JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол отделения эпидермиса от дермы для оценки выработки медиатора воспалительного средства. После воспаления эпидермис задней лапы крыс отделяется от дермы термолизином при 4 °C. Затем эпидермис используется для анализа мРНК методом ОТ-ПЦР и оценки белка с помощью вестерн-блотт и иммуногистохимии.

Аннотация

Простые в использовании и недорогие методы необходимы для определения специфического для участка производства воспалительных медиаторов и нейротрофиных препаратов во время повреждения кожи, воспаления и / или сенсибилизации. Целью этого исследования является описание протокола разделения эпидермиса и дермы с использованием термолизина, протеиназы, которая активна при 4 ° C. Чтобы проиллюстрировать эту процедуру, крыс Sprague Dawley анестезируют, а правым задним лапам вводят каррагинан. Через шесть и двенадцать часов после инъекции крыс с воспалением и наивных крыс усыпляют, а кусок задней лапы, гламурной кожи помещают в холодную модифицированную орлиную среду Дульбекко. Затем эпидермис отделяется на базальной мембране от дермы термолизином в PBS с хлоридом кальция. Далее дерму закрепляется микродиссекционными щипцами, а эпидермис аккуратно дразнят. Толуидиновым синим окрашиванием участков тканей показывают, что эпидермис отделяется чисто от дермы у базальной мембраны. Все клеточные слои кератиноцитов остаются нетронутыми, а эпидермальные гребни рете вместе с вмятинами от кожных сосочков отчетливо наблюдаются. Качественная и в режиме реального времени ОТ-ПЦР используется для определения фактора роста нервов и уровней экспрессии интерлейкина-6. Вестерн-блоттинг и иммуногистохимия, наконец, выполняются для обнаружения количества фактора роста нервов. Этот отчет иллюстрирует, что переваривание холодного термолизина является эффективным методом отделения эпидермиса от дермы для оценки изменений мРНК и белка во время воспаления.

Введение

Оценка медиаторов воспаления и нейротрофических факторов со стороны кожи может быть ограничена из-за неоднородности типов клеток, обнаруженных в воспаленной дерме и эпидермисе1,2,3. Недавно было рассмотрено несколько ферментов, химических, термических или механических методов, включающих разделение двух слоев или для выполнения диссоциации клеток для оценки4. Кислота, щелочь, нейтральная соль и тепло могут быстро отделить эпидермис от дермы, но клеточный и внеклеточный отек часто возникает5,6. Трипсин, панкреатин, эластаза, кератиназа, коллагеназа, проназа, диспаза и термолизин являются ферментами, которые использовались для эпидермально-дермального разделения4,7. Трипсин и другие широкомасштабные протеолитические ферменты активны при 37-40 °C, но должны тщательно контролироваться, чтобы предотвратить диссоциацию эпидермальных слоев. Рассеивание расщепляет эпидермис на пластинке денса, но требует 24 ч для отделения в холодных4,8 или более коротких временных точках при 37 °C4,9. Ограничивающей особенностью всех этих методик является потенциальное нарушение морфологии тканей и потеря целостности мРНК и белка.

Для поддержания целостности мРНК и белка метод отделения кожи следует проводить на холоде в течение короткого периода времени. При оценке методов разделения кожи для исследований воспаления термолизин является эффективным ферментом для отделения эпидермиса от дермы при низких температурах4. Термолизин активен при 4 °C, расщепляет эпидермальные гемидемосомы от lamina lucida и отделяет эпидермис от дермы в течение 1–3 ч4,8,10. Целью данного отчета является оптимизация использования термолизина для отделения воспаленного эпидермиса крыс от дермы для выявления уровней мРНК и белка для медиаторов воспаления и нейротрофических факторов. Было представлено несколько предварительных докладов11,12,13,14,15. Целью данной рукописи является описание оптимальной методики разделения кожи с использованием термолизина и демонстрация обнаружения 1) маркеров воспаления, 2) мРНК интерлейкина-6 (IL-6) и 3) мРНК и белка фактора роста нервов (NGF) в эпидермисе крыс с каррагинаном-индуцированным воспалением (C-II)16,17. Предварительный отчет с использованием полной адъювантной модели Фройнда показывает, что уровни мРНК и белка NGF увеличиваются на ранней стадии во время воспаления15. У мышей сенсибилизация кожи при местном применении оксазолона вызывает ранний подъем мРНК IL-6 с использованием гибридизации in situ36. Как IL-6, так и NGF были замешаны в C-II18,19,но не было сообщений, описывающих уровни мРНК или белка для IL-6 или NGF конкретно из эпидермиса во время острых стадий C-II.

Техника термолизина недорогая и простая в исполнении. Кроме того, отделение термолизинов эпидермиса от дермы позволяет проводить мРНК, вестерн-блот и иммуногистохимический анализ медиаторов воспаления и нейротрофических факторов в процессе воспаления15. Исследователи должны быть в состоянии легко использовать эту технику как в доклинических, так и в клинических исследованиях воспаления кожи.

протокол

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными Центра медицинских наук Университета штата Оклахома IACUC (#2016-03).

1. Каррагинан-индуцированное воспаление (C-II)

  1. Обезболить самцов и/или самок крыс Sprague Dawley (200–250 г; 8–9 недель) изофлураном (или инъекционным анестетиком).
  2. Проверьте глубину анестезии, коснувшись роговицы и слегка зажав левую заднюю лапу. Когда животное соответствующим образом обезболивается, реакции роговицы или лапы не наблюдается.
  3. Подкожно вводят в правую глянку заднюю лапу со 100 мкл 1% (мас./об.) λ-каррагинана, разведенного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)20.
    1. Убедитесь, что используются соответствующие средства контроля, такие как наивные крысы без изофлурана в этом отчете. Предварительные исследования показывают, что наивные крысы с изофлураном или без него имеют одинаковую базальную экспрессию эпидермального IL-6 и NGF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наивные крысы являются предпочтительными элементами контроля для исследований воспаления, поскольку подкожно-физиологический раствор или PBS вызывают местное воспаление23,37.
  4. Оцените отек У крыс С-II, чтобы гарантировать эффективность каррагинана(Рисунок 1)20. Определите величину отека, измерив толщину плюсневой кисти задней лапы суппортами.
  5. Через 6–12 ч усыпляет крыс с ПОМОЩЬЮCO2 (или инъекционной передозировки анестетика) и срезает острым скальпелем куски глазчатой кожи задних лап размером 1 мм x 2 мм. Если используется волосатая кожа, то сбривайте ее перед срезанием кусочков кожи 1 мм х 2 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что соответствующие временные точки выбраны в соответствии с конкретными исследованиями.
  6. Используя микродиссекционные щипцы, переведите кожу в 1 мл холодной модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) в микроцентрифужной трубке на льду и держите в холодном виде в течение 15–60 минут.

2. Термолизиновая сепарация эпидермиса и дермы

  1. Приготовьте и активируйте термолизин.
    1. Готовят раствор термолизина, добавляя 5 мг Geobacillus stearothermophilus к 10 мл PBS, при рН = 8 (концентрация 500 мкг/мл).
    2. Готовят 1 М раствор кальция хлорида (CaCl2 безводный), добавляя 1,11 г в 10 мл дистиллированногоH2O.
    3. Для предотвращения аутолиза термолизина добавляют 10 мкл хлорида кальция к 10 мл раствора термолизина. Конечная концентрация хлористого кальция составит 1 мМ.
    4. Aliquot 1 мл активированного термолизина в 10 скважин 24-скважинной клеточной культуральной пластины на льду.
  2. Используйте фермент термолизин для отделения эпидермиса от дермы.
    1. Используя микродиссекционные щипцы, перенесите по одному образцу кожи в каждую скважину активированного термолизина. Следите за тем, чтобы не погружать кожу в раствор термолизина.
    2. Осторожно постучите по коже на боковой стороне колодца, чтобы помочь освободить образец кожи из щипцов, чтобы плавать на растворе термолизина.
    3. Всплывайте кожу в раствор термолизина роговым слоем (наружным эпидермисом) стороной вверх и дермой вниз. Очень важно, чтобы дерма была обращена вниз, иначе эффективное разделение не произойдет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество времени для инкубации термолизина должно быть определено эмпирически конечным пользователем. Глабрус, кожа задних лап у крыс Sprague Dawley (200–250 г; 8–9 недель) часто требует 2,0–2,5 ч для разделения. Ожидается, что время инкубации будет варьироваться в зависимости от вида и возраста.
    4. После соответствующего времени инкубации в термолизине используют микродиссекционные щипцы для переноса одного образца кожи в колодец из 6-й ямочной клеточной культуры с 7-8 мл холодного (4 °C) DMEM. Это дает больше места для отделения эпидермиса от дермы.
    5. Погрузите кожу в DMEM.
    6. Аккуратно расчесывайте эпидермис щипцами по периметру кожи до тех пор, пока на границах не будет наблюдаться почти полупрозрачный эпидермис. Если этого достичь не удается, верните образец кожи в раствор термолизина еще на 15–30 мин.
    7. Как только эпидермис заметно отделится от дермы, то аккуратно проведите и эпидермис, и дерму микродиссекционными щипцами и очень медленно вытяните эпидермис из дермы.
    8. Оцените полупрозрачные условия изолированного эпидермиса и убедитесь, что он оптически согласован. См. рисунок 2 для примера образца эпидермиса крыс размером 1 мм x 2 мм. Если есть вариация полупрозрачности, то правильного разделения не произошло.
  3. Инактивировать термолизин с помощью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в отделенных кусочках эпидермиса и дермы.
    ВНИМАНИЕ: Термолизин, который остается в эпидермисе и дерме, все еще активен и может повредить слои, если не инактивирован.
    1. Приготовьте стоковый раствор 0,5 млн ЭДТА. Для этого медленно добавьте 0,93 г ЭДТА в 5 мл двойной дистиллированной воды. Добавьте гидроксид натрия в раствор до тех пор, пока он не очистится. Убедитесь, что pH раствора составляет ~8,0.
    2. Сделайте раствор ЭДТА 5 мМ в DMEM. Добавьте 0,25 мл 0,5 мл раствора ЭДТА к 25 мл ДМЭМ.
    3. Поместите отделенный эпидермис и дерму в раствор ЭДТА/ДМЭМ 5 мМ при 4 °C в течение 30 мин, чтобы дезактивировать активность термолизина.
  4. Оценивают эпидермис с помощью тинкториальной гистологии8,9,10.
    1. Зафиксируйте часть эпидермиса в 10% нейтральном формалине, 4% параформальдегиде или 0,25% параформальдегиде с 0,8% раствором пикриновой кислоты в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) с перемешиванием.
    2. Поместите фиксированный эпидермис в 10% сахарозу в PBS на 1 ч при РТ с перемешиванием.
    3. Заморозьте эпидермис в тканевом встраиваемом матриксе для сечения. Вырежьте поперечные сечения 14 мкм с помощью криостата и оттепельных секций на стеклянных микроскопических стеклах с желатиновым покрытием.
    4. Сухие срезы на слайде грелкой и окрашивают рабочим раствором толуидина синего (ТБ; 10% ТБ в 1% хлориде натрия) в течение 90 с. Обложить крышки водной монтажной средой.
    5. Наблюдают эпидермис с помощью микроскопии яркого поля в 50–250x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если произошло правильное разделение, эпидермис будет отделен чисто от дермы, и будут обнаружены пять слоев: слой базальный, слой спинозума, гранулезный слой, луцидумный слой и роговой слой. Пример отделенного эпидермиса из кожи крыс можно увидеть на рисунке 3.

3. Экстракция белка и анализ вестерн-блот

  1. Выполняют вестерн-блоттинг на разделенных образцах тканей с использованием ранее опубликованного протокола21.
  2. Гомогенизировать эпидермис в 50 мкл лизисного буфера (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерина и 1% тритона X-100), содержащего коктейль ингибиторов фосфатазы и протеазы.
  3. Центрифуги пробуют на максимальной скорости в течение 15 мин при 4 °C и оценивают супернатант на концентрацию белка с помощью набора для анализа белка.
  4. Загрузите равные концентрации белка (30 мкг) на гели SDS, выполните электрофорез, а затем перенесите белки на нитроцеллюлозные или PVDF-мембраны.
  5. Блокируют мембраны с 5% молоком в течение 2 ч и инкубируют на ночь в первичных антителах (мышиный анти-NGF, E12, 1:1000).
  6. Промыть 3x PBS с 0,3% анимацией в течение 10 мин каждый и инкубировать с меченым вторичным антителом (например, щелочной фосфатазой, меченой кроликом против мыши IgG).
  7. Используйте систему сканирования для оценки сигнала вестерн-блот (например, подложку ECF и платформу визуализации).

4. Иммуногистохимия

  1. Поместите образцы тканей в фиксатор для оптимальной иммунореактивности: 0,96% (мас./об.) пикриновой кислоты и 0,2% (мас./об.) формальдегида в 0,1 М фосфатно-натриевого буфера, рН =7,3 21,22,23 в течение 4 ч при РТ. Переведите в 10% сахарозу в PBS на ночь при 4 °C.
  2. Выполняют стандартную иммуногистохимию на участкахтканей 21,22,23.
  3. Встраивают эпидермис животных в один замороженный блок в встраиваемую матрицу и вырезают 10–30 мкм участков на криостате. Установите секции на стеклянные стекла микроскопа с желатиновым покрытием и высушите при 37 °C в течение 2 ч.
  4. Промывайте секции в течение трех, 10 мин полосканий в PBS и инкубируют в течение 24-96 ч в первичных антисыворотках, [например, мышиный анти-NGF (E12, 1:2000)] и антибелковый генный продукт кролика 9,9 (PGP 9,5, 1:2000), разведенный в PBS, содержащий 0,3% (мас./об.) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T с 0,5% бычим сывороточным альбумином (BSA) и 0,5% поливинилпирролидоном (PVP).
  5. После первичной инкубации антисыворотки промыть секции три раза в течение 10 мин в PBS и инкубировать 1 ч при RT в Alexa Fluor 488 ослик против кролика IgG (1:1000) и Alexa Fluor 555 ослик против мыши IgG (1:1000), разведенных в PBS-T.
  6. Промыть участки три раза в PBS в течение 10 мин и прикрепить крышки с невядающей монтажной средой, чтобы замедлять затухание иммунофлуоресценции.

5. Выделение РНК и синтез кДНК

  1. Выполняют стандартную полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) на образцах кожи21. Выделяют общую РНК с помощью фенола, раствора изотиоцианата гуанидина.
  2. Осуществляют комплементарный синтез ДНК с помощью реверскриптазы вируса лейкоза муренимолемии Молони.
  3. Используйте следующие последовательности праймеров для усиления NGF и IL-6:
    NGF (Смысл) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
    NGF (Антисмысловый) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
    Ил-6 (Смысл) - ГКААТТКТГАТГАТГАТГААКАКГАТГАГГК;
    Ил-6 (Антисмысловый) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG
  4. Сравните уровни NGF и IL-6 мРНК с геном β-актина:
    β-АКТИН (смысл) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
    β-ACTIN (Антисмысловый) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
  5. Оценка с помощью качественной ОТ-ПЦР с использованием теплового циклира и количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) с использованием системы qRT-PCR.

Результаты

Инъекция каррагинана в заднюю лапу крысы вызывала классические симптомы воспаления, такие как покраснение и отек16,17. Набухание задней лапы измеряли механическими суппортами20. Исходное значение толщины лапы было получено для каждой крысы п?...

Обсуждение

Исследование определило, что эпидермис глазчатой кожи задней лапы крысы легко отделялся от дермы с помощью термолизина (0,5 мГ/мл) в PBS с 1 мМ хлорида кальция при 4 °C в течение 2,5 ч. Гистологическая оценка показала, что эпидермис был отделен от дермы на базальной мембране и что эпидермальные...

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают информацию.

Благодарности

Финансирование этого исследования было предоставлено Национальными институтами здравоохранения NIH-AR047410 (KEM)

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
λ-carrageenanMillipore Sigma22049Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific4351107For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrousMillipore Sigma499609Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting MediumMillipore SigmaC0612Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-31570Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific11966-025To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acidMillipore SigmaE6758Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptasePromegaM1701For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12)Santa Cruz Biotechnologysc-365944For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5Cedarlane LabsCL7756APFor intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley RatCharles RiverStrain Code 400Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding MatrixThermo Fisher Scientific1310TSTissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA24811For RT-PCR analysis
SYBR Select Master MixThermo Fisher Scientific4472908For RT-PCR analysis
ThermolysinMillipore SigmaT7902From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine BlueMillipore Sigma89640For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026For total RNA extraction for RTPCR

Ссылки

  1. Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
  2. Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
  3. Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
  4. Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
  5. Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
  6. Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
  7. Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
  8. Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
  9. Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
  10. Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
  11. Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
  12. Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
  13. Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
  14. Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
  15. Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
  16. Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
  17. Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
  18. Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
  19. Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
  20. Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
  21. Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
  22. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
  23. Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
  24. van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
  25. Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
  26. Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
  27. Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
  28. Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
  29. Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
  30. Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  31. Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
  32. Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
  33. Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
  34. Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
  35. Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
  36. Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
  37. Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1756qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены