Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להפרדת אפידרמיס מדרמיס להערכת ייצור מתווך דלקתי. בעקבות דלקת, אפידרמיס כף רגל אחורית חולדה מופרדת מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב 4 °C (50 °F). האפידרמיס משמש לאחר מכן לניתוח mRNA על ידי RT-PCR והערכה של חלבונים על ידי כתם מערבי ואימונוהיסטוכימיה.

Abstract

טכניקות קלות לשימוש וזולות נדרשות כדי לקבוע את הייצור הספציפי לאתר של מתווכים דלקתיים ונוירוטרופינים במהלך פגיעה בעור, דלקת ו/או רגישות. מטרת המחקר היא לתאר פרוטוקול הפרדה אפידרמלי-עורי באמצעות תרמוליסין, חלבון הפעיל ב 4 °C (70 °F). כדי להמחיש הליך זה, חולדות ספראג דולי הן מרדים, וכפות אחוריות ימניות מוזרקות לקרגינן. שש ו-12 שעות לאחר ההזרקה, חולדות עם דלקת וחולדות תמימות מורדמות, וחתיכת כף רגל אחורית, עור גלאברוי ממוקם במדיום הנשר המעודכן של דולבקו. האפידרמיס מופרד לאחר מכן בקרום המרתף מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב- PBS עם סידן כלורי. לאחר מכן, הדרמיס מאובטח על ידי מלקחיים זעירים, והאפידרמיס מתגרה בעדינות. כתמים כחולים טולואידין של קטעי רקמות מראים כי האפידרמיס מופרדת בצורה נקייה מן הדרמיס בקרום המרתף. כל שכבות תאי הקרטינוציט נשארות שלמות, ורכסי הרטי האפידרמלי יחד עם חריצים מפפילות עוריות נצפים בבירור. איכותי בזמן אמת RT-PCR משמש כדי לקבוע גורם גדילה עצבי ורמות ביטוי interleukin-6. סופג מערבי ואימונוהיסטוכימיה מבוצעים סוף סוף כדי לזהות כמויות של גורם גדילה עצבי. דו"ח זה ממחיש כי עיכול תרמוליצין קר היא שיטה יעילה להפריד אפידרמיס מדרמיס להערכת mRNA ושינויים בחלבון במהלך דלקת.

Introduction

הערכה של מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים מהעור יכולה להיות מוגבלת בשל ההטרוגניות של סוגי תאים שנמצאו בדמיס ואפידרמיס מודלקים1,2,3. מספר אנזימים, טכניקות כימיות, תרמיות או מכניות הכוללות הפרדה בין שתי השכבות או לביצוע דיסוציאציה של תאים להערכה נבדקו לאחרונה4. חומצה, אלקלי, מלח ניטרלי, וחום יכול להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס במהירות, אבל נפיחות תאית חוץ תאית מתרחשת לעתים קרובות5,6. טריפסין, לבלב, אלסטאז, קרטינאז, קולגנאז, פרונאז, דיספאז ותרמולצין הם אנזימים ששימשו להפרדה אפידרמלית-עורית4,7. טריפסין ואנזימים פרוטאוליטיים בקנה מידה רחב אחרים פעילים ב 37-40 °C (37 °F), אבל חייב להיות במעקב בקפידה כדי למנוע ניתוק של שכבות אפידרמיס. Dispase מבקע את האפידרמיס בדנסה לאמינה, אבל דורש 24 שעות להפרדה בקור4,8 או נקודות זמן קצרות יותר ב 37 °C4,9. תכונה מגבילה של כל הטכניקות האלה היא ההפרעה הפוטנציאלית של מורפולוגיה של רקמות ואובדן שלמות של mRNA וחלבון.

