Separación de la epidermis y la dermis de rata con termoisina para detectar ARNm y proteínas inflamatorias específicas del sitio

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la separación de la epidermis de la dermis para evaluar la producción de mediadores inflamatorios. Después de la inflamación, la epidermis de la pata trasera de la rata se separa de la dermis por termolisis a 4 ° C. La epidermis se utiliza para el análisis de ARNm por RT-PCR y la evaluación de proteínas por western blot e inmunohistoquímica.

Resumen

Se necesitan técnicas fáciles de usar y económicas para determinar la producción específica del sitio de mediadores inflamatorios y neurotrofinas durante lesiones cutáneas, inflamación y / o sensibilización. El objetivo de este estudio es describir un protocolo de separación epidérmica-dérmica utilizando termolisina, una proteinasa que está activa a 4 °C. Para ilustrar este procedimiento, las ratas Sprague Dawley son anestesiadas, y las patas traseras derechas se inyectan con carragenina. Seis y doce horas después de la inyección, las ratas con inflamación y las ratas ingenuas son sacrificadas, y un trozo de pata trasera, piel glabra se coloca en el medio de águila modificada de Dulbecco frío. La epidermis se separa en la membrana basal de la dermis por termolisis en PBS con cloruro de calcio. A continuación, la dermis está asegurada por pórceps de microdisección, y la epidermis se elimina suavemente. La tinción azul toluidina de las secciones de tejido muestra que la epidermis se separa limpiamente de la dermis en la membrana basal. Todas las capas de células de queratinocitos permanecen intactas, y las crestas de rete epidérmicas junto con las hendiduras de las papilas dérmicas se observan claramente. La RT-PCR cualitativa y en tiempo real se utiliza para determinar el factor de crecimiento nervioso y los niveles de expresión de interleucina-6. Western blotting e inmunohistoquímica finalmente se realizan para detectar cantidades de factor de crecimiento nervioso. Este informe ilustra que la digestión con termoisina fría es un método eficaz para separar la epidermis de la dermis para la evaluación de las alteraciones del ARNm y las proteínas durante la inflamación.

Introducción

La evaluación de mediadores inflamatorios y factores neurotróficos de la piel puede ser limitada debido a la heterogeneidad de los tipos celulares que se encuentran en la dermis inflamada y la epidermis^1,2,3. Recientemente se han revisado varias enzimas, técnicas químicas, térmicas o mecánicas que implican la separación de las dos capas o para realizar la disociación celular para su evaluación⁴. El ácido, el álcali, la sal neutra y el calor pueden dividir la epidermis de la dermis rápidamente, pero la hinchazón celular y extracelular a menudo ocurre^5,6. La tripsina, la pancreatina, la elastasa, la queratinasa, la colagenasa, la pronasa, la dispasa y la termolisina son enzimas que se han utilizado para la separación epidérmica-dérmica^4,7. La tripsina y otras enzimas proteolíticas a gran escala están activas a 37-40 °C, pero deben controlarse cuidadosamente para evitar la disociación de las capas epidérmicas. Dispase escinde la epidermis en la lámina densa, pero requiere 24 h para la separación en los puntos fríos^{de 4,8} o menos tiempo a 37 °C^4,9. Una característica limitante de todas estas técnicas es la posible alteración de la morfología tisular y la pérdida de integridad del ARNm y la proteína.

Para mantener la integridad del ARNm y la proteína, se debe llevar a cabo un método de separación de la piel en el frío durante un corto período de tiempo. En la evaluación de técnicas de separación de la piel para estudios de inflamación, la termoisina es una enzima eficaz para separar la epidermis de la dermis a temperaturas frías⁴. La termoisina es activa a 4 °C, escinde los hemidesmosomas epidérmicos de la lámina lúcida y separa la epidermis de la dermis en 1–3 h^4,8,10. El objetivo de este informe es optimizar el uso de termolysin para la separación de la epidermis de rata inflamada de la dermis para detectar los niveles de ARNm y proteínas para mediadores inflamatorios y factores neurotróficos. Se han presentado varios informes preliminares^{11,12,13,14,15.} El objetivo de este manuscrito es describir una técnica óptima de separación cutánea utilizando termolizsina y demostrar la detección de 1) marcadores de inflamación, 2) ARNm de interleucina-6 (IL-6) y 3) ARNm y proteína del factor de crecimiento nervioso (NGF) en la epidermis de ratas con inflamación inducida por carragenina (C-II)^16,17. Un informe preliminar utilizando el modelo adyuvante completo de Freund indica que los niveles de ARNm y proteínas ngf aumentan temprano durante la inflamación¹⁵. En ratones, la sensibilización cutánea con la aplicación tópica de oxazolona provoca un aumento precoz del ARNm IL-6 mediante hibridación in situ³⁶. Tanto la IL-6 como la NGF se han implicado en C-II^18,19,pero no ha habido informes que describan los niveles de ARNm o proteína para IL-6 o NGF específicamente de la epidermis durante las etapas agudas de C-II.

La técnica de termolysin es barata y fácil de realizar. Además, la separación termolisina de la epidermis de la dermis permite el ARNm, el western blot y el análisis inmunohistoquímico de mediadores inflamatorios y factores neurotróficos durante el proceso de inflamación¹⁵. Los investigadores deben poder utilizar fácilmente esta técnica en estudios preclínicos y clínicos de inflamación de la piel.

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Oklahoma IACUC (#2016-03).

1. Inflamación inducida por carragenina (C-II)

1. Anestesiar ratas Sprague Dawley macho y/o hembra (200–250 g; 8–9 semanas de edad) con isoflurano (o anestésico inyectable).
2. Verifique la profundidad de la anestesia tocando la córnea y pellizcando ligeramente la pata trasera izquierda. Cuando el animal está anestesiado adecuadamente, no se observará ninguna respuesta corneal o de la pata.
3. Inyecte por vía subcutánea la pata trasera glabra derecha con 100 μL de 1% (p/v) de λ-carragenina diluida en solución salina tamponada con fosfato (PBS)²⁰.
   1. Asegúrese de que se utilizan los controles adecuados, como las ratas ingenuas sin isoflurano en este informe. Estudios preliminares indican que las ratas ingenuas con o sin isoflurano tienen la misma expresión basal de IL-6 epidérmica y NGF.
      NOTA: Las ratas naïve son los controles preferidos para los estudios de inflamación ya que la solución salina subcutánea o PBS causan una inflamación local^23,37.
4. Evaluar el edema de ratas C-II para garantizar la efectividad de la carragenina (Figura 1)²⁰. Determine la cantidad de edema midiendo el grosor del metatarsiano de la pata trasera con pinzas.
5. A las 6-12 h, sacrificar a las ratas con CO₂ (o sobredosis de anestésico inyectable) y cortar trozos de 1 mm x 2 mm de piel glabra de la pata trasera con bisturí afilado. Si se usa piel peluda, afeitarla antes de cortar los trozos de piel de 1 mm x 2 mm.
   NOTA: Asegúrese de que se elijan los puntos de tiempo apropiados de acuerdo con los estudios específicos.
6. Usando fórceps de microdisección, transfiera la piel a 1 ml de Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco frío en un tubo de microcentrífuga sobre hielo y manténgala fría durante 15-60 minutos.

2. Separación termolísina de la epidermis y la dermis

1. Preparar y activar la termolisisina.
   1. Preparar una solución de termolysin, añadiendo 5 mg de Geobacillus stearothermophilus a 10 mL de PBS, a pH = 8 (concentración 500 μg/mL).
   2. Preparar una solución de 1 M de cloruro de calcio (CaCl₂ anhidro) añadiendo 1,11 g en 10 mL de H₂O destilado.
   3. Para prevenir la autolisis de la termoisina, agregue 10 μL de cloruro de calcio a 10 ml de solución de termolysina. La concentración final de cloruro de calcio será de 1 mM.
   4. Alícuota 1 ml de termolysina activada en 10 pozos de una placa de cultivo celular de 24 pozos en hielo.
2. Use la digestión de la enzima termolysin para separar la epidermis de la dermis.
   1. Usando pórceps de microdisección, transfiera una muestra de piel a cada pocillo de termolisis activada. Asegúrese de no sumergir la piel en la solución de termosina.
   2. Golpee suavemente la piel en el costado del pozo para ayudar a liberar la muestra de piel de las pórceps para que flote en la solución de termoisina.
   3. Flote la piel en la solución de termoisina con el estrato córneo (epidermis externa) hacia arriba y la dermis hacia abajo. Es fundamental que la dermis esté hacia abajo, o la separación efectiva no tendrá lugar.
      NOTA: La cantidad de tiempo para la incubación de termoisina debe ser determinada empíricamente por el usuario final. La piel glabra de la pata trasera de las ratas Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 semanas de edad) a menudo requiere 2.0-2.5 h para la separación. Se espera que el tiempo de incubación varíe con la especie y la edad.
   4. Después del tiempo de incubación apropiado en termolysin, use fórceps de microdisección para transferir una muestra de piel a un pozo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos con 7–8 ml de DMEM frío (4 ° C). Esto permite más espacio para la separación de la epidermis de la dermis.
   5. Sumerja la piel en el DMEM.
   6. Cepille suavemente la epidermis con los górceps alrededor del perímetro de la piel hasta que se observe la epidermis casi translúcida en los bordes. Si esto no se puede lograr, devuelva la muestra de piel a la solución de termoisina durante otros 15-30 minutos.
   7. Una vez que la epidermis se separa notablemente de la dermis, sostenga cuidadosamente tanto la epidermis como la dermis con pórceps de microdisección y tire muy lentamente de la epidermis de la dermis.
   8. Evalúe la translucida de la epidermis aislada y asegúrese de que sea ópticamente consistente. Vea la Figura 2 para un ejemplo de una muestra de epidermis de rata de 1 mm x 2 mm. Si hay una variación en la translucida, entonces no se ha producido una separación adecuada.
3. Inactivar la termolisis utilizando ácido etilendiamintetraacético (EDTA) en las piezas separadas de la epidermis y la dermis.
   PRECAUCIÓN: La termolisis que permanece en la epidermis y la dermis sigue activa y puede dañar las capas si no se inactiva.
   1. Prepare una solución de stock de EDTA de 0,5 M. Para hacerlo, agregue lentamente 0.93 g de EDTA en 5 ml de agua de doble destilación. Agregue hidróxido de sodio a la solución hasta que desaparezca. Asegúrese de que el pH de la solución sea ~ 8.0.
   2. Haga una solución de EDTA de 5 mM en DMEM. Añadir 0,25 mL de solución de stock de EDTA de 0,5 M a 25 mL de DMEM.
   3. Coloque la epidermis y la dermis separadas en la solución EDTA/DMEM de 5 mM a 4 °C durante 30 min para desactivar la actividad de la termoisina.
4. Evaluar la epidermis con histología tinctorial^8,9,10.
   1. Fije una porción de la epidermis en una formalina neutra al 10%, paraformaldehído al 4% o paraformaldehído al 0,25% con una solución de ácido pícrico al 0,8% durante 1 h a temperatura ambiente (RT) con agitación.
   2. Coloque la epidermis fija en sacarosa al 10% en PBS durante 1 h en RT con agitación.
   3. Congele la epidermis en una matriz de incrustación de tejido para la seccionamiento. Corte secciones transversales de 14 μm con un criostato y secciones de montaje de descongelación en portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de gelatina.
   4. Seque las secciones en un calentador deslizante y manche con una solución de trabajo de azul de toluidina (TB; 10% tb en cloruro de sodio al 1%) durante 90 s. Appose coverslips con un medio de montaje acuoso.
   5. Observe la epidermis con microscopía de campo brillante a 50x–250x.
      NOTA: Si se ha producido una separación adecuada, la epidermis se dividirá limpiamente de la dermis y se detectarán las cinco capas: estrato basal, estrato espinoso, estrato granuloso, estrato lúcido y estrato córneo. Un ejemplo de epidermis separada de piel de rata se puede ver en la Figura 3.

3. Extracción de proteínas y análisis de western blot

1. Realizar western blotting en las muestras de tejido separadas utilizando el protocolo²¹publicado previamente.
2. Homogeneizar la epidermis en 50 μL de tampón de lisis (25mM Tris HCl, pH = 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% de glicerol y 1% de Tritón X-100) que contiene un cóctel inhibidor de la fosfatasa y la proteasa.
3. Centrifugar muestras a una velocidad máxima durante 15 min a 4 °C y evaluar el sobrenadante para la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo de proteínas.
4. Cargue concentraciones iguales de proteína (30 μg) en geles SDS, realice electroforesis y luego transfiera proteínas a membranas de nitrocelulosa o PVDF.
5. Bloquea las membranas con leche al 5% durante 2 h e incuba durante la noche en anticuerpo primario (ratón anti-NGF, E12, 1:1000).
6. Lavar 3x con PBS con interpolación al 0,3% durante 10 min cada uno e incubar con un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, fosfatasa alcalina etiquetada como conejo anti-ratón IgG).
7. Utilice un sistema de escaneo para evaluar la señal de western blot (por ejemplo, sustrato ECF y una plataforma de imágenes).

4. Inmunohistoquímica

1. Coloque las muestras de tejido en un fijador para una inmunorreactividad óptima: 0,96% (p/v) de ácido pícrico y 0,2% (p/v) de formaldehído en tampón de fosfato de sodio de 0,1 M, pH = 7,3^21,22,23 durante 4 h en RT. Transfiera a sacarosa al 10% en PBS durante la noche a 4 °C.
2. Realizar inmunohistoquímica estándar en las secciones tisulares^21,22,23.
3. Incrustar la epidermis de los animales en un solo bloque congelado en la matriz de incrustación y cortar secciones de 10-30 μm en un criostato. Monte las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos de gelatina y séque a 37 °C durante 2 h.
4. Lavar las secciones durante tres, 10 minutos de enjuague en PBS e incubar durante 24-96 h en antisenos primarios, [por ejemplo, anti-NGF de ratón (E12, 1:2000)] y producto genético antiproteína de conejo 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) diluido en PBS que contiene 0.3% (p/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T con 0.5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0.5% de polivinilpirrolidona (PVP).
5. Después de la incubación primaria antisérica, enjuague las secciones tres veces durante 10 min en PBS e incube 1 h en RT en Alexa Fluor 488 burro anti-conejo IgG (1:1000) y Alexa Fluor 555 burro anti-ratón IgG (1:1000) diluido en PBS-T.
6. Enjuague las secciones tres veces en PBS durante 10 minutos y fije los recuestors con un medio de montaje que no se desvanezca para retardar el desvanecimiento de la inmunofluorescencia.

5. Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

1. Realizar reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa estándar (RT-PCR) en las muestras de piel²¹. Aislar el ARN total usando una solución de isotiocianato de fenol y guanidina.
2. Realizar síntesis complementaria de ADN mediante la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney.
3. Utilice las siguientes secuencias de imprimación para la amplificación de NGF e IL-6:
   NGF (Sentido) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
   NGF (Antisentido) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
   IL-6 (Sentido) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
   IL-6 (Antisentido) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG
4. Compare los niveles de NGF e IL-6 mRNA con β-actina del gen de limpieza:
   β-ACTINA (Sentido) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
   β-ACTINA (Antisentido) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
5. Evaluar con RT-PCR cualitativa utilizando termociclador y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) utilizando un sistema qRT-PCR.

Resultados

La inyección de carragenina en la pata trasera de la rata causó síntomas clásicos de inflamación como enrojecimiento y edema^16,17. La hinchazón de la pata trasera se midió con pinzas mecánicas²⁰. Se obtuvo un valor basal del grosor de la pata para cada rata antes del tratamiento con carragenina y se midió nuevamente a las 6 h y 12 h. El grosor de la pata aumentó significativamente en comparación con los valores basales

Discusión

El estudio determinó que la epidermis de la piel glabra de la pata trasera de la rata se separó fácilmente de la dermis utilizando termoisina (0,5 mG / ml) en PBS con 1 mM de cloruro de calcio a 4 ° C durante 2,5 h. La evaluación histológica indicó que la epidermis estaba separada de la dermis en la membrana basal y que las crestas de la rete epidérmica estaban intactas. La termolisina es una metaloendopeptidasa extracelular producida por Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
λ-carrageenan	Millipore Sigma	22049	Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107	For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous	Millipore Sigma	499609	Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium	Millipore Sigma	C0612	Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-31570	Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11966-025	To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid	Millipore Sigma	E6758	Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase	Promega	M1701	For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365944	For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5	Cedarlane Labs	CL7756AP	For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat	Charles River	Strain Code 400	Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix	Thermo Fisher Scientific	1310TS	Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4472908	For RT-PCR analysis
Thermolysin	Millipore Sigma	T7902	From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue	Millipore Sigma	89640	For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	For total RNA extraction for RTPCR