부위별 염증성 mRNA 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리

요약

여기에 제시된 표피의 분리를 위한 프로토콜이 진피로부터 염증성 중재자 생산을 평가하기 위한 것이다. 염증에 따라, 쥐 뒷발 표피는 4°C에서 열리신에 의해 진피로부터 분리된다. 표피는 그 때 서쪽 blot 및 면역 작용화학에 의하여 RT-PCR 및 단백질 평가에 의하여 mRNA 분석을 위해 이용됩니다.

초록

사용이 간편하고 저렴한 기술은 피부 손상, 염증 및/또는 민감화 중에 염증 성 중재자 및 신경 영양증의 사이트 별 생산을 결정하는 데 필요합니다. 이 연구의 목적은 4°C에서 활성단백질인 써모리신을 사용하여 표피-진피 분리 프로토콜을 설명하는 것이다. 이 절차를 설명하기 위해, 스프라그 Dawley 쥐는 마취되고, 오른쪽 뒷발은 카라지난으로 주입됩니다. 주입 후 6 시간 및 12 시간, 염증과 순진한 쥐를 가진 쥐는 안락사되고, 뒷발, 글라브루스 피부는 차가운 덜벡코의 수정 된 독수리 매체에 배치됩니다. 표피는 염화칼슘을 가진 PBS에 있는 열분해에 의해 진피에서 지하 막에서 분리됩니다. 다음으로, 진피는 미세 절 집게에 의해 고정되고 표피가 부드럽게 조롱됩니다. 조직 섹션의 Toluidine 파란색 염색은 표피가 지하 막의 진피에서 깨끗하게 분리되어 있음을 보여줍니다. 모든 각질 세포 층은 그대로 유지되며, 진피 유두의 들여쓰기와 함께 표피 리트 능선이 명확하게 관찰됩니다. 질적 및 실시간 RT-PCR은 신경 성장 인자와 인터류키-6 발현 수준을 결정하는 데 사용됩니다. 서양 블로팅 및 면역 히토화학은 마침내 신경 성장 인자의 양을 검출하기 위해 수행됩니다. 이 보고는 감기 열분해 소화가 염증 도중 mRNA및 단백질 변경의 평가를 위한 진피에서 표피를 분리하는 효과적인 방법이다는 것을 보여줍니다.

서문

염증성 진피 및 표피^1,2,3에서발견되는 세포 유형의 이질성으로 인해 피부로부터의 염증성 중식 및 신경영양인의 평가가 제한될 수 있다. 평가를 위해 세포 해리를 수행하기 위해 2층의 분리 또는 수행을 위한 여러 효소, 화학적, 열 또는 기계적 기술이 최근^4개검토되고 있다. 산, 알칼리, 중성염 및 열은 표피를 진피로부터 빠르게 나눌 수 있지만 세포 및 세포 외 부종은 종종^5,6에서발생합니다. 트립신, 췌장, 엘라스타제, 각질, 콜라게나아제, 프라나제, 디스파제 및 열량리신은 표피-진피 분리^4,7에사용된 효소이다. 트립신 및 기타 광범위한 스케일 의 성기 분석 효소는 37-40 °C에서 활성화되지만 표피 층의 해리를 방지하기 위해 주의 깊게 모니터링해야합니다. 디스파스는 라미나 덴사에서 표피를 갈라놓지만, 감기^4,8 또는 37°C^4,9에서더 짧은 시간점에서 분리를 위해 24h가 필요하다. 이러한 모든 기술의 제한 적인 특징은 조직 형태학의 잠재적인 중단 및 mRNA와 단백질의 무결성의 손실.

mRNA와 단백질의 무결성을 유지하기 위해, 피부 분리 방법은 짧은 시간 동안 추위에서 수행되어야한다. 염증 연구를 위한 피부 분리 기술을 평가할 때, 써모리신은 추운 온도^4에서진피로부터 표피를 분리하는 효과적인 효소이다. 열리신은 4°C에서 활성화되며, 라미나 루치다로부터 표피 이미데스모좀을 갈라지고, 표피를 1-3h^4,8,10내의 진피로부터 분리한다. 이 보고서의 목표는 염증성 중재자 및 신경 영양 요인에 대한 mRNA 및 단백질 수준을 검출하기 위해 진피에서 염증이 있는 쥐 표피의 분리를 위한 열립혈증의 사용을 최적화하는 것입니다. 여러 예비 보고서는^{11,12,13,14,15를}제시했다. 이 원고의 목적은 열분해신을 이용한 최적의 피부 분리 기법을 설명하고 염증의 1) 마커, 2) 인터류킨-6(IL-6) mRNA, 및 3) 신경 성장 인자(NGF) mRNA 및 단백질을 카라게난 유발 염증(C-II)^16,17의표피에서 시연하는 것이다. 완전한 Freund의 보조 모델을 사용하여 예비 보고서는 NGF mRNA및 단백질 수준이 염증¹⁵도중 일찌기 증가한다는 것을 나타냅니다. 마우스에서, oxazolone의 국소 적용을 이용한 피부 민감화는 시투^{혼성화(36)에서}사용하는 IL-6 mRNA에서 조기 상승을 일으킨다. IL-6과 NGF 는 모두 C-II^18,19에서연루되었지만 C-II의 급성 단계 동안 표피로부터 특히 IL-6 또는 NGF에 대한 mRNA 또는 단백질 수준을 설명하는 보고는 없었습니다.

열리 신 기술은 저렴 하 고 수행 하기 간단. 더욱이, 진피로부터 표피의 열리신 분리는^{염증(15)의}과정에서 염증 중과및 신경영양인의 mRNA, 서부 블롯 및 면역히스트토화학적 분석을 허용한다. 연구원은 쉽게 피부 염증의 전임상 및 임상 연구 모두에서이 기술을 사용할 수 있어야 합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 오클라호마 주립 대학 건강 과학 IACUC (#2016-03)의 동물 관리 지침을 따릅니다.

1. 카라게난 유발 염증 (C-II)

1. 남성 및/또는 여성 스프라그 Dawley 쥐 (200-250 g; 8-9 주 이전) 이소플루란 (또는 주 사용 가능한 마취).
2. 각막을 만지고 왼쪽 뒷발을 가볍게 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오. 동물이 적절하게 마취되면 각막이나 발 반응이 관찰되지 않습니다.
3. 피하로 오른쪽 글래브로우스, 힌드 발 100 μL 1% (w/v) 인산완충식식염(PBS)^20에서희석된 λ-carrageenan을 피하한다.
   1. 이 보고서에서 이소플루란이 없는 순진한 쥐와 같은 적절한 컨트롤이 사용되는지 확인하십시오. 예비 연구에 따르면 이소플루란의 유무에 관계없이 순진한 쥐는 표피 IL-6 및 NGF의 기저 식을 가지고 있음을 나타냅니다.
      참고: 순진한 쥐는 피하 식염수 또는 PBS가 국소 염증을 유발하기 때문에 염증 연구를 위한 바람직한^{대조군이다 23,37.}
4. 카라게난의 효과를 보장하기 위해 C-II 쥐의 부종을 평가한다(도 1)^20. 후드 발 중족골 두께를 캘리퍼로 측정하여 부종의 양을 결정합니다.
5. 6-12h에서, CO₂ (또는 주 사용 가능한 마취 과다 복용)로 쥐를 안락사시키고 날카로운 메스로 글래브로스 뒷발 피부 1mm x 2mm 조각을 잘라냅니다. 털이 많은 피부를 사용하는 경우 1mm x 2mm 의 피부를 절단하기 전에 면도하십시오.
   참고: 특정 연구에 따라 적절한 시간점을 선택해야 합니다.
6. 미세 절개 집게를 사용하여, 얼음에 미세 원심 분리기 튜브에 차가운 덜벡코의 수정 독수리 매체 (DMEM)의 1 mL로 피부를 전송하고 15-60 분 동안 차가운 유지.

2. 표피와 진피의 열리신 분리

1. 열리신을 준비하고 활성화합니다.
   1. pH = 8 (농도 500 μg /mL)에서 PBS의 10 mL에 지오바실러스 스티어 더모필러스 5 mg을 추가하여 열량분해용액을 준비합니다.
   2. 1.11g을 증류된 H_2O의10mL에 첨가하여 염화칼슘(CaCl₂ 무수)의 1M 용액을 준비한다.
   3. 열분해를 방지하기 위해 10 μL의 염화물 칼슘을 열분해 용액 10mL에 추가하십시오. 염화칼슘 최종 농도는 1mM입니다.
   4. 알리쿼트 1 mL의 활성 열리신10개의 우물로 얼음위에 24개의 잘 된 세포 배양 플레이트.
2. 열분해 효소 소화를 사용하여 표피를 진피와 분리하십시오.
   1. 미세 절 집게를 사용하여, 활성화 된 열량의 각 우물에 하나의 피부 샘플을 전송합니다. 열리 신 용액에 피부에 담그지 않도록 하십시오.
   2. 부드럽게 우물의 측면에 피부를 탭하여 모립용액에 떠있는 집게에서 피부 샘플을 방출하는 데 도움이됩니다.
   3. 지층 각질(외부 표피)을 위로 올려 놓고 진피를 아래로 향하게 하여 피부를 열분해액에 넣습니다. 진피가 아래로 향하거나 효과적인 분리가 일어나지 않는 것이 중요합니다.
      참고: 열량 분권에 대한 시간 의 양은 최종 사용자가 경험적으로 결정해야 합니다. 글래스브로스, 스프라그 Dawley 쥐의 뒷발 피부 (200-250 g; 8-9 주 이전)는 종종 분리를 위해 2.0-2.5 h가 필요합니다. 인큐베이션 시간은 종과 나이에 따라 달라질 것으로 예상됩니다.
   4. 열량에 적절한 잠복 시간 후, 마이크로 절개 집게를 사용하여 1 개의 피부 샘플을 7-8 mL의 감기 (4 °C) DMEM을 가진 6 웰 세포 배양 판의 우물로 옮춥니다. 이를 통해 진피에서 표피를 분리할 수 있는 더 많은 공간을 확보할 수 있습니다.
   5. DMEM에 피부를 담그고 있습니다.
   6. 국경에서 거의 반투명 표피가 관찰될 때까지 피부 둘레의 집게로 표피를 부드럽게 브러시합니다. 이 것을 달성할 수 없는 경우에, 또 다른 15-30 분 동안 열리 신 용액에 피부 견본을 반환합니다.
   7. 표피가 진피에서 눈에 띄게 분리되면 미세 절 집게로 표피와 진피를 조심스럽게 잡고 진피에서 표피를 매우 천천히 당깁니다.
   8. 격리된 표피의 투명도를 평가하고 광학적으로 일관되지 않도록 하십시오. 쥐 표피의 1mm x 2mm 샘플의 예를 보려면 그림 2를 참조하십시오. 투명도에 변화가 있는 경우 적절한 분리가 발생하지 않았습니다.
3. 표피와 진피의 분리 된 조각에서 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA)을 사용하여 열리 신을 비활성화합니다.
   주의: 표피와 진피에 남아 있는 열량은 여전히 활성화되어 있으며 비활성화되지 않으면 층을 손상시킬 수 있습니다.
   1. 0.5 M EDTA 스톡 솔루션을 준비합니다. 이렇게 하려면 0.93 g EDTA를 5mL의 이중 증류수에 천천히 넣습니다. 수산화 나트륨이 지울 때까지 용액에 추가합니다. 용액의 pH가 ~8.0인지 확인합니다.
   2. DMEM에서 5mM EDTA 솔루션을 만드세요. DMEM의 25mL에 0.5 M EDTA 스톡 솔루션0.25mL를 추가합니다.
   3. 분리된 표피와 진피를 5mM EDTA/DMEM 용액에 4°C에 30분 동안 배치하여 열분해진의 활성을 비활성화합니다.
4. 팅크토리술^{8, 9,10으로}표피를 평가한다.
   1. 표피의 일부를 10% 중립 포름알린, 4% 파라포름알데히드 또는 0.25% 파라포름알데히드에 0.8% 피크산 용액으로 실온(RT)에서 1시간 동안 반으로 수정한다.
   2. 고정 표피를 PBS에 10% 자당에 배치하여 RT에서 1시간 동안 교반합니다.
   3. 단면화를 위해 조직 포함 매트릭스에 표피를 동결. 젤라틴 코팅 유리 현미경 슬라이드에 저온 및 해동 마운트 섹션을 사용하여 14 μm 단면을 잘라.
   4. 90 s에 대 한 toluidine 블루 (TB; 10% 염화 나트륨에서 10% TB)의 작업 용액으로 슬라이드 워머와 얼룩에 건조 섹션. 수성 장착 매체로 커버립을 포지팅합니다.
   5. 50x-250x에서 밝은 필드 현미경 검사법을 가진 표피를 관찰하십시오.
      참고 : 적절한 분리가 발생한 경우, 표피는 진피에서 깨끗하게 분할되고 다섯 층이 검출됩니다 : 층 배세, 지층 스피노섬, 지층 과립, 지층 루시덤 및 지층 각막. 분리된 쥐 피부 표피의 예는 도 3에서볼 수 있다.

3. 단백질 추출 및 서부 얼룩 분석

1. 이전에 게시된^{프로토콜(21)을}사용하여 분리된 조직 샘플에서 서부 블로팅을 수행한다.
2. 용해 완충제의 50 μL에서 표피를 균질화 (25mM Tris HCl, pH = 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 1 % 트리톤 X-100) 인산염 및 프로테아제 억제제 칵테일을 함유.
3. 원심분리기 는 4°C에서 15분 동안 최대 속도로 시료를 측정하고 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도에 대한 상체를 평가한다.
4. SDS 젤에 단백질(30 μg)의 동등한 농도를 적재하고, 전기전도를 수행한 다음 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 옮긴다.
5. 2h용 5% 우유로 막막을 차단하고 1차 항체(마우스 안티NGF, E12, 1:1000)에서 하룻밤 동안 배양한다.
6. PBS로 3배 를 10분 동안 세척하고, 라벨이 부착된 이차 항체(예: 알칼리성 인스파타제 라벨이 부착된 토끼 안티마우스 IgG)로 인큐베이션을 한다.
7. 스캐닝 시스템을 사용하여 서부 블롯 신호(예: ECF 기판 및 이미징 플랫폼)를 평가합니다.

4. 면역 화학

1. 최적의 면역 반응성 고정에 조직 샘플을 배치 : 0.96 % (w / v) 피릭 산과 0.2 % (w / v) 포름 알데히드 0.1 M 나트륨 인산염 완충, pH = 7.3^21,22,23 RT에서 4 h. RT에서 하룻밤 사이에 PBS에서 10 % 자당으로 전송.
2. 조직^{섹션(21,22,23)에}표준 면역 조직 화학을 수행한다.
3. 동물의 표피를 포함 매트릭스의 단일 냉동 블록에 포함하고 극저온에 10-30 μm 섹션을 잘라. 젤라틴 코팅, 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트하고 2 시간 동안 37 ° C에서 건조.
4. PBS에서 3, 10분 헹구고 1차 항세라에서 24-96h의 배양을 위해 섹션을 세척하고, [예를 들어, 마우스 안티NGF(E12), 1:2000]과 토끼 항단백질 유전자 생성물 9.9(PGP 9.5, 1:2000)는 PBS에서 0.3% (w/v) 트리톤 X-100(PBS-T) PBS-T0.5% 소세루앨범(BSA) 및 0.5%의 폴리비닐(PVP)을 함유하고 있다.
5. 1차 항세럼 인큐베이션 후, PBS에서 10분 동안 3회 섹션을 헹구고, 알렉사 플루어 488 당나귀 안티래빗 IgG(1:1000)와 알렉사 플루어 555 당나귀 항마우스 IgG(1:1000)의 RT에서 1h를 PBS에서 3회 배양한다.
6. 10분 동안 PBS에서 세 번 헹구고 면역 형광의 변색을 지연시키는 비 퇴색 마운팅 배지가 있는 부착 커버립을 부착합니다.

5. RNA 절연 및 cDNA 합성

1. 피부^{샘플(21)에서}표준 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행한다. 페놀, 구아니딘 이소티오카네이트 용액을 사용하여 총 RNA를 분리한다.
2. 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사에 의해 보완적인 DNA 합성을 수행하십시오.
3. NGF 및 IL-6 증폭에 대해 다음 프라이머 시퀀스를 사용합니다.
   NGF (센스) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAAAAAACGGGG
   NGF (안티센스) – GTGAGTCCTGTTGAGAGATTGTACCATG
   IL-6 (센스) - GCAATTTGATTGTATGAACAGGATGC;
   IL-6 (안티센스) – GTAGAAAACGGAACTCCAAGACCAAGA가그
4. NGF와 IL-6 mRNA의 수준을 β-액틴 하우스키핑 유전자와 비교하십시오.
   β-액틴 (감각) - TGCGTGACATTAAAAGGTGTTATG
   β-액틴 (안티 센스) – 가ACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
5. qRT-PCR 시스템을 사용하여 열 사이클러및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 사용하여 질적 RT-PCR로 평가합니다.

결과

쥐 뒷발에 카라게난 주사는 발적과 부종^16,17과같은 염증의 고전적인 증상을 일으켰다. 뒷발의 붓기는 기계식^{캘리퍼(20)로}측정되었다. 발 두께의 기준값은 카라게난 치료 전에 각 쥐에 대해 얻어지고 6h 및 12h에서 다시 측정하였다. 발 두께는 기준값(도1)에비해 크게 증가하였다.

쥐 글래브로스...

토론

연구 결과에 따르면, 2.5h에 4°C에서 염화칼슘 1m로 PBS에서 써모리신(0.5 mG/mL)을 사용하여 진피로부터 쥐 뒷발 글래브루스 피부의 표피를 쉽게 분리하였다고 판단했다. 조직학적 평가는 표피가 지하 막의 진피로부터 분리되었고 표피 레테 능선이 손상되지 않았다는 것을 나타냈다. 열량은 그람 양성(Geo)바실러스 열염기 용해성 분석기^(24)에의해 생성된 세포 외 금속 loe...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
λ-carrageenan	Millipore Sigma	22049	Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107	For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous	Millipore Sigma	499609	Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium	Millipore Sigma	C0612	Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-31570	Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11966-025	To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid	Millipore Sigma	E6758	Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase	Promega	M1701	For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365944	For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5	Cedarlane Labs	CL7756AP	For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat	Charles River	Strain Code 400	Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix	Thermo Fisher Scientific	1310TS	Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4472908	For RT-PCR analysis
Thermolysin	Millipore Sigma	T7902	From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue	Millipore Sigma	89640	For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	For total RNA extraction for RTPCR