כדי לשמור על שלמות ה- mRNA והחלבון, יש לבצע שיטת הפרדת עור בקור לפרק זמן קצר. בהערכת טכניקות הפרדת העור למחקרי דלקת, thermolysin הוא אנזים יעיל להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס בטמפרטורות קרות4. תרמוליסין פעיל ב 4 °C (55 °F), מבקע את המידזמום האפידרמלי מן למינה לוסידה, ומפריד את האפידרמיס מן הדרמיס בתוך 1-3 שעות4,8,10. מטרת דו"ח זה היא לייעל את השימוש התרמוליסין להפרדת אפידרמיס חולדה מודלק מדרמיס כדי לזהות רמות mRNA וחלבון עבור מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים. מספר דו"חות ראשוניים הוצגו11,12,13,14,15. מטרת כתב יד זה היא לתאר טכניקה אופטימלית להפרדת העור באמצעות תרמוליסין ולהדגים את הזיהוי של 1) סמנים של דלקת, 2) אינטרלוקין-6 (IL-6) mRNA, ו -3) גורם גדילה עצבי (NGF) mRNA וחלבון באפידרמיס של חולדות עם דלקת הנגרמת על ידי קרגינן (C-II)16,17. דו"ח ראשוני באמצעות מודל אדג'ובנט מלא של פרוינד מציין כי NGF mRNA ורמות חלבון להגדיל מוקדם במהלך דלקת15. בעכברים, רגישות העור עם היישום אקטואלי של oxazolone גורם לעלייה מוקדמת IL-6 mRNA באמצעות הכלאה במקום36. IL-6 ו-NGF היו מעורבים ב-C-II18,19, אך לא היו דיווחים המתארים את רמות ה-MRNA או החלבון עבור IL-6 או NGF במיוחד מהאפידרמיס בשלבים החריפים של C-II.

טכניקת התרמוליסין זולה ופשוטה לביצוע. יתר על כן, הפרדת התרמוליסין של האפידרמיס מדרמיס מאפשרת mRNA, כתם מערבי, וניתוח אימונוהיסטוכימי של מתווכים דלקתיים וגורמים נוירוטרופיים במהלך תהליך של דלקת15. חוקרים צריכים להיות מסוגלים בקלות להשתמש בטכניקה זו הן במחקרים פרה קליניים והן במחקרים קליניים של דלקת בעור.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (#2016-03).

1. דלקת הנגרמת על ידי קרגינן (C-II)

  1. מרדים חולדות ספראג דולי (200-250 גרם; 8-9 שבועות) עם איזופלוראן (או הרדמה להזרקה).
  2. בדוק את עומק ההרדמה על ידי נגיעה בקרנית וצביטה קלה של כף רגלו האחורית השמאלית. כאשר החיה היא מרדים כראוי, לא תהיה תגובה קרנית או כף רגל תצפה.
  3. תת עורית להזריק את גלברו הימני, כף רגל אחורית עם 100 μL של 1% (w /v) λ-carrageenan מדולל תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)20.
    1. ודא כי פקדים מתאימים משמשים, כגון חולדות תמימות ללא איזופלוראן בדו"ח זה. מחקרים ראשוניים מצביעים על כך שלעכברושים נאיביים עם או בלי איזופלוראן יש את אותו ביטוי בזאלי של אפידרמיס IL-6 ו- NGF.
      הערה: חולדות תמימות מועדפות לבקרה למחקרי דלקת מאז מלוחים תת עוריים או PBS לגרום דלקת מקומית23,37.
  4. להעריך את המצקת של חולדות C-II כדי להבטיח את האפקטיביות של carrageenan (איור 1)20. לקבוע את כמות המכשך על ידי מדידת עובי metatarsal כף רגל אחורית עם calipers.
  5. ב 6-12 שעות, להרדים חולדות עם CO 2 (או מנת יתרהרדמה להזרקה) לחתוך 1 מ"מ x 2 מ"מ חתיכות של עור כף רגל אחורית גלאברו עם אזמל חד. אם נעשה שימוש בעור שעיר, ואז לגלח אותו לפני חיתוך 1 מ"מ x 2 מ"מ חתיכות של העור.
    הערה: ודא כי נקודות הזמן המתאימות נבחרות על פי המחקרים הספציפיים.
  6. באמצעות מלקחיים microdissection, להעביר את העור לתוך 1 מ"ל של מדיום נשר שונה של Dulbecco קר (DMEM) בצינור microcentrifuge על קרח ולשמור על קור במשך 15-60 דקות.

