Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Summary

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Abstract

דג זברה הופיעו כמודל עוצמה של מחלות אנושיות שונות, כלי שימושי עבור טווח גדל והולך של מחקרים ניסיוניים, פורש יסוד ביולוגיה התפתחותית דרך מסכי גנטי וכימיים בקנה מידה גדול. עם זאת, ניסויים רבים, במיוחד אלה הקשורים לזיהום, מודלים xenograft, לסמוך על microinjection הדמיה של עוברי וזחלים, אשר מפרך טכניקות הדורשות מיומנות ומומחיות. כדי לשפר את הדיוק ואת התפוקה של טכניקות microinjection הנוכחי, פיתחנו סדרה של התקנים microstructured אוריינט ולייצב את העוברים דג זברה-2 ימים שלאחר ההפריה (dpf) בכיוון הגחון, הגבי או לרוחב לפני נוהל. כדי לסייע ההדמיה של העוברים, עיצבנו גם מכשיר פשוט עם ערוצים אוריינט דג זברה 4 רוחבית במקביל נגד החלקה כיסוי זכוכית. יחד, בכלים אותם אנו מציגים כאן להדגים את היעילות של גישות photolithographic כדי ליצור התקנים שימושי עבור אופטימיזציה של טכניקות דג זברה.

Introduction

דג זברה הופיעו כמודל עוצמה עבור שדות רבים, מחקרים של יסוד ביולוגיה התפתחותית כדי בקנה מידה גדול גנטי, כימית מסכי^1,2. שינויים גנטיים שגרתיות, כגון ביטוי גנים, נוקאאוט, מוטגנזה מכוונת CRISPR/Cas9 transgenesis לסמוך על microinjection של חומר גנטי לתוך הזיגוטה מתא בודד, אשר הובילה להתפתחות של פשוט, קל לשימוש, מסחרית כלים זמינים עבור המכוונת וייצוב ביצים הזרקת³. גישות אחרות, כגון השתלת זיהום, דורשים לעיתים קרובות microinjection לתוך העוברים בשלב מאוחר יותר, הזחלים באמצעות מד גדול מחטים נימי⁴. עם זאת, השימוש מחטים מד גדול מציג אתגרים טכניים משמעותיים, כמו זה יותר קשה לחדור את רקמת המטרה בלי לדחוף או מגלגלים את העובר. בתנאים אלה, קבלת מתח מים המתאים הנדרש כדי לייצב את העובר תוך הימנעות ייבוש במהלך ההליך קשה, העוברים לא יכול להיות אידיאלי אוריינטציה להזרקה לתוך רקמת המטרה.

בעקבות microinjection, הוא לעיתים קרובות שימושי למסך עוברי מוזרק סמן הוזרק בהצלחה, וכדי ללכוד תמונות של נקודת הזמן הראשוני. לטפל באתגרים אלה, פיתחנו מגוון של מכשירים microstructured המסייעים לייצב את העוברים dpf 2 הכיוונים השונים הן עבור microinjection⁵, והן עבור מיון המבוסס על תמונות מהיר שלאחר ההזרקה.

כדי להשיג רזולוציה מבנית מספיק במכשירים האלה, אנחנו מנוצל טכניקות photolithographic. נפוץ תעשיות מיקרו-אלקטרוניים ועוד אקסטרפולציה לאחרונה microfluidic פבריקציה נוספת, גישות אלה ניתן להשיג מבנים אנכיים הנע בין 1-1, 000 מיקרומטר, בקנה מידה המתאימה מניפולציה של דג זברה עוברי וזחלים. כל ההתקנים הללו זוייפו באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS), שהינו זול חזקים פיזית, אינרטי מבחינה ביולוגית, שקוף.

מערכים משטח microstructured (שימי) שעוצבו כבלוקים של PDMS עם משטח עליון בדוגמת, מקביל הערוצים פשוט בבלוקים agarose הנפוץ עבור הביצה microinjection. להקרנה שלאחר ההזרקה, 6 התקני הדמיה יכול להיות ערוכים תת 6-ובכן צלחת רגילה. התקנים אלה מיועדים לטעינה קלה של העוברים, בעוד ההליך לפריקת בנוחות מאפשר חילוץ העובר ספציפיים, הקלת מבוססת תמונה הקרנת גישות בצורה יותר ידידותית למשתמש מאשר התקנים אלה שפותחו בעבר על ידי ביב מעבדה⁶.

Protocol

Microinjection של הזחלים אושרה על ידי הוועדה חולים כללי מסצ'וסטס-אכפת לי חיה מחקר תחת פרוטוקול 2011N000127.

1. התקן פבריקציה נוספת

הערה: כל בסיוע מחשב (CAD) קבצי ציור המשמש עיצוב מסכות פוטוליתוגרפיה המתוארים כאן (איור 1) זמינים להורדה. ראה טבלה של חומרים עבור קישורים.

1. לפברק כשהפחד מאסטר עובש בחדר נקי Class 1,000 באמצעות טכניקות photolithographic סטנדרטי⁷. עבור מערכים מיקרו ו ערוצים, דפוס את photoresist על בסיס אפוקסי שלילי ברצף ב 3 שכבות באמצעות 3 מסכות נפרדים, בהתאם להוראות היצרן: 100 מיקרומטר עבור התכונות רדוד, מיקרומטר 200 עבור התכונות בינונית ו- 400 מיקרומטר עבור התכונות עמוק. עבור התקן הדמיה, דוגמת שתי שכבות באמצעות מיקרומטר 400 עבור התכונות רדוד מיקרומטר 600 עבור התכונות עמוק.
2. קלטת כשהפחד שהושלמו לבסיס של 15 ס מ פטרי ליציקת (איור 2).

2. הכנת מערכי משטח Microstructured - PDMS

1. כדי להפוך התקנים שמיש, יצוק polydimethylsiloxane (PDMS), באמצעות כשהפחד מאסטר כתבנית. לשלב 50 גרם של מונומר PDMS עם 5 g של היוזם, מערבבים ביסודיות פלסטיק במשקל צלחת עם מזלג מפלסטיק.
2. שופכים את התערובת בזהירות מעל העובש.
3. דגה, desiccator ואקום ב- 16-25-inHg (54-85 kPa) לשעה.
4. . כדי לרפא את PDMS, אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות. PDMS צריך לרפא למצב מוצק תקיף אך גמיש.
5. חותכים בזהירות מסביב למכשיר על כשהפחד הראשי באמצעות אזמל, מקפיד לשמור על קשר בין קצה האזמל השטח וופל. באמצעות מלקחיים, לקלף את העותק המשוכפל של PDMS מחוץ ופלה העברת נקי 10 ס מ פטרי, תכונה בצד (איור 3).
6. לטפל המכשיר עם פלזמה חמצן באמצעות תנור פלזמה עבור 35 s כדי להפחית את hydrophobicity.
7. מכסים עם דג זברה העובר בינוני (E3) המכיל 168 מ ג/ליטר של אתיל methanesulfonate 3-aminobenoate (MS-222, pH 7.5). הסרה של בועות מתכונות עמוק יותר על-ידי זרימת מים על פני השטח של המכשיר באמצעות פיפטה של העברה.

3. הכנת מערכי משטח Microstructured - Agarose

1. כדי להפוך את תבנית PDMS שלילי, קודם לטפל מכשיר PDMS עם חמצן פלזמה.
2. פנקו את המכשיר PDMS עם 1H, 1H, 2H, 2Hכדי ליצור משטח אינרטי⁸אדי silane - Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS). בקצרה:
   1. מניחים את PDMS להיות מטופלים תכונה-צד-up בתוך תא ואקום בתוך ברדס fume.
   2. ליד PDMS, מקום קטן פתוח זכוכית או אלומיניום תבשיל, בזהירות פיפטה 200 µL של PFDTS (98% silane) לתוך קערה.
      התראה: PFDTS silane הוא הפכפך מאוד, מגיב באלימות עם מים, דליק, גורמת נזקים חמורים העור והעין על קשר. MSDS לקריאה בהרחבה לפני השימוש.
   3. לסגור את תא ואקום ולהחיל ואקום למשך 15-30 דקות, או עד silane PFDTS הוא התאדו לגמרי.
3. הכנס את ההתקן צלחת פטרי, להשתמש כתבנית עבור PDMS טריים, המוכנים כפי שמתואר בשלב 2.1-2.3.
4. אופים ב- 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות, ולאחר מכן לקלף את כל השכבה של טרי PDMS מהמכשיר שטופלו ומניחים בצלחת פטרי טריים. זה יכול לשמש לאחר מכן כתבנית שלילי להטיל agarose.
5. כדי להכין agarose, מרתיחים פתרון 2% של נמוך ג'לי טמפרטורה agarose ב E3 במיקרוגל עד התפרקה לחלוטין agarose.
6. שופכים את agarose חם כייר שלילי PDMS, להסיר את כל הבועות ב agarose המכסה את המכשיר על-ידי agarose חם זורם מעל תכונות בעלות פיפטה העברה.
7. ברגע בועות יוסרו, להכניס למקרר ב 4 ° C כדי להגדיר את agarose.
8. להסיר את הבלוק agarose כייר PDMS שליליים על ידי עיוות את PDMS מ מתחת בעבודת יד, להעביר את גוש agarose חדש צלחת פטרי, ו רטוב עם E3 המכיל MS-222.

4. הכנת PDMS התקני הדמיה

1. כדי להפוך התקנים שמיש, יצוק PDMS, באמצעות כשהפחד מאסטר כתבנית. לשלב 50 גרם של מונומר PDMS עם 5 g של יוזם (כמו בשימוש בשלב 2.1), לערבב ביסודיות ב פלסטיק במשקל צלחת עם מזלג מפלסטיק.
2. שופכים את התערובת בזהירות מעל העובש.
3. דגה, desiccator ואקום ב- 16-25-inHg (54-85 kPa) לשעה.
4. . כדי לרפא את PDMS, אופים ב 65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות. PDMS צריך לרפא למצב מוצק תקיף אך גמיש.
5. לחתוך את ההתקנים מ כשהפחד מאסטר, אגרוף יציאות באמצעות אגרוף 1.5 מ מ.
6. פינוק המכשירים ו 6-ובכן זכוכית-תחתון טוב צלחת עם חמצן פלזמה עבור 35 s, כפי שמתואר בשלב 2.6.
7. בונד אחד התקן תכונה לצד השני על כל coverslip זכוכית של צלחת 6-טוב על-ידי הצבתו על פלטה 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: כדי לאשר התקשרות מוצלחת, החל בלחץ חזק לצד אחד של המכשיר בונדד באמצעות מלקחיים. המכשיר צריכים להישאר קשור coverslip זכוכית.

5. דג זברה תרבות

1. תרבות עוברי דג זברה כדי dpf 2 באמצעות טכניקות רגיל³.
2. Dechorionate עוברי באמצעות מלקחיים או 1 מ"ג/מ"ל, פרוטאז מערבבים (ראה טבלת חומרים)³ לפחות 30-60 דקות לפני טעינה להתקן, כדי לאפשר להם ליישר.
3. להרדים עוברי באמצעות פתרון מניות (168 מ ג/ליטר) MS-222 (pH 7.5) על-ידי הוספת 1 מ"ל של 25 X E3 ב שלהם צלחת פטרי.

6. הכיוון של דג זברה על השטח Microstructured - מערכים דיבוט

1. להכין את הרחוב PDMS צעד 2.7 (איור 3A) של צלחת פטרי כזה כי הוא מכוסה על ידי שכבה (1-2 מ מ עובי) של E3, שמאפשר מניפולציה קל של העוברים.
2. להעביר את המספר הנדרש של עוברי (בדרך כלל 10-20 לכל תנאי) על פני הרחוב PDMS באמצעות פיפטה של העברה.
3. בעזרת כלי המיקרומניפולציה (שיער לולאה או דומה), לדחוף את העוברים החורים microstructured (איור 3 א). השימוש וגושים מתאימה בעיקר אוריינטציות הגבי ו הגחון.
   הערה: לקבלת החורים עם הדוק יותר מתאים (הגבי ו הגחון), נסה מיצוב העוברים על פני הרחוב במקביל דיבוט ולאחר מכן לגלגל אותם בעזרת לולאה שיער. דוחף אותם עמוק יותר לתוך דיבוט יסייע לשמור אותם יציבים.

7. הכיוון של דג זברה על השטח Microstructured - ערוצי Microstructured

1. צייר E3 לא ברחוב PDMS בדוגמת לערוצי microstructured (איור 3B) באמצעות פיפטה העברה של עד הרמה של E3 יורד מתחת לקצה הרחוב, אך היא עדיין נוכחים המאגר ואת ערוצי בשכבה דקה על PDMS.
2. העברת העוברים 10 מהשלב 5.3 לתוך המאגר באמצעות פיפטה העברה, נזהר שלא תציף את הקצוות.
3. באמצעות לולאה שיער, לתמרן כל העובר לאבדון בכניסה של הערוץ המתאים, אוריינט כזה כי ראשו של העובר לכיוון התעלה, העובר יש את הכיוון המתאים המתאוששת הערוץ.
4. החלק כל העובר למטה הערוץ באמצעות לולאה שיער עד שהוא מגיע את microfeatures orienting בקירות הערוץ המסייעים לשמור אותו במקום. השימוש ערוצי microstructured מומלצת במיוחד בכיוון לרוחב.
   הערה: כדי לצמצם את העובר הזזה במהלך microinjection, נסה לכוונן את הכמות של מתח על ידי ציור E3 מן המאגר.

8. microinjection של דג זברה

1. להכין את המחט microinjection.
   1. להפוך מחטים microcapillary זכוכית בורוסיליקט באמצעות של פולר micropipette כמו שתואר לעיל⁴. . המחטים וכתוצאה מכך צריך צמצום עד לנקודה בקצה אחד, באורך להתחדד של 10 מ מ.
   2. להכין פתרון כדי להיות מוזרק, ב- chemoattractant ננומטר זה מקרה 100 (N-Formylmethionine-leucyl-פנילאלנין (fMLP) או Leukotriene B4 (LTB4)) ו- 100 ננומטר של 70 kDa Rhodamine לתוספי מעקב ב- PBS.
   3. לטעון µL 5 של פתרון לתוך המחט בעזרת פיפטה דק מחודדות עצה (ראה טבלת חומרים).
   4. לטעון את המחט לתוך micromanipulator רכוב על דוכן מגנטי ומחובר microinjector picopump.
2. לשבור את קצה המחט בזווית של 45 מעלות על-ידי צובט את הטיפ מחודדות עם מלקחיים.
3. התאם גודל בולוס הזרקת 1 nL על-ידי התאמת זמן הזרקת בבקר picopump.
4. להתאים את הזווית של המחט microinjection. זווית המחט של 45 מעלות על הבקר המיקרומניפולציה בדרך כלל נקודת התחלה טובה, עם מחט מקבילים באורך של העובר. זווית תלולה עשוי לשמש כדי למזער את התנועה לרוחב של העובר במהלך microinjection.
5. שליטה על צלחת פטרי עם יד שמאל ועל את המחט micromanipulator בימין, להביא את המחט קרוב ככל האפשר לאתר המיועד של microinjection, במקרה זה שלפוחית otic.
   הערה: ניתן לזהות את שלפוחית otic כמו האיבר מלבני האחורי לעין המכיל שני קטן יותר ברורים כהה מלבני מבנים (otoliths).
6. באמצעות הבקר חוץ-גופית, לחדור את רקמת המטרה (במקרה זה שלפוחית otic) כך קצה המחט נמצא שלפוחית, ולהזריק האחסון מראש באמצעות המתג הרגל picopump.
   הערה: אם הרקמה יתנגד חדירה, לנסות בעדינות הקשה על הידית בקר המיקרומניפולציה.
7. כדי לשחרר את העוברים, זורמים E3 מעל פני השטח מלמעלה למטה באמצעות פיפטה העברה, או על ידי מתערבל המנה כך העוברים משוחררים לתוך E3 שמסביב.
8. העברת העוברים תבשיל שחזור של E3 ללא באמצעות פיפטה העברה של MS-222.

9. הקרנת עוברי באמצעות PDMS את התקן הדמיה

1. פריים המכשיר משלב 4.7 מאת זורם E3 (+ MS-222) דרך היציאה. ניתן לבצע זאת באמצעות פיפטה 1,000 µL או פיפטה של צרות-קצה העברה.
2. למלא את הבאר E3 + MS-222 עד המכשיר מכוסה.
3. לספק 4 העוברים מוזרק משלב 8.7 לתוך כל טוב באמצעות פיפטה של העברה. עוברי ניתן מראש anesthetized במידת הצורך על-ידי המקננת ב E3 + MS-222 למשך 1-2 דקות לפני טעינת (שלב 5.3).
4. בעזרת כלי המיקרומניפולציה (שיער לולאה או דומה), אוריינט העוברים בכניסות של ערוצי הדמיה בכיוון הרצוי (זנב-הראשון או ראש-הראשון, בהתאם למכשיר בשימוש), לדחוף אותם באופן חלקי המכשיר (איור 4A). זה יעזור למשוך אותם לתוך המכשיר באופן שווה.
5. צייר E3 דרך המכשיר מן הנמל באמצעות פיפטה µL 1,000 או פיפטה העברה עד העוברים נמשכים לתוך תעלות לכיוון הנכון הדמיה (איור 4B).
   הערה: תיזהר שלא לשאוב את העוברים מעבר לנקודה השמנה, זה נזק העוברים ולשנות את חוש ההתמצאות שלהם.
6. להעביר היטב-לוחית מיקרוסקופ הדמיה (איור 4C).
7. התמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה.
   1. התאם הגדלה על-ידי בחירת העדשה המתאימה. 10 X הוא בדרך כלל ההגדלה שימושי הדמיה ההעברה נויטרופילים דג זברה.
   2. התאם עוצמה מקור האור וזמן חשיפה לכל ערוץ כך כל אות היא ברורה, אבל לא רוויות.
   3. לכידת תמונות לכל ערוץ. כאן, השתמשנו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP, לשעבר: 470/22, Em: 525/50), טקסס אדום (TxRed, לשעבר: 585/29, Em: 628/32) ולהעביר ערוצי. ניתן לשלב תמונות רב-ערוצי במהלך עיבוד שלאחר (איור 4B-אני).

תוצאות

הגישה המתוארת כאן מדגים את העיצוב (איור 1) ועל פבריקציה נוספת של התקנים לשימוש עם דג זברה 2 dpf, באמצעות photolithographic (איור 2) וטכניקות רך-ליטוגרפיה (איור 3). שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של איטראציות עיצוב ושינויים רבים, שינויים ואופ?...

Discussion

כאן, אנו מתארים את השימוש של ההתקנים שפיתחנו לאחרונה להקל על 2 dpf דג זברה microinjection⁵, ולהציג את התקן הרכבה פשוטה ללא agarose עבור הדמיה נוח של העוברים. כלים אלה מדגישים את התועלת של טכניקות photolithographic להרכבת התקנים שימושי עבור דג זברה טכניקות.

מצאנו למתקן התקנים שימושי ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose	Sigma Aldrich	A9414-10G	For casting agarose devices
PFDTS silane	Sigma Aldrich	448931-10G	For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	To anesthetize zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da	ThermoFisher	D1818	To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish	Fisher scientific	08-757-148	For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates	MatTek	P06G-0-20-F	For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries	World Scientific Instruments	TW-100-4	For microinjection needles
Transfer pipettes	Sigma Aldrich	Z350796	For transferring zebrafish embryos
Microloader tips	Fisher scientific	E5242956003	For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch	Ted Pella Inc.	15111-15	To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-10	For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator	ASI	MM33-R	For manipulating microinjection needle
Magnetic stand	MSC	SPI - 87242624	For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller	ASI	MPPI-3	To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope	ThermoFisher	EVOS FL	To image injected embryos
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745	For visualizing microinjecion
AutoCAD software	Autodesk		Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki