Separazione dell'epidermide e del derma di ratto con termolisina per rilevare mRNA e proteine infiammatorie sito-specifiche

Riepilogo

Qui è presentato un protocollo per la separazione dell'epidermide dal derma per valutare la produzione di mediatori infiammatori. A seguito dell'infiammazione, l'epidermide della zampa posteriore di ratto viene separata dal derma mediante termolisina a 4 °C. L'epidermide viene quindi utilizzata per l'analisi dell'mRNA mediante RT-PCR e la valutazione delle proteine mediante western blot e immunoistochimica.

Abstract

Sono necessarie tecniche facili da usare e poco costose per determinare la produzione sito-specifica di mediatori infiammatori e neurotrofine durante lesioni cutanee, infiammazione e / o sensibilizzazione. L'obiettivo di questo studio è quello di descrivere un protocollo di separazione epidermico-dermica utilizzando la termolisina, una proteinasi attiva a 4 °C. Per illustrare questa procedura, i ratti Sprague Dawley vengono anestetizzati e le zampe posteriori destre vengono iniettate con carragenina. Sei e dodici ore dopo l'iniezione, i ratti con infiammazione e ratti ingenui vengono eutanasizzati e un pezzo di zampa posteriore, la pelle glabra viene posto nel freddo Dulbecco's Modified Eagle Medium. L'epidermide viene quindi separata dalla membrana basale dal derma dalla termolisina in PBS con cloruro di calcio. Successivamente, il derma è protetto da una pinca di microdissezione e l'epidermide viene delicatamente presa in giro. La colorazione blu toluidina delle sezioni tissutali mostra che l'epidermide è separata in modo pulito dal derma nella membrana basale. Tutti gli strati cellulari di cheratinociti rimangono intatti e le creste della rete epidermica insieme alle rientranze delle papille dermiche sono chiaramente osservate. La RT-PCR qualitativa e in tempo reale viene utilizzata per determinare il fattore di crescita nervoso e i livelli di espressione dell'interleuchina-6. Western blotting e immunoistochimica vengono infine eseguiti per rilevare quantità di fattore di crescita nervoso. Questo rapporto illustra che la digestione della termolisina fredda è un metodo efficace per separare l'epidermide dal derma per la valutazione dell'mRNA e delle alterazioni proteiche durante l'infiammazione.

Introduzione

La valutazione dei mediatori infiammatori e dei fattori neurotrofici dalla pelle può essere limitata a causa dell'eterogeneità dei tipi di cellule presenti nel derma infiammato e nell'epidermide^1,2,3. Diversi enzimi, tecniche chimiche, termiche o meccaniche che comportano la separazione dei due strati o per eseguire la dissociazione cellulare per la valutazione sono stati recentemente esaminati⁴. Acido, alcali, sale neutro e calore possono dividere rapidamente l'epidermide dal derma, ma il gonfiore cellulare ed extracellulare si verifica spesso^5,6. Tripsina, pancreatina, elastasi, cheratinasi, collagenasi, pronasi, dispasi e termolisina sono enzimi che sono stati utilizzati per la separazione epidermico-dermica^4,7. La tripsina e altri enzimi proteolitici su larga scala sono attivi a 37-40 °C, ma devono essere monitorati attentamente per prevenire la dissociazione degli strati epidermici. La dispasi fende l'epidermide alla lamina densa, ma richiede 24 ore per la separazione nel freddo^4,8 o punti temporali più brevi a 37 °C^4,9. Una caratteristica limitante di tutte queste tecniche è la potenziale interruzione della morfologia dei tessuti e la perdita di integrità di mRNA e proteine.

Per mantenere l'integrità dell'mRNA e delle proteine, è necessario eseguire un metodo di separazione cutanea al freddo per un breve periodo di tempo. Nella valutazione delle tecniche di separazione cutanea per gli studi sull'infiammazione, la termolisina è un enzima efficace per separare l'epidermide dal derma a basse temperature⁴. La termolisi è attiva a 4 °C, scinde gli emidesmosomi epidermici dalla lamina lucida e separa l'epidermide dal derma entro 1-3 h^4,8,10. L'obiettivo di questo rapporto è ottimizzare l'uso della termolisina per la separazione dell'epidermide di ratto infiammata dal derma per rilevare i livelli di mRNA e proteine per mediatori infiammatori e fattori neurotrofici. Sono state presentate diverse relazioni preliminari^{11,12,13,14,15.} L'obiettivo di questo manoscritto è descrivere una tecnica ottimale di separazione cutanea utilizzando la termolisina e dimostrare il rilevamento di 1) marcatori di infiammazione, 2) interleuchina-6 (IL-6) mRNA e 3) mRNA e proteine del fattore di crescita nervoso (NGF) nell'epidermide di ratti con infiammazione indotta da carragenina (C-II)^16,17. Un rapporto preliminare che utilizza il modello adiuvante completo di Freund indica che i livelli di mRNA e proteine NGF aumentano precocemente durante l'infiammazione¹⁵. Nei topi, la sensibilizzazione cutanea con l'applicazione topica di oxazolone provoca un aumento precoce dell'mRNA IL-6 utilizzando l'ibridazione in situ³⁶. Sia IL-6 che NGF sono stati implicati in C-II^18,19, ma non ci sono state segnalazioni che descrivono livelli di mRNA o proteine per IL-6 o NGF specificamente dall'epidermide durante le fasi acute di C-II.

La tecnica della termolisina è economica e semplice da eseguire. Inoltre, la separazione termolitica dell'epidermide dal derma consente l'mRNA, il western blot e l'analisi immunoistochimica dei mediatori infiammatori e dei fattori neurotrofici durante il processo di infiammazione¹⁵. I ricercatori dovrebbero essere in grado di utilizzare facilmente questa tecnica in studi preclinici e clinici sull'infiammazione della pelle.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).

1. Infiammazione indotta da carragenina (C-II)

1. Anestetizzare ratti Sprague Dawley maschi e/o femmine (200-250 g; 8-9 settimane) con isoflurano (o anestetico iniettabile).
2. Controllare la profondità dell'anestesia toccando la cornea e pizzicando leggermente la zampa posteriore sinistra. Quando l'animale è opportunamente anestetizzato, non si osserverà alcuna risposta corneale o della zampa.
3. Iniettare per via sottocutanea la zampa posteriore glabra destra con 100 μL dell'1% (p/v) di λ-carragenina diluita in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)²⁰.
   1. Assicurarsi che vengano utilizzati controlli appropriati, come i ratti ingenui senza isoflurano in questa relazione. Studi preliminari indicano che i ratti naïve con o senza isoflurano hanno la stessa espressione basale di IL-6 epidermico e NGF.
      NOTA: I ratti naïve sono i controlli preferiti per gli studi sull'infiammazione poiché la soluzione salina sottocutanea o pbS causano un'infiammazione locale^23,37.
4. Valutare l'edema dei ratti C-II per garantire l'efficacia della carragenina (Figura 1)²⁰. Determinare la quantità di edema misurando lo spessore metatarsale della zampa posteriore con pinze.
5. A 6-12 ore, eutanasizzare i ratti con CO₂ (o sovradosaggio anestetico iniettabile) e tagliare pezzi di 1 mm x 2 mm di pelle glabra della zampa posteriore con bisturi affilato. Se si utilizza la pelle pelosa, raderla prima di tagliare i pezzi di pelle da 1 mm x 2 mm.
   NOTA: Assicurarsi che vengano scelti i timepoint appropriati in base agli studi specifici.
6. Utilizzando una pinna per microdissezione, trasferire la pelle in 1 mL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco freddo in un tubo di microcentrifuga su ghiaccio e mantenere freddo per 15-60 minuti.

2. Separazione termolisina dell'epidermide e del derma

1. Preparare e attivare la termolisina.
   1. Preparare una soluzione di termolisina, aggiungendo 5 mg di Geobacillus stearothermophilus a 10 ml di PBS, a pH = 8 (concentrazione 500 μg/mL).
   2. Preparare una soluzione 1 M di cloruro di calcio (CaCl₂ anidro) aggiungendo 1,11 g in 10 ml di H₂O distillato.
   3. Per prevenire l'autolisi della termolisi, aggiungere 10 μL di cloruro di calcio a 10 mL di soluzione di termolisina. La concentrazione finale di cloruro di calcio sarà di 1 mM.
   4. Aliquota 1 mL di termolisina attivata in 10 pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzi su ghiaccio.
2. Utilizzare la digestione enzimatica termolisina per separare l'epidermide dal derma.
   1. Utilizzando una pinza per microdissezione, trasferire un campione di pelle in ciascun pozzetto di termolisina attivata. Assicurarsi di non immergere la pelle nella soluzione di termolisina.
   2. Picchiettare delicatamente la pelle sul lato del pozzo per aiutare a rilasciare il campione di pelle dalla pinza per galleggiare sulla soluzione di termolisina.
   3. Far galleggiare la pelle nella soluzione di termolisina con lo strato corneo (epidermide esterna) rivolto verso l'alto e il derma rivolto verso il basso. È fondamentale che il derma sia rivolto verso il basso, o l'effettiva separazione non avrà luogo.
      NOTA: La quantità di tempo per l'incubazione della termolisina deve essere determinata empiricamente dall'utente finale. La pelle glabra e posteriore dei ratti Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 settimane) richiede spesso 2,0-2,5 ore per la separazione. Il tempo di incubazione dovrebbe variare con la specie e l'età.
   4. Dopo il tempo di incubazione appropriato in termolisina, utilizzare una pinza per microdissezione per trasferire un campione di pelle in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con 7-8 mL di DMEM freddo (4 °C). Ciò consente più spazio per la separazione dell'epidermide dal derma.
   5. Immergere la pelle nel DMEM.
   6. Spazzolare delicatamente l'epidermide con la pincia attorno al perimetro della pelle fino a quando l'epidermide quasi traslucida non viene osservata ai bordi. Se ciò non può essere ottenuto, riportare il campione di pelle alla soluzione di termolisina per altri 15-30 minuti.
   7. Una volta che l'epidermide si separa notevolmente dal derma, quindi tenere con attenzione sia l'epidermide che il derma con una pinca di microdissezione e molto lentamente estrarre l'epidermide dal derma.
   8. Valutare la traslucenza dell'epidermide isolata e assicurarsi che sia otticamente coerente. Vedere la Figura 2 per un esempio di un campione di 1 mm x 2 mm di epidermide di ratto. Se c'è una variazione nella traslucenza, allora non si è verificata una corretta separazione.
3. Inattivare la termolisisina usando l'acido etilendiammitatotraacetico (EDTA) nei pezzi separati di epidermide e derma.
   ATTENZIONE: La termolisina che rimane nell'epidermide e nel derma è ancora attiva e può danneggiare gli strati se non inattivata.
   1. Preparare una soluzione stock EDTA da 0,5 M. Per fare ciò, aggiungere lentamente 0,93 g di EDTA in 5 ml di acqua a doppio distillato. Aggiungere idrossido di sodio alla soluzione fino a quando non si schiarisce. Assicurarsi che il pH della soluzione sia ~ 8,0.
   2. Crea una soluzione EDTA da 5 mM in DMEM. Aggiungere 0,25 mL di soluzione stock edTA da 0,5 M a 25 mL di DMEM.
   3. Posizionare l'epidermide e il derma separati nella soluzione edta/DMEM da 5 mM a 4 °C per 30 minuti per disattivare l'attività della termolisina.
4. Valutare l'epidermide con istologia tintoriale^8,9,10.
   1. Fissare una porzione dell'epidermide in una formalina neutra al 10%, paraformaldeide al 4% o paraformaldeide allo 0,25% con soluzione di acido picrico allo 0,8% per 1 ora a temperatura ambiente (RT) con agitazione.
   2. Posizionare l'epidermide fissa in saccarosio al 10% in PBS per 1 ora a RT con agitazione.
   3. Congelare l'epidermide in una matrice di incorporamento del tessuto per il sezionamento. Tagliare sezioni trasversali da 14 μm utilizzando un criostato e sezioni di montaggio del disgelo su vetrini per microscopio rivestiti di gelatina.
   4. Sezioni asciutte su uno scaldasalviette e macchia con una soluzione di lavoro di blu toluidina (TB; 10% TB in 1% cloruro di sodio) per 90 s. Appose coverslips con un mezzo di montaggio acquoso.
   5. Osservare l'epidermide con la microscopia a campo luminoso a 50x-250x.
      NOTA: Se si è verificata una corretta separazione, l'epidermide sarà divisa in modo pulito dal derma e verranno rilevati i cinque strati: strato basale, strato spinoso,strato granuloso, strato lucidum e strato corneo. Un esempio di epidermide separata della pelle di ratto può essere visto nella Figura 3.

3. Estrazione delle proteine e analisi western blot

1. Eseguire western blotting sui campioni di tessuto separati utilizzando il protocollo²¹precedentemente pubblicato.
2. Omogeneizzare l'epidermide in 50 μL di tampone di lisi (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerolo e 1% Triton X-100) contenente un cocktail di fosfatasi e inibitore della proteasi.
3. Centrifugare i campioni a una velocità massima per 15 minuti a 4 °C e valutare il surnatante per la concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi proteica.
4. Caricare concentrazioni uguali di proteine (30 μg) su gel SDS, eseguire l'elettroforesi e quindi trasferire le proteine alle membrane di nitrocellulosa o PVDF.
5. Bloccare le membrane con il 5% di latte per 2 ore e incubare durante la notte in anticorpi primari (topo anti-NGF, E12, 1:1000).
6. Lavare 3 volte con PBS con interpolazione dello 0,3% per 10 minuti ciascuno e incubare con un anticorpo secondario etichettato (ad esempio, fosfatasi alcalina etichettata coniglio anti-topo IgG).
7. Utilizzare un sistema di scansione per valutare il segnale western blot (ad esempio, substrato ECF e una piattaforma di imaging).

4. Immunoistochimica

1. Posizionare i campioni di tessuto in un fissativo per un'immunoreattività ottimale: 0,96% (p/v) di acido picrico e 0,2% (p/v) di formaldeide in tampone fosfato di sodio 0,1 M, pH = 7,3^21,22,23 per 4 ore a RT. Trasferimento al 10% di saccarosio in PBS durante la notte a 4 °C.
2. Eseguire immunoistochimica standard sulle sezioni tissutali^21,22,23.
3. Incorporare l'epidermide degli animali in un singolo blocco congelato nella matrice di incorporamento e tagliare sezioni di 10-30 μm su un criostato. Montare le sezioni su vetrini rivestiti di gelatina e asciugare a 37 °C per 2 ore.
4. Lavare sezioni per tre risciacqui di 10 minuti in PBS e incubare per 24-96 ore in antisieri primari, [ad esempio, anti-NGF di topo (E12, 1:2000)] e prodotto genetico antiproteico di coniglio 9,9 (PGP 9,5, 1:2000) diluito in PBS contenente 0,3% (p/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T con 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,5% di polivinilpirrolidone (PVP).
5. Dopo l'incubazione primaria dell'antiserum, risciacquare le sezioni tre volte per 10 minuti in PBS e incubare 1 ora a RT in Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG (1:1000) e Alexa Fluor 555 asino anti-mouse IgG (1:1000) diluito in PBS-T.
6. Risciacquare le sezioni tre volte in PBS per 10 minuti e apporre le coperture con mezzo di montaggio non sbiadito per ritardare lo sbiadimento dell'immunofluorescenza.

5. Isolamento dell'RNA e sintesi del cDNA

1. Eseguire la reazione a catena standard della trascrittasi polimerasi (RT-PCR) sui campioni cutanei²¹. Isolare l'RNA totale utilizzando una soluzione di fenolo, guanidina isotiocianato.
2. Effettuare la sintesi complementare del DNA mediante moloney virus della leucemia murina trascrittasi inversa.
3. Utilizzare le seguenti sequenze di primer per l'amplificazione di NGF e IL-6:
   NGF (Senso) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
   NGF (Antisenso) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
   IL-6 (Senso) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
   IL-6 (Antisenso) – GTAGAAACGGAACTCCAGAGAGAGAG
4. Confronta i livelli di mRNA NGF e IL-6 con il gene di pulizia β-actina:
   β-ACTIN (Senso) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
   β-ACTINA (Antisenso) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
5. Valutare con RT-PCR qualitativa utilizzando thermal cycler e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) utilizzando un sistema qRT-PCR.

Risultati

L'iniezione di carragenina nella zampa posteriore del ratto ha causato sintomi classici di infiammazione come arrossamento ed edema^16,17. Il gonfiore della zampa posteriore è stato misurato con pinze meccaniche²⁰. Un valore basale dello spessore della zampa è stato ottenuto per ciascun ratto prima del trattamento con carragenina e misurato di nuovo a 6 h e 12 h. Lo spessore della zampa è stato aumentato in modo significativo rispetto ai...

Discussione

Lo studio ha determinato che l'epidermide della pelle glabra della zampa posteriore di ratto era facilmente separata dal derma usando termolisina (0,5 mG / mL) in PBS con 1 mM di cloruro di calcio a 4 ° C per 2,5 ore. La valutazione istologica ha indicato che l'epidermide era separata dal derma della membrana basale e che le creste della rete epidermica erano intatte. La termolisina è una metalloendopeptidasi extracellulare prodotta da Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus^2...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
λ-carrageenan	Millipore Sigma	22049	Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4351107	For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous	Millipore Sigma	499609	Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium	Millipore Sigma	C0612	Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-31570	Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	11966-025	To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid	Millipore Sigma	E6758	Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase	Promega	M1701	For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365944	For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5	Cedarlane Labs	CL7756AP	For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat	Charles River	Strain Code 400	Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix	Thermo Fisher Scientific	1310TS	Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4472908	For RT-PCR analysis
Thermolysin	Millipore Sigma	T7902	From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue	Millipore Sigma	89640	For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	For total RNA extraction for RTPCR