2. הפרדת תרמוליסין של אפידרמיס ודרמיס

  1. הכן והפעל תרמוליסין.
    1. הכן פתרון של תרמוליזין, על ידי הוספת 5 מ"ג של Geobacillus stearothermophilus ל 10 מ"ל של PBS, ב pH = 8 (ריכוז 500 מיקרוגרם / מ"ל).
    2. הכן פתרון 1 M של סידן כלורי (CaCl2 נטול מים) על ידי הוספת 1.11 גרם לתוך 10 מ"ל של H2O מזוקק.
    3. כדי למנוע אוטוליזה של תרמוליזין, להוסיף 10 μL של סידן כלורי ל 10 מ"ל של פתרון תרמוליזין. הריכוז הסופי של סידן כלוריד יהיה 1 מ"מ.
    4. Aliquot 1 מ"ל של תרמוליזין מופעל לתוך 10 בארות של צלחת תרבית תאים 24 היטב על קרח.
  2. השתמש עיכול אנזים תרמוליסין כדי להפריד את האפידרמיס מן הדרמיס.
    1. באמצעות מלקחיים microdissection, להעביר דגימת עור אחת לתוך כל באר של תרמוליסין פעיל. הקפד לא לטבול את העור בתמיסת התרמוליסין.
    2. הקש בעדינות על העור בצד הבאר כדי לסייע בשחרור דגימת העור מהמלקחיים כדי לצוף על תמיסת התרמוליסין.
    3. לצוף את העור לתוך פתרון התרמוליסין עם קרנית השכבה (אפידרמיס חיצוני) צד למעלה דרמיס עם הפנים כלפי מטה. זה קריטי כי הדרמיס פונה כלפי מטה, או ההפרדה האפקטיבית לא תתרחש.
      הערה: משך הזמן לדגירה תרמוליסין חייב להיקבע אמפירית על ידי משתמש הקצה. עור גלברו, כף רגל אחורית מחולדות ספראג דולי (200-250 גרם; 8-9 שבועות) דורש לעתים קרובות 2.0-2.5 שעות להפרדה. זמן הדגירה צפוי להשתנות עם מינים וגיל.
    4. לאחר זמן הדגירה המתאים התרמוליסין, השתמש במלקחיים מיקרו-חיתוניים כדי להעביר דגימת עור אחת לבאר של צלחת תרבית תאים 6 היטב עם 7-8 מ"ל של DMEM קר (4 °C). זה מאפשר יותר מקום להפרדת האפידרמיס מהדרמיס.
    5. לטבול את העור לתוך DMEM.
    6. מברישים בעדינות את האפידרמיס עם המלקחיים סביב היקף העור עד שנצפית האפידרמיס הכמעט שקוף בגבולות. אם זה לא ניתן להשיג, להחזיר את דגימת העור לפתרון thermolysin עוד 15-30 דקות.
    7. ברגע שהאפידרמיס נפרד באופן ניכר מהדרמיס, אז החזק בזהירות גם את האפידרמיס וגם את הדרמיס עם מלקחיים זעירים ולאט לאט למשוך את האפידרמיס מהדרמיס.
    8. להעריך את התחלות של האפידרמיס המבודד ולוודא שזה עקבי אופטית. ראו איור 2 לדוגמה של דגימה של 1 מ"מ x 2 מ"מ של אפידרמיס עכברושים. אם יש שונות בתחלוץ, אז ההפרדה הנכונה לא התרחשה.
  3. לאימת תרמוליסין באמצעות חומצה אתילנדימינטטראקטית (EDTA) בחתיכות המופרדות של אפידרמיס ודרמיס.
    זהירות: התרמוליסין שנותר באפידרמיס ובדרמיס עדיין פעיל ועלולים לפגוע בשכבות אם לא מומתים.
    1. הכן פתרון מניית EDTA 0.5 M. כדי לעשות זאת, לאט להוסיף 0.93 גרם EDTA לתוך 5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים. מוסיפים נתרן הידרוקסיד לתמיסה עד שהוא מנקה. ודא כי ה- pH של הפתרון הוא ~ 8.0.
    2. הפוך פתרון EDTA 5 mM ב- DMEM. הוסף 0.25 מ"ל של פתרון מניית EDTA 0.5 M ל- 25 מ"ל של DMEM.
    3. מניחים את האפידרמיס והדרמיס המופרדים לפתרון EDTA/DMEM של 5 מ"מ ב-4 °C (30 דקות) כדי להשבית את הפעילות של התרמו-ליסין.
  4. להעריך את האפידרמיס עם היסתולוגיה טינקטולית8,9,10.
    1. תקן חלק של האפידרמיס בפורמלין נייטרלי 10%, 4% paraformaldehyde, או 0.25% paraformaldehyde עם 0.8% פתרון חומצה פיפרית עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר (RT) עם עצבנות.
    2. מניחים את האפידרמיס הקבוע ב 10% סוכרוז ב PBS במשך 1 שעות ב RT עם תסיסה.
    3. להקפיא את האפידרמיס במטריצה הטמעת רקמות לחתך. חותכים חתך 14 מיקרומטר חתך באמצעות קריוסטט ולהפשיר-הרכבה קטעים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופה ג'לטין.
    4. חלקים יבשים על מחמם וכתם שקופיות עם פתרון עובד של כחול טולואידין (TB; 10% TB ב 1% נתרן כלורי) עבור 90 s. Appose מכסה את ההפלות עם מדיום הרכבה מימי.
    5. שימו לב לאפידרמיס עם מיקרוסקופיית ברייטפילד ב-50x-250x.
      הערה: אם התרחשה הפרדה נכונה, האפידרמיס יחולק בצורה נקייה מהדרמיס וחמש השכבות יזוהו: בזל רובדים, ספינוסום רובדים, גרנולוזום שכבה, רובד מחזיר אור, ושכבת קרנית. דוגמה לאפידרמיס של עור חולדה מופרד ניתן לראות באיור 3.

3. מיצוי חלבונים וניתוח כתם מערבי

  1. בצע כתמים מערביים על דגימות רקמה מופרדת באמצעות פרוטוקול שפורסם בעבר21.
  2. הומוגניזציה האפידרמיס ב 50 μL של מאגר תמוגה (25mM טריס HCl, pH = 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% גלילצל, ו 1% טריטון X-100) המכיל פוספטאז וקוקטייל מעכב פרוטאז.
  3. דגימות צנטריפוגות במהירות מקסימלית למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ולהעריך את הסופר-נט לריכוז חלבונים באמצעות ערכת בדיקת חלבונים.
  4. לטעון ריכוזים שווים של חלבון (30 מיקרוגרם) על ג'ל SDS, לבצע אלקטרופורזה, ולאחר מכן להעביר חלבונים חנקן או PVDF ממברנות.
  5. חסום ממברנות עם 5% חלב ל-2 שעות ודגרה בין לילה בנוגדן העיקרי (עכבר נגד NGF, E12, 1:1000).
  6. לשטוף 3x עם PBS עם 0.3% tween במשך 10 דקות כל אחד ודגורה עם נוגדן משני שכותרתו (למשל, אלקליין פוספטאז שכותרתו ארנב נגד עכבר IgG).
  7. השתמש במערכת סריקה כדי להעריך אות כתם מערבי (למשל, מצע ECF ופלטפורמת הדמיה).

4. אימונוהיסטוכימיה

  1. מקם דגימות רקמה בתיקון עבור חיסוניות אופטימלית: 0.96% (w /v) חומצה פיצרית ו 0.2% (w/v) פורמלדהיד ב 0.1 M נתרן פוספט חוצץ, pH = 7.321,22,23 עבור 4 שעות ב RT. להעביר ל 10% סוכרוז ב PBS לילה ב 4 °C .
  2. בצע אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית על קטעי הרקמה21,22,23.
  3. הטמעת האפידרמיס מבעלי חיים לתוך בלוק קפוא אחד במטריצה הטמעה לחתוך 10-30 מקטעים מיקרומטר על cryostat. הר את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופה ג'לטין ויבש ב 37 °C (50 °F) במשך 2 שעות.
  4. לשטוף מקטעים במשך שלוש, 10 דקות שטיפות PBS ודגרה עבור 24-96 שעות באנטיזרים ראשוני, [למשל, עכבר נגד NGF (E12, 1:2000)] ומוצר גנים נגד חלבונים ארנב 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) מדולל ב- PBS המכיל 0.3% (w/v) טריטון X-100 (PBS-T) PBS-T עם 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA) ו-0.5% פוליווינילפירולידון (PVP).
  5. לאחר הדגירה העיקרית נגד קדם, יש לשטוף סעיפים שלוש פעמים במשך 10 דקות ב-PBS ולדגירה 1 שעות ב-RT באלכסה פלור 488 חמור נגד ארנב IgG (1:1000) ואלכסה פלור 555 חמור נגד עכבר IgG (1:1000) מדולל PBS-T.
  6. יש לשטוף חלקים שלוש פעמים ב-PBS למשך 10 דקות ולהדביק כיסויים עם מדיום הרכבה לא דועך כדי לפגום בדעיכת אימונופלואורסצנטיות.

5. בידוד RNA וסינתזה cDNA

  1. בצע תגובת שרשרת פולימראז פולימראז הפוך סטנדרטית (RT-PCR) על דגימות העור21. לבודד RNA הכולל באמצעות פנול, פתרון איזוטיוצינאט guanidine.
  2. בצע סינתזת DNA משלימה על ידי Moloney מורין לוקמיה וירוס הפוך transcriptase.
  3. השתמש ברצפי הפריימר הבאים להגברת NGF ו- IL-6:
    NGF (Sense) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
    NGF (אנטיסנס) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
    IL-6 (Sense) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
    IL-6 (אנטיסנס) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGAGAGAG
  4. השווה את הרמות של NGF ו- IL-6 mRNA לגן משק הבית β-אקטין:
    β-ACTIN (Sense) - TGCGTGACATTAAAGAAGAAGCTGTGCTATG
    β-ACTIN (אנטיסנס) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
  5. להעריך עם איכות RT-PCR באמצעות רוכב אופניים תרמי וכמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) באמצעות מערכת qRT-PCR.

תוצאות

הזרקת קרגינן לתוך כף רגלו האחורית של העכברוש גרמה לתסמינים קלאסיים של דלקת כגון אדמומיות ובצקת16,17. הנפיחות של כף רגל האחורית נמדדה עם calipers מכני20. ערך בסיסי של עובי כף רגל הושג עבור כל חולדה לפני טיפול carrageenan ונמדד שוב ב 6 שעות ו 12 שעות. עובי כף רגל?...

Discussion

המחקר קבע כי האפידרמיס של עור גלברוס כף רגל אחורית חולדה הופרד בקלות דרמיס באמצעות thermolysin (0.5 mG / mL) ב PBS עם 1 mM סידן כלורי ב 4 °C (2.5 שעות). הערכה היסתולוגית הצביעה על כך שהאפידרמיס הופרד מהדרמיס בקרום המרתף וכי רכסי הרט האפידרמליים היו שלמים. תרמוליסין הוא מטאלונדופפטידאאז חוץ-תאי המיוצר על ידי ...

Disclosures

למחברים אין גילויים.

Acknowledgements

מימון למחקר זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIH-AR047410 (KEM)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
λ-carrageenanMillipore Sigma22049Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific4351107For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrousMillipore Sigma499609Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting MediumMillipore SigmaC0612Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-31570Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific11966-025To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acidMillipore SigmaE6758Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptasePromegaM1701For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12)Santa Cruz Biotechnologysc-365944For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5Cedarlane LabsCL7756APFor intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley RatCharles RiverStrain Code 400Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding MatrixThermo Fisher Scientific1310TSTissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA24811For RT-PCR analysis
SYBR Select Master MixThermo Fisher Scientific4472908For RT-PCR analysis
ThermolysinMillipore SigmaT7902From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine BlueMillipore Sigma89640For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026For total RNA extraction for RTPCR

References

  1. Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
  2. Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
  3. Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
  4. Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
  5. Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
  6. Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
  7. Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
  8. Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
  9. Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
  10. Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
  11. Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
  12. Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
  13. Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
  14. Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
  15. Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
  16. Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
  17. Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
  18. Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
  19. Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
  20. Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
  21. Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
  22. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
  23. Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
  24. van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
  25. Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
  26. Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
  27. Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
  28. Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
  29. Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
  30. Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  31. Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
  32. Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
  33. Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
  34. Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
  35. Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
  36. Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
  37. Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1756qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved