Trennung von Rattenepidermis und Dermis mit Thermolysin zum Nachweis ortsspezifischer entzündlicher mRNA und Proteine

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Trennung von Epidermis und Dermis vorgestellt, um die Produktion von Entzündungsmediatoren zu bewerten. Nach einer Entzündung wird die Hinterpfotenepidermis der Ratte durch Thermolysin bei 4 °C von der Dermis getrennt. Die Epidermis wird dann für die mRNA-Analyse mittels RT-PCR und die Proteinbewertung durch Western Blot und Immunhistochemie verwendet.

Zusammenfassung

Einfach anzuwendende und kostengünstige Techniken sind erforderlich, um die ortsspezifische Produktion von Entzündungsmediatoren und Neurotrophinen bei Hautverletzungen, Entzündungen und / oder Sensibilisierungen zu bestimmen. Ziel dieser Studie ist es, ein epidermal-dermales Trennungsprotokoll mit Thermolysin, einer Proteinase, die bei 4 °C aktiv ist, zu beschreiben. Um dieses Verfahren zu veranschaulichen, werden Sprague Dawley-Ratten betäubt und rechte Hinterpfoten mit Carrageen injiziert. Sechs und zwölf Stunden nach der Injektion werden Ratten mit Entzündungen und naive Ratten eingeschläfert, und ein Stück Hinterpfote, glabrous Haut wird in kalte Dulbeccos Modified Eagle Medium gelegt. Die Epidermis wird dann an der Basalmembran durch Thermolysin in PBS mit Calciumchlorid von der Dermis getrennt. Als nächstes wird die Dermis durch eine Mikrodissektionszette gesichert und die Epidermis sanft weggeteist. Toluidinblaue Färbungen von Gewebeschnitten zeigen, dass die Epidermis sauber von der Dermis an der Basalmembran getrennt ist. Alle Keratinozytenzellschichten bleiben intakt, und die epidermalen Rete-Grate zusammen mit Vertiefungen von dermalen Papillen werden deutlich beobachtet. Qualitative und Echtzeit-RT-PCR wird verwendet, um den Nervenwachstumsfaktor und die Interleukin-6-Expressionsniveaus zu bestimmen. Western Blotting und Immunhistochemie werden schließlich durchgeführt, um Mengen an Nervenwachstumsfaktor zu erkennen. Dieser Bericht zeigt, dass die kalte Thermolysinverdauung eine wirksame Methode ist, um Epidermis von Dermis zu trennen, um mRNA- und Proteinveränderungen während einer Entzündung zu bewerten.

Einleitung

Die Beurteilung von Entzündungsmediatoren und neurotrophen Faktoren aus der Haut kann aufgrund der Heterogenität der Zelltypen in der entzündeten Dermis und Epidermis eingeschränkt sein^1,2,3. Mehrere Enzyme, chemische, thermische oder mechanische Techniken, die die Trennung der beiden Schichten oder die Durchführung der Zelldissoziation zur Bewertung beinhalten, wurden kürzlich überprüft⁴. Säure, Alkali, neutrales Salz und Hitze können die Epidermis schnell von der Dermis trennen, aber zelluläre und extrazelluläre Schwellungen treten häufig auf^5,6. Trypsin, Pankreatin, Elastase, Keratinase, Kollagenase, Pronase, Dispase und Thermolysin sind Enzyme, die zur epidermal-dermalen Trennung verwendet wurden^4,7. Trypsin und andere breit angelegte proteolytische Enzyme sind bei 37–40 °C aktiv, müssen aber sorgfältig überwacht werden, um eine Dissoziation der epidermalen Schichten zu verhindern. Dispase spaltet die Epidermis an der Lamina densa, benötigt aber 24 h zur Trennung in den kalten^4,8 oder kürzeren Zeitpunkten bei 37 °C^4,9. Ein limitierendes Merkmal all dieser Techniken ist die mögliche Störung der Gewebemorphologie und der Verlust der Integrität von mRNA und Protein.

Um die Integrität von mRNA und Protein zu erhalten, sollte für kurze Zeit eine Hauttrennmethode in der Kälte durchgeführt werden. Bei der Bewertung von Hauttrenntechniken für Entzündungsstudien ist Thermolysin ein wirksames Enzym, um die Epidermis von der Dermis bei kalten Temperaturen zu trennen⁴. Thermolysin ist bei 4 °C aktiv, spaltet epidermale Hämidenmosomen aus der Lamina lucida und trennt die Epidermis innerhalb von 1–3 h^4,8,10. Ziel dieses Berichts ist es, die Verwendung von Thermolysin zur Trennung der entzündeten Rattenepidermis von der Dermis zu optimieren, um mRNA- und Proteinspiegel für Entzündungsmediatoren und neurotrophe Faktoren nachzuweisen. Mehrere vorläufige Berichte wurden vorgelegt^{11,12,13,14,15}. Das Ziel dieses Manuskripts ist es, eine optimale Hauttrenntechnik mit Thermolysin zu beschreiben und den Nachweis von 1) Entzündungsmarkern, 2) Interleukin-6 (IL-6) mRNA und 3) Nervenwachstumsfaktor (NGF) mRNA und Protein in der Epidermis von Ratten mit Carrageen-induzierter Entzündung (C-II)^16,17zu demonstrieren. Ein vorläufiger Bericht unter Verwendung des vollständigen Freund-Adjuvansmodells zeigt, dass der NGF-mRNA- und Proteinspiegel während der Entzündung früh ansteigen¹⁵. Bei Mäusen führt die Hautsensibilisierung mit der topischen Anwendung von Oxazolon zu einem frühen Anstieg der IL-6 mRNA unter Verwendung der In-situ-Hybridisierung³⁶. Sowohl IL-6 als auch NGF wurden in C-II^18,19in Frage gestellt, aber es gab keine Berichte, die mRNA- oder Proteinspiegel für IL-6 oder NGF speziell aus der Epidermis während der akuten Stadien von C-II beschreiben.

Die Thermolysin-Technik ist kostengünstig und unkompliziert durchzuführen. Darüber hinaus ermöglicht die Thermolysintrennung der Epidermis von der Dermis die mRNA-, Western-Blot- und immunhistochemische Analyse von Entzündungsmediatoren und neurotrophen Faktoren während des Entzündungsprozesses¹⁵. Forscher sollten in der Lage sein, diese Technik sowohl in präklinischen als auch in klinischen Studien zu Hautentzündungen problemlos anzuwenden.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien des Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).

1. Carrageen-induzierte Entzündung (C-II)

1. Männliche und/oder weibliche Sprague Dawley-Ratten (200–250 g; 8–9 Wochen alt) mit Isofluran (oder injizierbarem Anästhetikum) betäuben.
2. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hornhaut berühren und die linke Hinterpfote leicht einklemmen. Wenn das Tier angemessen betäubt wird, wird keine Hornhaut- oder Pfotenreaktion beobachtet.
3. Subkutan injizieren Sie die rechte glabrous, hintere Pfote mit 100 μL 1% (w/v) λ-Carrageen, verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)²⁰.
   1. Stellen Sie sicher, dass geeignete Kontrollen verwendet werden, z. B. naive Ratten ohne Isofluran in diesem Bericht. Vorläufige Studien deuten darauf hin, dass naive Ratten mit oder ohne Isofluran die gleiche basale Expression von epidermalem IL-6 und NGF aufweisen.
      HINWEIS: Naive Ratten sind bevorzugte Kontrollen für Entzündungsstudien, da subkutane Kochsalzlösung oder PBS eine lokale Entzündung verursachen^23,37.
4. Bewerten Sie das Ödem von C-II-Ratten, um die Wirksamkeit des Carrageens zu gewährleisten (Abbildung 1)²⁰. Bestimmen Sie die Menge des Ödems, indem Sie die Mittelfußdicke der Hinterpfote mit Bremssätteln messen.
5. Bei 6-12 h Ratten mit CO₂ (oder injizierbarer Anästhesieüberdosis) einschläfern und 1 mm x 2 mm Stücke glabrous Hinterpfotenhaut mit scharfem Skalpell schneiden. Wenn behaarte Haut verwendet wird, rasieren Sie sie, bevor Sie die 1 mm x 2 mm Hautstücke schneiden.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Zeitpunkte entsprechend den spezifischen Studien ausgewählt werden.
6. Mit einer Mikrodissektionszette die Haut in 1 ml kaltes Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis übertragen und 15-60 Minuten kalt halten.

2. Thermolysinabscheidung von Epidermis und Dermis

1. Thermolysin vorbereiten und aktivieren.
   1. Bereiten Sie eine Lösung von Thermolysin vor, indem Sie 5 mg Geobacillus stearothermophilus zu 10 ml PBS bei pH = 8 (Konzentration 500 μg / ml) hinzufügen.
   2. Eine 1 M Lösung von Calciumchlorid_(CaCl2 wasserfrei) wird durch Zugabe von 1,11 g in 10 mL destilliertes_H2Ohergestellt.
   3. Um die Autolyse von Thermolysin zu verhindern, fügen Sie 10 μL Calciumchlorid zu 10 ml Thermolysinlösung hinzu. Die Calciumchlorid-Endkonzentration beträgt 1 mM.
   4. Aliquot 1 ml aktiviertes Thermolysin in 10 Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte auf Eis.
2. Verwenden Sie Thermolysin-Enzymverdauung, um die Epidermis von der Dermis zu trennen.
   1. Mit einer Mikrodissektionszette wird eine Hautprobe in jede Vertiefung des aktivierten Thermolysins übertragen. Achten Sie darauf, die Haut nicht in die Thermolysinlösung einzutauchen.
   2. Klopfen Sie vorsichtig auf die Haut an der Seite des Brunnens, um die Hautprobe aus der Zözette zu lösen, um auf der Thermolysinlösung zu schweben.
   3. Schweben Sie die Haut mit der Seite stratum corneum (äußere Epidermis) nach oben und der Dermis nach unten in die Thermolysinlösung. Es ist wichtig, dass die Dermis nach unten zeigt, sonst findet die effektive Trennung nicht statt.
      HINWEIS: Die Zeit für die Thermolysin-Inkubation muss vom Endbenutzer empirisch bestimmt werden. Glabrous, Hinterpfotenhaut von Sprague Dawley Ratten (200–250 g; 8–9 Wochen alt) benötigt oft 2,0–2,5 h zur Trennung. Es wird erwartet, dass die Inkubationszeit je nach Art und Alter variiert.
   4. Nach der entsprechenden Inkubationszeit in Thermolysin verwenden Sie eine Mikrodissektionszette, um eine Hautprobe in eine Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte mit 7-8 ml kaltem (4 °C) DMEM zu übertragen. Dies ermöglicht mehr Raum für die Trennung der Epidermis von der Dermis.
   5. Tauchen Sie die Haut in das DMEM ein.
   6. Bürsten Sie die Epidermis vorsichtig mit der Pinzette um den Umfang der Haut, bis die nahezu durchscheinende Epidermis an den Grenzen beobachtet wird. Wenn dies nicht erreicht werden kann, geben Sie die Hautprobe für weitere 15-30 Minuten in die Thermolysinlösung zurück.
   7. Sobald sich die Epidermis merklich von der Dermis trennt, halten Sie sowohl die Epidermis als auch die Dermis vorsichtig mit einer Mikrodissektionszette und ziehen Sie die Epidermis sehr langsam aus der Dermis.
   8. Bewerten Sie die Transluzenz der isolierten Epidermis und stellen Sie sicher, dass sie optisch konsistent ist. Siehe Abbildung 2 für ein Beispiel einer 1 mm x 2 mm großen Probe der Rattenepidermis. Wenn es eine Variation in der Transluzenz gibt, dann ist keine richtige Trennung aufgetreten.
3. Inaktivierung von Thermolysin mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in den getrennten Teilen von Epidermis und Dermis.
   ACHTUNG: Das Thermolysin, das in der Epidermis und Dermis verbleibt, ist immer noch aktiv und kann die Schichten schädigen, wenn es nicht inaktiviert wird.
   1. Bereiten Sie eine 0,5 M EDTA-Stammlösung vor. Fügen Sie dazu langsam 0,93 g EDTA in 5 ml doppelt destilliertes Wasser hinzu. Fügen Sie der Lösung Natriumhydroxid hinzu, bis sie sich verklart. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert der Lösung ~ 8,0 beträgt.
   2. Erstellen Sie eine 5 mM EDTA-Lösung in DMEM. 0,25 ml 0,5 M EDTA-Stammlösung werden zu 25 ml DMEM hinzugefügt.
   3. Legen Sie die getrennte Epidermis und Dermis für 30 minuten in die 5 mM EDTA/DMEM-Lösung bei 4 °C, um die Aktivität des Thermolysins zu deaktivieren.
4. Bewerten Sie die Epidermis mit tinctorial histology^8,9,10.
   1. Fixieren Sie einen Teil der Epidermis in einem 10% neutralen Formalin, 4% Paraformaldehyd oder 0,25% Paraformaldehyd mit 0,8% Pikturansäurelösung für 1 h bei Raumtemperatur (RT) unter Rührung.
   2. Legen Sie die fixierte Epidermis in 10% Saccharose in PBS für 1 h bei RT mit Rührung.
   3. Gefrieren Sie die Epidermis in einer Gewebeeinbettungsmatrix zum Abschnittieren. Schneiden Sie 14 μm Querschnitte mit einem Kryostaten und tauen Sie auf gelatinebeschichtete Glasmikroskopobjektträger.
   4. Trocknen Sie Die Abschnitte auf einem Objektträgerwärmer und flecken Sie sie mit einer Arbeitslösung aus Toluidinblau (TB; 10% TB in 1% Natriumchlorid) für 90 s. Appose Abdeckslips mit wässrigem Montagemedium.
   5. Beobachten Sie die Epidermis mit Hellfeldmikroskopie bei 50x–250x.
      HINWEIS: Wenn eine ordnungsgemäße Trennung stattgefunden hat, wird die Epidermis sauber von der Dermis getrennt und die fünf Schichten werden erkannt: Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum, Stratum lucidum und Stratum corneum. Ein Beispiel für eine getrennte Hautepidermis von Ratten ist in Abbildung 3 zu sehen.

3. Proteinextraktion und Western-Blot-Analyse

1. Führen Sie Western Blotting an den getrennten Gewebeproben mit zuvor veröffentlichtem Protokoll^{21 durch.}
2. Homogenisieren Sie die Epidermis in 50 μL Lysepuffer (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% Glycerin und 1% Triton X-100), die einen Phosphatase- und Proteaseinhibitorcocktail enthalten.
3. Zentrifugenproben mit einer maximalen Geschwindigkeit für 15 min bei 4 °C und bewerten Sie den Überstand für die Proteinkonzentration mit einem Protein-Assay-Kit.
4. Laden Sie gleiche Proteinkonzentrationen (30 μg) auf SDS-Gele, führen Sie eine Elektrophorese durch und übertragen Sie dann Proteine auf Nitrocellulose- oder PVDF-Membranen.
5. Blockieren Sie die Membranen mit 5% Milch für 2 h und inkubieren Sie sie über Nacht in primären Antikörpern (Maus-Anti-NGF, E12, 1:1000).
6. 3x mit PBS mit 0,3% Tween für jeweils 10 min waschen und mit einem markierten sekundären Antikörper (z.B. alkalische Phosphatase markiert Kaninchen Anti-Maus IgG) inkubieren.
7. Verwenden Sie ein Scansystem, um das Western-Blot-Signal auszuwerten (z. B. ECF-Substrat und eine Bildgebungsplattform).

4. Immunhistochemie

1. Gewebeproben werden in ein Fixiermittel für eine optimale Immunreaktivität geben: 0,96% (w/v) Piktrinsäure und 0,2% (w/v) Formaldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH =^{7,3 21,22,23} für 4 h bei RT. Transfer auf 10% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C.
2. Führen Sie eine Standardimmunhistochemie an den Gewebeabschnitten^{21,22,23 durch.}
3. Betten Sie die Epidermis von Tieren in einen einzigen gefrorenen Block in der Einbettungsmatrix ein und schneiden Sie 10-30 μm-Abschnitte auf einem Kryostaten. Montieren Sie die Schnitte auf gelatinebeschichteten, glasmikroskopisch kleinen Objektträgern und trocknen Sie sie bei 37 °C für 2 h.
4. Waschen Sie die Abschnitte für drei, 10 minuten Spülungen in PBS und inkubieren Sie für 24-96 h in primären Antiseren, [z. B. Maus-Anti-NGF (E12, 1:2000)] und Kaninchen-Antiprotein-Genprodukt 9,9 (PGP 9,5, 1:2000) verdünnt in PBS mit 0,3% (w / v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% Polyvinylpyrrolidon (PVP).
5. Nach der primären Antiseruminkubation die Abschnitte dreimal für 10 minuten in PBS ausspülen und 1 h bei RT in Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen IgG (1:1000) und Alexa Fluor 555 Esel Antimaus IgG (1:1000) verdünnt in PBS-T inkubieren.
6. Spülen Sie die Abschnitte dreimal in PBS für 10 min ab und befestigen Sie Abdeckungen mit nicht verblassenden Montagemedium, um das Ausbleichen der Immunfluoreszenz zu verzücken.

5. RNA-Isolierung und cDNA-Synthese

1. Führen Sie eine Standard-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) an den Hautproben^{durch 21}. Isolieren Sie die Gesamt-RNA mit einer Phenol-, Guanidin-Isothiocyanat-Lösung.
2. Führen Sie eine komplementäre DNA-Synthese durch Moloney murine Leukämievirus Reverse Transkriptase durch.
3. Verwenden Sie die folgenden Primersequenzen für die NGF- und IL-6-Verstärkung:
   NGF (Sense) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
   NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
   IL-6 (Sense) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
   IL-6 (Antisense) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG
4. Vergleichen Sie die Spiegel von NGF und IL-6 mRNA mit β-Aktin-Housekeeping-Gen:
   β-ACTIN (Sinn) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
   β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
5. Auswertung mit qualitativer RT-PCR mittels Thermocycler und quantitativer Real-Time PCR (qRT-PCR) mittels qRT-PCR System.

Ergebnisse

Carrageen-Injektion in die Hinterpfote der Ratte verursachte klassische Entzündungssymptome wie Rötung und Ödeme^16,17. Die Schwellung der Hinterpfote wurde mit mechanischen Bremssätteln^{gemessen 20}. Ein Basiswert der Dicke der Pfote wurde für jede Ratte vor der Carrageenbehandlung erhalten und erneut nach 6 h und 12 h gemessen. Die Pfotendicke war im Vergleich zu den Ausgangswerten signifikant erhöht (Abbildung 1<...

Diskussion

Die Studie ergab, dass die Epidermis der glabrousen Hinterpfote der Ratte leicht von der Dermis mit Thermolysin (0,5 mG / ml) in PBS mit 1 mM Calciumchlorid bei 4 °C für 2,5 h getrennt werden konnte. Die histologische Auswertung ergab, dass die Epidermis an der Basalmembran von der Dermis getrennt war und dass die epidermalen Rete-Grate intakt waren. Thermolysin ist eine extrazelluläre Metalloendopeptidase, die von Gram-positivem (Geo)Bacillus thermoproteolyticus²⁴produziert w...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
λ-carrageenan	Millipore Sigma	22049	Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107	For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous	Millipore Sigma	499609	Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium	Millipore Sigma	C0612	Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-31570	Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11966-025	To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid	Millipore Sigma	E6758	Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase	Promega	M1701	For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365944	For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5	Cedarlane Labs	CL7756AP	For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat	Charles River	Strain Code 400	Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix	Thermo Fisher Scientific	1310TS	Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4472908	For RT-PCR analysis
Thermolysin	Millipore Sigma	T7902	From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue	Millipore Sigma	89640	For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	For total RNA extraction for RTPCR