجدول المواد).
   4. جبل الإبرة في ميكرومانيبولاتور التي شنت على الوقوف مغناطيسية ومتصلا ميكروينجيكتور بيكوبومب.
2. كسر غيض الإبرة بزاوية 45 درجة معسر طرف مدبب مع الملقط.
3. ضبط حجم بلعه حقن 1 nL بضبط الوقت الحقن على وحدة تحكم بيكوبومب.
4. قم بضبط زاوية إبرة microinjection. عموما بإبرة زاوية 45 ° على وحدة تحكم ميكرومانيبوليشن نقطة انطلاق جيدة، مع الإبرة موازية لطول الجنين. يمكن استخدام زاوية انحدارا لتقليل الحركة الجانبية للجنين أثناء microinjection.
5. السيطرة على طبق بيتري مع اليد اليسرى وميكرومانيبولاتور إبرة مع الحق، جلب الإبرة أقرب قدر الإمكان إلى الموقع المقصود من microinjection، في هذه الحالة حويصلة عتيق.
   ملاحظة: يمكن تحديد حويصلة عتيق هيئة مستطيل الخلفي للعين التي تحتوي على أصغر متميزة الظلام مستطيل هيكلين (أوتوليثس).
6. باستخدام وحدة تحكم ميكرومانيبوليشن، اختراق الأنسجة المستهدفة (في هذه الحالة حويصلة عتيق) يكون طرف الإبرة داخل حويصلة، وحقن وحدة التخزين مسبقاً باستخدام رمز التبديل بيكوبومب سيرا على الأقدام.
   ملاحظة: إذا كان النسيج يقاوم الاختراق، حاول بلطف التنصت على مقبض تحكم ميكرومانيبوليشن.
7. للإفراج عن الأجنة، تدفق E3 على السطح من أعلى إلى أسفل باستخدام ماصة نقل، أو بواسطة يحوم الطبق مثل أن يتم الإفراج عن الأجنة في E3 المحيطة بها.
8. نقل الأجنة إلى طبق انتعاش من E3 دون استخدام ماصة نقل مرض التصلب العصبي المتعدد-222.

9-فحص أجنة PDMS جهاز التصوير باستخدام

1. رئيس الجهاز من الخطوة 4.7 تتدفق E3 (+ مرض التصلب العصبي المتعدد-222) عن طريق المنفذ. هذا يمكن أن يتم استخدام ماصة ميليلتر 1,000 أو ماصة نقل تلميح ضيق.
2. سد البئر مع E3 + مرض التصلب العصبي المتعدد-222 حتى يتم تغطية الجهاز.
3. تسليم 4 حقن الأجنة من الخطوة 8.7 في كل جيدا باستخدام ماصة نقل. يمكن أن تكون الأجنة قبل أنيسثيتيزيد إذا رغبت بحضانة في E3 + مرض التصلب العصبي المتعدد-222 لمدة 1-2 دقيقة قبل تحميل (الخطوة 5، 3).
4. باستخدام أداة ميكرومانيبوليشن (حلقة الشعر أو ما شابه ذلك)، وتوجيه الأجنة عند مداخل القنوات التصوير في الاتجاه المطلوب (الذيل الأول أو رئيس--أولاً، اعتماداً على الجهاز المستخدم)، ودفعهم جزئيا إلى الجهاز (الشكل 4 أ). هذا سوف يساعد في رسم لهم في الجهاز بالتساوي.
5. رسم E3 من خلال الجهاز من المنفذ باستخدام 1,000 ميليلتر ماصة أو ماصة نقل حتى يتم رسمها الأجنة في القنوات في التوجه الصحيح للتصوير (الشكل 4 باء).
   ملاحظة: كن حذراً حتى لا تمتص الأجنة في الماضي هذه النقطة الملائمة، وهذا سوف يضر الأجنة وتغيير اتجاهها.
6. نقل لوحة جيدا بالمجهر للتصوير (الشكل 4).
7. صورة باستخدام مجهر فلوري مقلوب.
   1. ضبط التكبير عن طريق اختيار العدسة المناسبة. 10 X عادة تكبير مفيدة للتصوير الزرد هجرة العَدلات.
   2. ضبط كثافة مصدر الضوء ووقت التعرض لكل قناة حيث يكون كل إشارة واضحة، ولكن غير المشبعة.
   3. التقاط صور لكل قناة. هنا، يمكننا استخدام البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء، السابقين: م 470/22،: 525/50)، "تكساس الأحمر" (تكسريد، السابقين: 585/29، م: 628/32) وأحال القنوات. ويمكن الجمع بين الصور الأقنية خلال مرحلة ما بعد المعالجة (الشكل 4 باء--أنا).

النتائج

النهج المذكور هنا يدل على التصميم (الشكل 1) وتصنيع الأجهزة للاستخدام مع 2 إدارة الشرطة الاتحادية الزرد، استخدام تقنيات (الشكل 3) لينة معدني وفوتوليثوغرفيك (الشكل 2). يسمح هذا الأسلوب لاختبار السريع العديد من التكرارات التصمي...

Discussion

هنا، يمكننا وصف الاستخدام الأجهزة وضعنا مؤخرا تيسير إدارة الشرطة الاتحادية 2 الزرد microinjection⁵، وإدخال جهاز بسيط تركيب مجاناً [اغروس] لتصوير مريحة للأجنة. وتبرز هذه الأدوات الأداة المساعدة فوتوليثوغرفيك تقنيات تصنيع الأجهزة مفيدة لتقنيات الزرد.

أننا وجدنا الأجه?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki