Separação de Epiderme de Rato e Derme com Termolise para Detectar mRNA inflamatório específico do local e proteína

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para a separação da epiderme da derme para avaliar a produção de mediadores inflamatórios. Após a inflamação, a epiderme da pata traseira de rato é separada da derme por termolysina a 4 °C. A epiderme é então usada para análise de mRNA por RT-PCR e avaliação de proteínas por mancha ocidental e imunohistoquímica.

Resumo

Técnicas fáceis de usar e baratas são necessárias para determinar a produção específica do local de mediadores inflamatórios e neurotrophins durante lesões, inflamações e/ou sensibilização da pele. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo de separação epidérmico-dérmica usando termolysina, uma proteína que está ativa a 4 °C. Para ilustrar este procedimento, os ratos Sprague Dawley são anestesiados, e as patas traseiras direitas são injetadas com carrageenan. Seis e doze horas após a injeção, ratos com inflamação e ratos ingênuos são eutanizados, e um pedaço de pata traseira, pele glabrous é colocada no frio Dulbecco's Modified Eagle Medium. A epiderme é então separada na membrana do porão da derme por termolysina em PBS com cloreto de cálcio. Em seguida, a derme é protegida por fórceps de microdisseção, e a epiderme é gentilmente provocada. A coloração azul toluidina das seções teciduais mostra que a epiderme é separada limpamente da derme na membrana do porão. Todas as camadas celulares queratinócitos permanecem intactas, e as cristas epidérmicas de rete, juntamente com recuos de papilas dérmicas são claramente observadas. O RT-PCR qualitativo e em tempo real é usado para determinar o fator de crescimento nervoso e os níveis de expressão interleucina-6. Manchas ocidentais e imunohistoquímica são finalmente realizadas para detectar quantidades de fator de crescimento nervoso. Este relatório ilustra que a digestão da termolise fria é um método eficaz para separar a epiderme da derme para avaliação de alterações de mRNA e proteínas durante a inflamação.

Introdução

A avaliação de mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos da pele pode ser limitada devido à heterogeneidade dos tipos celulares encontrados na derme inflamada e epiderme^1,2,3. Várias enzimas, técnicas químicas, térmicas ou mecânicas envolvendo separação das duas camadas ou para a realização da dissociação celular para avaliação foram revisadas recentemente⁴. Ácido, álcali, sal neutro e calor podem dividir a epiderme da derme rapidamente, mas o inchaço celular e extracelular geralmente ocorre^5,6. Tripo, pancreatina, descamefástase, keratinase, colagenase, pronase, dispase e termolise são enzimas que foram usadas para separação epidérmico-dérmica^4,7. Trippsina e outras enzimas proteolíticas de larga escala estão ativas a 37-40 °C, mas devem ser monitoradas cuidadosamente para evitar a dissociação de camadas epidérmicas. Dispase corta a epiderme na lamina densa, mas requer 24h para separação no frio^4,8 ou pontos de tempo mais curtos a 37 °C^4,9. Uma característica limitante de todas essas técnicas é a potencial interrupção da morfologia tecidual e perda de integridade de mRNA e proteína.

Para manter a integridade do mRNA e da proteína, um método de separação da pele deve ser realizado no frio por um curto período de tempo. Na avaliação das técnicas de separação da pele para estudos de inflamação, a termolise é uma enzima eficaz para separar a epiderme da derme a temperaturas frias⁴. A termolise está ativa a 4 °C, corta hemidesmosmosomos epidérmicos da lamina lucida, e separa a epiderme da derme dentro de 1-3 h^4,8,10. O objetivo deste relatório é otimizar o uso de termolysina para separação de epiderme inflamada de ratos inflamados da derme para detectar níveis de mRNA e proteína para mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos. Vários relatórios preliminares foram apresentados^{11,12,13,14,15}. O objetivo deste manuscrito é descrever uma técnica ideal de separação da pele utilizando termolysina e demonstrar a detecção de 1) marcadores de inflamação, 2) interleucina-6 (IL-6) mRNA, e 3) mRNA e proteína na epiderme de ratos com inflamação induzida por carrageenano (C-II)^16,17. Um relatório preliminar usando o modelo adjuvante completo da Freund indica que os níveis de MRNA e proteína ngf aumentam precocemente durante a inflamação¹⁵. Em camundongos, a sensibilização da pele com a aplicação tópica da oxazolona causa um aumento precoce no IL-6 mRNA usando a hibridização in situ³⁶. Tanto o IL-6 quanto o NGF foram implicados em C-II^18,19, mas não houve relatos que descrevam níveis de mRNA ou proteína para IL-6 ou NGF especificamente da epiderme durante os estágios agudos de C-II.

A técnica de termolise é barata e simples de executar. Além disso, a separação termolísina da epiderme da derme permite a análise mRNA, western blot e imunohistoquímica de mediadores inflamatórios e fatores neurotróficos durante o processo de inflamação¹⁵. Os pesquisadores devem ser capazes de usar facilmente essa técnica em estudos pré-clínicos e clínicos de inflamação cutânea.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).

1. Inflamação induzida por carrageenano (C-II)

1. Anestesize ratos machos e/ou fêmeas Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 semanas de idade) com isoflurane (ou anestésico injetável).
2. Verifique a profundidade da anestesia tocando a córnea e apertando levemente a pata traseira esquerda. Quando o animal estiver apropriadamente anestesiado, nenhuma resposta de córnea ou pata será observada.
3. Injete subcutâneamente o glabrous direito, pata traseira com 100 μL de 1% (w/v) diluído em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)²⁰.
   1. Certifique-se de que sejam utilizados controles apropriados, como ratos ingênuos sem isoflurano neste relatório. Estudos preliminares indicam que ratos ingênuos com ou sem isoflurano têm a mesma expressão basal de IL-6 epidérmico e NGF.
      NOTA: Ratos ingênuos são controles preferenciais para estudos de inflamação, uma vez que o soro fisiológico subcutâneo ou a PBS causam uma inflamação local^23,37.
4. Avaliar o edema dos ratos C-II para garantir a eficácia do carrageenano (Figura 1)²⁰. Determine a quantidade de edema medindo a espessura metatarsal da pata traseira com pinças.
5. Às 6-12 h, eutanize os ratos com CO₂ (ou overdose anestésico injetável) e corte 1 mm x 2 mm de pele de pata traseira glabrous com bisturi afiado. Se for usada a pele pelada, raspe-a antes de cortar os pedaços de pele de 1 mm x 2 mm.
   NOTA: Certifique-se de que os pontos de tempo apropriados sejam escolhidos de acordo com os estudos específicos.
6. Usando fórceps de microdisseção, transfira a pele para 1 mL de DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco em um tubo de microcentrifusagem no gelo e mantenha frio por 15-60 min.

2. Separação termolysina de epiderme e derme

1. Prepare e ative a termolise.
   1. Prepare uma solução de termolise, adicionando 5 mg de Geobacillus stearothermophilus a 10 mL de PBS, em pH = 8 (concentração 500 μg/mL).
   2. Prepare uma solução de 1 M de cloreto de cálcio (CaCl₂ anidro) adicionando 1,11 g em 10 mL de H₂O destilado.
   3. Para prevenir a autolise da termolise, adicione 10 μL de cloreto de cálcio a 10 mL de solução termolise. A concentração final do cloreto de cálcio será de 1 mM.
   4. Aliquot 1 mL de termolysina ativada em 10 poços de uma placa de cultura de 24 poços no gelo.
2. Use a digestão da enzima termolise para separar a epiderme da derme.
   1. Usando fórceps de microdisseção, transfira uma amostra de pele para cada poço de termolise ativada. Certifique-se de não mergulhar a pele na solução termolysina.
   2. Bata suavemente a pele na lateral do poço para ajudar na liberação da amostra de pele das fórceps para flutuar sobre a solução termolysin.
   3. Flutue a pele para dentro da solução termolise com o lado estrato corneum (epiderme externa) para cima e derme voltado para baixo. É fundamental que a dermis enfrente, ou a separação efetiva não ocorra.
      NOTA: A quantidade de tempo para a incubação da termolise deve ser determinada empiricamente pelo usuário final. Glabrous, pele de pata traseira de ratos Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 semanas de idade) muitas vezes requer 2,0-2,5 h para separação. Espera-se que o tempo de incubação varie com espécies e idade.
   4. Após o tempo de incubação adequado na termolise, use fórceps de microdisseção para transferir uma amostra de pele para um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços com 7-8 mL de DMEM frio (4 °C). Isso permite mais espaço para a separação da epiderme da derme.
   5. Mergulhe a pele no DMEM.
   6. Escove suavemente a epiderme com os fórceps ao redor do perímetro da pele até que a epiderme quase translúcida seja observada nas bordas. Se isso não for alcançado, devolva a amostra de pele à solução termolise por mais 15-30 min.
   7. Uma vez que a epiderme se separe visivelmente da derme, em seguida, segure cuidadosamente tanto a epiderme quanto a derme com fórceps de microdisseção e muito lentamente puxe a epiderme da derme.
   8. Avalie a translucência da epiderme isolada e certifique-se de que ela seja opticamente consistente. Consulte a Figura 2 para um exemplo de uma amostra de 1 mm x 2 mm de epiderme de rato. Se há uma variação na translucência, então a separação adequada não ocorreu.
3. Inativar termolysina usando ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) nos pedaços separados de epiderme e derme.
   ATENÇÃO: A termolise que permanece na epiderme e na derme ainda está ativa e pode danificar as camadas se não for inativada.
   1. Prepare uma solução de estoque 0,5 M EDTA. Para isso, adicione lentamente 0,93 g EDTA em 5 mL de água duplamente destilada. Adicione hidróxido de sódio à solução até que ela se limpe. Certifique-se de que o pH da solução é ~8.0.
   2. Faça uma solução EDTA de 5 mM no DMEM. Adicione 0,25 mL de 0,5 M EDTA solução de estoque a 25 mL de DMEM.
   3. Coloque a epiderme e a derme separadas na solução EDTA/DMEM de 5 mM a 4 °C por 30 minutos para desativar a atividade da termolise.
4. Avalie a epiderme com histologia tinctorial^8,9,10.
   1. Fixar uma porção da epiderme em uma formalina 10% neutra, 4% paraformaldeído, ou 0,25% paraformaldeído com solução de ácido picrico de 0,8% para 1h à temperatura ambiente (TR) com agitação.
   2. Coloque a epiderme fixa em 10% de sacarose em PBS por 1h no RT com agitação.
   3. Congele a epiderme em uma matriz de incorporação de tecido para seção. Corte 14 seções transversais de 14 μm usando um criostat e seções de montagem de degelo em lâminas de microscópio de vidro revestidas de gelatina.
   4. Seções secas em um aquecedor de slides e mancha com uma solução de trabalho de azul toluidina (TB; 10% TB em cloreto de sódio 1%) para 90 s. O appose cobre clipes com um meio de montagem aquoso.
   5. Observe a epiderme com microscopia de campo brilhante em 50x-250x.
      NOTA: Se ocorreu a separação adequada, a epiderme será dividida limpamente da derme e as cinco camadas serão detectadas: estrato basale, estrato spinosum, estrato granuloso, estrato lucidum e corneum estrato. Um exemplo de epiderme separada da pele de rato pode ser visto na Figura 3.

3. Extração de proteínas e análise de manchas ocidentais

1. Realize manchas ocidentais nas amostras de tecido separados usando o protocolo²¹publicado anteriormente .
2. Homogeneize a epiderme em 50 μL de tampão de lise (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerol e 1% Triton X-100) contendo fosfatase e coquetel inibidor de protease.
3. Centrífuga amostras a uma velocidade máxima de 15 min a 4 °C e avaliar o sobrenante para concentração de proteínas usando um kit de ensaio de proteínas.
4. Carregar concentrações iguais de proteína (30 μg) em géis SDS, realizar eletroforese e, em seguida, transferir proteínas para membranas nitrocelulose ou PVDF.
5. Bloqueie as membranas com 5% de leite por 2 h e incubar durante a noite em anticorpo primário (camundongo anti-NGF, E12, 1:1000).
6. Lave 3x com PBS com 0,3% de interpolação por 10 min cada e incuba com um anticorpo secundário rotulado (por exemplo, fosfatese alcalina rotulada anti-rato IgG).
7. Use um sistema de varredura para avaliar o sinal de mancha ocidental (por exemplo, substrato ECF e uma plataforma de imagem).

4. Imunohistoquímica

1. Coloque amostras de tecido em um fixador para a imunoreatividade ideal: 0,96% (w/v) ácido picrico e 0,2% (w/v) formaldeído em 0,1 M tampão fosfato de sódio, pH = 7,3^21,22,23 por 4 h na RT. Transfira para 10% de sacarose em PBS durante a noite a 4 °C.
2. Realizar imunohistoquímica padrão nas seções teciduais^21,22,23.
3. Incorpore a epiderme dos animais em um único bloco congelado na matriz de incorporação e corte seções de 10 a 30 μm em um criostat. Monte as seções em lâminas de microscópio de vidro revestidas de gelatina e seque a 37 °C por 2 h.
4. Lavar seções para três, 10 min enxagua em PBS e incubar por 24-96 h em antissoro primário, [por exemplo, camundongo anti-NGF (E12, 1:2000)] e produto genético anti-proteína de coelho 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) diluído em PBS contendo 0,3% (w/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T com albumina de soro bovino de 0,5% (BSA) e 0,5% polivinylpyrrolidone (PVP).
5. Após a incubação primária do anti-coelhinho, enxágue seções três vezes por 10 min na PBS e incubar 1 h na RT em Alexa Fluor 488 burro anti-coelho IgG (1:1000) e Alexa Fluor 555 burro anti-mouse IgG (1:1000) diluído em PBS-T.
6. Enxágüe seções três vezes em PBS por 10 min e afixe tampas com meio de montagem não desbotado para desbotamento retardado da imunofluorescência.

5. Isolamento do RNA e síntese de CDNA

1. Realize a reação padrão de cadeia de transcriptase reversa (RT-PCR) nas amostras de pele²¹. Isole o RNA total usando uma solução de isothiocianato de fenol e guanidina.
2. Realizar síntese de DNA complementar pelo vírus da leucemia murina Moloney reverter transcriptase.
3. Use as seguintes sequências de primer para amplificação NGF e IL-6:
   NGF (Sense) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
   NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAGAAGGAGATTGTACCATG
   IL-6 (Sentido) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
   IL-6 (Antisense) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG
4. Compare os níveis de NGF e IL-6 mRNA com o gene de limpeza de β-actin:
   β-ACTIN (Sentido) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
   β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
5. Avalie com RT-PCR qualitativo usando ciclofatritor térmico e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) usando um sistema qRT-PCR.

Resultados

A injeção de carrageenano na pata traseira do rato causou sintomas clássicos de inflamação, como vermelhidão e edema^16,17. O inchaço da pata traseira foi medido com pinças mecânicas²⁰. Um valor de linha de base da espessura da pata foi obtido para cada rato antes do tratamento carrageenano e medido novamente às 6h e 12 h. A espessura da pata aumentou significativamente em relação aos valores da linha de base

Discussão

O estudo determinou que a epiderme da pele de pata traseira de rato foi facilmente separada da derme usando termolise (0,5 mG/mL) em PBS com cloreto de cálcio de 1 mM a 4 °C por 2,5 h. A avaliação histológica indicou que a epiderme foi separada da derme na membrana do porão e que as cristas de rete epidérmicas estavam intactas. Termolysina é um metalloendopeptidase extracelular produzido por Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus²⁴. Sua atividade é estável a 4 ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
λ-carrageenan	Millipore Sigma	22049	Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107	For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous	Millipore Sigma	499609	Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium	Millipore Sigma	C0612	Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-31570	Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11966-025	To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid	Millipore Sigma	E6758	Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase	Promega	M1701	For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365944	For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5	Cedarlane Labs	CL7756AP	For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat	Charles River	Strain Code 400	Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix	Thermo Fisher Scientific	1310TS	Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4472908	For RT-PCR analysis
Thermolysin	Millipore Sigma	T7902	From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue	Millipore Sigma	89640	For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	For total RNA extraction for RTPCR