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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Présenté ici est un protocole pour la séparation de l’épiderme du derme pour évaluer la production de médiateur inflammatoire. Suite à l’inflammation, l’épiderme de la patte postérieure du rat est séparé du derme par la thermolysine à 4 °C. L’épiderme est ensuite utilisé pour l’analyse de l’ARNm par RT-PCR et l’évaluation des protéines par transfert de Western et immunohistochimie.

Résumé

Des techniques faciles à utiliser et peu coûteuses sont nécessaires pour déterminer la production spécifique au site de médiateurs inflammatoires et de neurotrophines lors de lésions cutanées, d’inflammation et / ou de sensibilisation. L’objectif de cette étude est de décrire un protocole de séparation épidermique-cutanée utilisant la thermolysine, une protéinase active à 4 °C. Pour illustrer cette procédure, les rats Sprague Dawley sont anesthésiés et les pattes postérieures droites sont injectées avec du carraghénane. Six et douze heures après l’injection, des rats souffrant d’inflammation et des rats naïfs sont euthanasiés, et un morceau de patte postérieure, la peau glabre est placé dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco froid. L’épiderme est ensuite séparé au niveau de la membrane basale du derme par thermolysine dans le PBS avec du chlorure de calcium. Ensuite, le derme est sécurisé par des pinces à microdissection et l’épiderme est doucement taquiné. La coloration bleu toluidine des coupes de tissu montre que l’épiderme est séparé proprement du derme au niveau de la membrane basale. Toutes les couches de cellules kératinocytes restent intactes et les crêtes épidermiques ainsi que les indentations des papilles dermiques sont clairement observées. La RT-PCR qualitative et en temps réel est utilisée pour déterminer le facteur de croissance nerveuse et les niveaux d’expression de l’interleukine-6. Le western blotting et l’immunohistochimie sont enfin effectués pour détecter des quantités de facteur de croissance nerveuse. Ce rapport illustre que la digestion froide par thermolysine est une méthode efficace pour séparer l’épiderme du derme pour l’évaluation des altérations de l’ARNm et des protéines pendant l’inflammation.

Introduction

L’évaluation des médiateurs inflammatoires et des facteurs neurotrophiques de la peau peut être limitée en raison de l’hétérogénéité des types cellulaires présents dans le derme et l’épiderme enflammés1,2,3. Plusieurs enzymes, techniques chimiques, thermiques ou mécaniques impliquant la séparation des deux couches ou permettant d’effectuer une dissociation cellulaire pour évaluation ont été revues récemment4. L’acide, l’alcali, le sel neutre et la chaleur peuvent séparer rapidement l’épiderme du derme, mais un gonflement cellulaire et extracellulaire se produit souvent5,6. La trypsine, la pancréatine, l’élastase, la kératinase, la collagénase, la pronase, la dispase et la thermolysine sont des enzymes qui ont été utilisées pour la séparation épidermique-cutanée4,7. La trypsine et d’autres enzymes protéolytiques à grande échelle sont actives à une °C de 37 à 40 °C, mais doivent être surveillées attentivement pour éviter la dissociation des couches épidermiques. Dispase clive l’épiderme à la lamina densa, mais nécessite 24 h pour la séparation dans le froid4,8 ou des points de temps plus courts à 37 ° C4,9. Une caractéristique limitante de toutes ces techniques est la perturbation potentielle de la morphologie des tissus et la perte d’intégrité de l’ARNm et des protéines.

Pour maintenir l’intégrité de l’ARNm et des protéines, une méthode de séparation de la peau doit être effectuée dans le froid pendant une courte période de temps. Dans l’évaluation des techniques de séparation de la peau pour les études sur l’inflammation, la thermolysine est une enzyme efficace pour séparer l’épiderme du derme à des températures froides4. La thermolysine est active à 4 °C, coupe les hémidesmosomes épidermiques de la lamina lucida et sépare l’épiderme du derme en 1–3 h4,8,10. L’objectif de ce rapport est d’optimiser l’utilisation de la thermolysine pour séparer l’épiderme enflammé du rat du derme afin de détecter les niveaux d’ARNm et de protéines pour les médiateurs inflammatoires et les facteurs neurotrophiques. Plusieurs rapports préliminaires ont étéprésentés11,12,13,14,15. L’objectif de ce manuscrit est de décrire une technique optimale de séparation de la peau à l’aide de la thermolysine et de démontrer la détection de 1) marqueurs de l’inflammation, 2) ARNm interleukine-6 (IL-6) et 3) ARNm et protéines du facteur de croissance nerveuse (NGF) dans l’épiderme de rats présentant une inflammation induite par le carraghénane (C-II)16,17. Un rapport préliminaire utilisant le modèle adjuvant complet de Freund indique que les niveaux d’ARNm et de protéines NGF augmentent tôt pendant l’inflammation15. Chez la souris, la sensibilisation cutanée avec l’application topique d’oxazolone provoque une augmentation précoce de l’ARNm IL-6 en utilisant l’hybridation in situ36. L’IL-6 et le NGF ont tous deux été impliqués dans C-II18,19, mais il n’y a eu aucun rapport décrivant les niveaux d’ARNm ou de protéines pour l’IL-6 ou le NGF spécifiquement de l’épiderme pendant les stades aigus de C-II.

La technique de la thermolysine est peu coûteuse et simple à réaliser. De plus, la séparation thermolysine de l’épiderme du derme permet l’ARNm, le transfert de Western et l’analyse immunohistochimique des médiateurs inflammatoires et des facteurs neurotrophiques au cours du processus d’inflammation15. Les investigateurs devraient être en mesure d’utiliser facilement cette technique dans les études précliniques et cliniques de l’inflammation de la peau.

Protocole

Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de l’Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).

1. Inflammation induite par le carraghénane (C-II)

  1. Anesthésier les rats Sprague Dawley mâles et/ou femelles (200–250 g; 8–9 semaines) avec de l’isoflurane (ou un anesthésique injectable).
  2. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en touchant la cornée et en pinçant légèrement la patte postérieure gauche. Lorsque l’animal est correctement anesthésié, aucune réponse cornéenne ou patte ne sera observée.
  3. Injecter par voie sous-cutanée la patte postérieure glabre droite avec 100 μL de 1% (p/v) d’λ-carraghénane dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)20.
    1. Assurez-vous que des témoins appropriés sont utilisés, comme des rats naïfs sans isoflurane dans le présent rapport. Des études préliminaires indiquent que les rats naïfs avec ou sans isoflurane ont la même expression basale d’IL-6 épidermique et de NGF.
      REMARQUE: Les rats naïfs sont des témoins préférés pour les études sur l’inflammation, car une solution saline sous-cutanée ou PBS provoque une inflammation locale23,37.
  4. Évaluer l’œdème des rats C-II pour garantir l’efficacité du carraghénane (Figure 1)20. Déterminez la quantité d’œdème en mesurant l’épaisseur métatarsaire de la patte postérieure avec des étriers.
  5. À 6–12 h, euthanasier les rats avec du CO2 (ou un surdosage anesthésique injectable) et couper des morceaux de 1 mm x 2 mm de peau de patte postérieure glabre avec un scalpel pointu. Si une peau poilue est utilisée, rasez-la avant de couper les morceaux de peau de 1 mm x 2 mm.
    REMARQUE: Assurez-vous que les points temporels appropriés sont choisis en fonction des études spécifiques.
  6. À l’aide de pinces à microdissection, transférer la peau dans 1 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) froid de Dulbecco dans un tube de microcentrifugation sur glace et garder au froid pendant 15 à 60 minutes.

2. Séparation thermolysine de l’épiderme et du derme

  1. Préparer et activer la thermolysine.
    1. Préparer une solution de thermolysine, en ajoutant 5 mg de Geobacillus stearothermophilus à 10 mL de PBS, à pH = 8 (concentration 500 μg/mL).
    2. Préparer une solution 1 M de chlorure de calcium (CaCl2 anhydre) en ajoutant 1,11 g dans 10 mL de H2O distillé.
    3. Pour éviter l’autolyse de la thermolysine, ajouter 10 μL de chlorure de calcium à 10 mL de solution de thermolysine. La concentration finale de chlorure de calcium sera de 1 mM.
    4. Aliquote 1 mL de thermolysine activée dans 10 puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits sur glace.
  2. Utilisez la digestion enzymatique de la thermolysine pour séparer l’épiderme du derme.
    1. À l’aide de pinces à microdissection, transférez un échantillon de peau dans chaque puits de thermolysine activée. Assurez-vous de ne pas immerger la peau dans la solution de thermolysine.
    2. Tapotez doucement la peau sur le côté du puits pour aider à libérer l’échantillon de peau de la pince pour flotter sur la solution de thermolysine.
    3. Faites flotter la peau dans la solution de thermolysine avec la couche cornée (épiderme externe) vers le haut et le derme vers le bas. Il est essentiel que le derme soit face vers le bas, sinon la séparation effective n’aura pas lieu.
      REMARQUE: La durée d’incubation de la thermolysine doit être déterminée empiriquement par l’utilisateur final. La peau glabre de la patte postérieure des rats Sprague Dawley (200–250 g; 8–9 semaines) nécessite souvent 2,0–2,5 h pour la séparation. Le temps d’incubation devrait varier selon l’espèce et l’âge.
    4. Après le temps d’incubation approprié dans la thermolysine, utilisez des pinces à microdissection pour transférer un échantillon de peau dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits avec 7 à 8 mL de DMEM froid (4 °C). Cela laisse plus de place pour la séparation de l’épiderme du derme.
    5. Plongez la peau dans le DMEM.
    6. Brossez doucement l’épiderme avec la pince autour du périmètre de la peau jusqu’à ce que l’épiderme presque translucide soit observé aux frontières. Si cela ne peut pas être réalisé, retournez l’échantillon de peau dans la solution de thermolysine pendant encore 15 à 30 minutes.
    7. Une fois que l’épiderme se sépare sensiblement du derme, tenez soigneusement l’épiderme et le derme avec une pince à microdissection et tirez très lentement l’épiderme du derme.
    8. Évaluez la translucidité de l’épiderme isolé et assurez-vous qu’il est optiquement cohérent. Voir la figure 2 pour un exemple d’échantillon d’épiderme de rat de 1 mm x 2 mm. S’il y a une variation dans la translucidité, alors la séparation appropriée n’a pas eu lieu.
  3. Inactiver la thermolysine à l’aide d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans les morceaux séparés de l’épiderme et du derme.
    ATTENTION: La thermolysine qui reste dans l’épiderme et le derme est toujours active et peut endommager les couches si elle n’est pas inactivée.
    1. Préparez une solution d’EDTA de 0,5 M. Pour ce faire, ajouter lentement 0,93 g d’EDTA dans 5 mL d’eau double distillée. Ajouter l’hydroxyde de sodium à la solution jusqu’à ce qu’elle se dissiper. Assurez-vous que le pH de la solution est d’environ 8,0.
    2. Créez une solution EDTA de 5 mM dans DMEM. Ajouter 0,25 mL de solution mère EDTA de 0,5 M à 25 mL de DMEM.
    3. Placer l’épiderme et le derme séparés dans la solution EDTA/DMEM de 5 mM à 4 °C pendant 30 min pour désactiver l’activité de la thermolysine.
  4. Évaluer l’épiderme avec l’histologie tinctoriale8,9,10.
    1. Fixer une partie de l’épiderme dans un formoline neutre à 10%, 4% de paraformaldéhyde ou 0,25% de paraformaldéhyde avec une solution d’acide picrique à 0,8% pendant 1 h à température ambiante (RT) avec agitation.
    2. Placer l’épiderme fixe dans du saccharose à 10% dans le PBS pendant 1 h à TA avec agitation.
    3. Congeler l’épiderme dans une matrice d’incorporation tissulaire pour le sectionnement. Couper des sections transversales de 14 μm à l’aide d’un cryostat et décongeler des sections sur des lames de microscope en verre revêtues de gélatine.
    4. Sécher les sections sur un réchauffeur à glissière et tacher avec une solution de travail de bleu de toluidine (TB; 10% TB dans 1% de chlorure de sodium) pendant 90 s. Appose couvre les lèvres avec un support de montage aqueux.
    5. Observez l’épiderme avec la microscopie à fond clair à 50x-250x.
      REMARQUE: Si une séparation correcte s’est produite, l’épiderme sera séparé proprement du derme et les cinq couches seront détectées: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum et stratum corneum. Un exemple d’épiderme séparé de la peau de rat peut être vu à la figure 3.

3. Extraction des protéines et analyse par transfert western

  1. Effectuer un transfert western sur les échantillons de tissus séparés en utilisant le protocole21publié précédemment.
  2. Homogénéiser l’épiderme dans 50 μL de tampon de lyse (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% de glycérol et 1% de Triton X-100) contenant un cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase.
  3. Centrifugez des échantillons à une vitesse maximale de 15 min à 4 °C et évaluez le surnageant pour la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines.
  4. Chargez des concentrations égales de protéines (30 μg) sur des gels SDS, effectuez une électrophorèse, puis transférez des protéines dans des membranes de nitrocellulose ou de PVDF.
  5. Bloquer les membranes avec 5% de lait pendant 2 h et incuber pendant la nuit dans un anticorps primaire (anti-NGF de souris, E12, 1:1000).
  6. Laver 3x avec PBS avec 0,3% d’interpolation pendant 10 min chacun et incuber avec un anticorps secondaire marqué (par exemple, IgG anti-souris de lapin marqué à la phosphatase alcaline).
  7. Utilisez un système de balayage pour évaluer le signal western blot (p. ex., substrat ECF et plateforme d’imagerie).

4. Immunohistochimie

  1. Placer les échantillons de tissus dans un fixateur pour une immunoréactivité optimale : 0,96 % (p/v) d’acide picrique et 0,2 % (p/v) de formaldéhyde dans un tampon phosphate de sodium de 0,1 M, pH = 7,321,22,23 pendant 4 h à RT. Transférer à 10 % de saccharose dans du PBS pendant la nuit à 4 °C.
  2. Effectuer une immunohistochimie standard sur les coupes tissulaires21,22,23.
  3. Incorporez l’épiderme des animaux dans un seul bloc congelé dans la matrice d’incorporation et coupez des sections de 10 à 30 μm sur un cryostat. Montez les sections sur des lames de microscope en verre recouvertes de gélatine et séchez-les à 37 °C pendant 2 h.
  4. Laver les sections pendant trois rinçages de 10 min dans le PBS et incuber pendant 24 à 96 h dans l’antisérum primaire [p. ex., anti-NGF de souris (E12, 1:2000)] et le produit génétique anti-protéique de lapin 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) dilué dans du PBS contenant 0,3 % (p/v) de Triton X-100 (PBS-T) PBS-T avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,5 % de polyvinylpyrrolidone (PVP).
  5. Après l’incubation primaire de l’antiséum, rincer les sections trois fois pendant 10 min dans du PBS et incuber 1 h à RT dans Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (1:1000) et Alexa Fluor 555 donkey anti-souris IgG (1:1000) dilué dans PBS-T.
  6. Rincez les sections trois fois dans du PBS pendant 10 minutes et apposez des couvercles avec un milieu de montage non décolorant pour retarder la décoloration de l’immunofluorescence.

5. Isolement de l’ARN et synthèse de l’ADNc

  1. Effectuer une réaction en chaîne par polymérase inverse (RT-PCR) standard sur les échantillons de peau21. Isoler l’ARN total à l’aide d’une solution d’isothiocyanate de phénol et de guanidine.
  2. Effectuer une synthèse complémentaire de l’ADN par la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine Moloney.
  3. Utilisez les séquences d’amorce suivantes pour l’amplification NGF et IL-6 :
    NGF (Sens) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
    NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
    IL-6 (Sens) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
    IL-6 (Antisens) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG
  4. Comparez les niveaux de NGF et d’ARNm IL-6 au gène d’entretien ménager de la β-actine :
    β-ACTIN (Sens) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
    β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
  5. Évaluer avec la RT-PCR qualitative à l’aide d’un cycleur thermique et la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) à l’aide d’un système qRT-PCR.

Résultats

L’injection de carraghénane dans la patte postérieure du rat a provoqué des symptômes classiques d’inflammation tels que rougeur et œdème16,17. Le gonflement de la patte postérieure a été mesuré avec des étriers mécaniques20. Une valeur de référence de l’épaisseur de la patte a été obtenue pour chaque rat avant le traitement au carraghénane et mesurée à nouveau à 6 h et 12 h. L’épaisseur des pattes a été con...

Discussion

L’étude a déterminé que l’épiderme de la peau glabre de la patte postérieure du rat était facilement séparé du derme à l’aide de la thermolysine (0,5 mG / mL) dans le PBS avec 1 mM de chlorure de calcium à 4 ° C pendant 2,5 h. L’évaluation histologique a indiqué que l’épiderme était séparé du derme au niveau de la membrane basale et que les crêtes épidermiques étaient intactes. La thermolysine est une métalloendopeptidase extracellulaire produite parBacillus thermoproteolyticus

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Remerciements

Le financement de cette recherche a été fourni par les National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
λ-carrageenanMillipore Sigma22049Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific4351107For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrousMillipore Sigma499609Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting MediumMillipore SigmaC0612Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-31570Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific11966-025To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acidMillipore SigmaE6758Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptasePromegaM1701For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12)Santa Cruz Biotechnologysc-365944For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5Cedarlane LabsCL7756APFor intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley RatCharles RiverStrain Code 400Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding MatrixThermo Fisher Scientific1310TSTissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA24811For RT-PCR analysis
SYBR Select Master MixThermo Fisher Scientific4472908For RT-PCR analysis
ThermolysinMillipore SigmaT7902From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine BlueMillipore Sigma89640For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026For total RNA extraction for RTPCR

Références

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