Evaluación de la disponibilidad de minerales en los alimentos para peces utilizando métodos complementarios demostrados con el ejemplo de zinc en el salmón del Atlántico

Resumen

Este artículo explica en detalle un enfoque sistemático para evaluar la disponibilidad de microminerales en el salmón del Atlántico. La metodología incluye herramientas y modelos con complejidad biológica creciente: (1) análisis de especiación química, (2) solubilidad in vitro, (3) estudios de captación en líneas celulares y (4) estudios de peces in vivo.

Resumen

Evaluar la disponibilidad de microminerales dietéticos es un desafío importante en la nutrición mineral de las especies de peces. El presente artículo tiene como objetivo describir un enfoque sistemático que combina diferentes metodologías para evaluar la disponibilidad de zinc (Zn) en el salmón del Atlántico(Salmo salar). Teniendo en cuenta que varias especies químicas de Zn pueden estar presentes en un alimento para salmón del Atlántico, se hipotetizó que la disponibilidad de Zn está influenciada por las especies químicas de Zn presentes en el alimento. Por lo tanto, en este estudio, el primer protocolo trata sobre cómo extraer las diferentes especies químicas de Zn del alimento y analizarlas mediante un método de cromatografía de exclusión de tamaño-espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (SEC-ICP-MS). Posteriormente, se desarrolló un método in vitro para evaluar la solubilidad del Zn dietético en los alimentos para salmones del Atlántico. El tercer protocolo describe el método para estudiar el impacto del cambio en la composición de especies químicas de Zn en la absorción de Zn en un modelo epitelial intestinal de peces utilizando una línea celular intestinal de trucha arco iris (RTgutGC). Juntos, los hallazgos de los métodos in vitro se compararon con un estudio in vivo que examinó la aparente disponibilidad de fuentes inorgánicas y orgánicas de Zn suplementadas con alimentos para salmón del Atlántico. Los resultados mostraron que se pueden encontrar varias especies químicas de Zn en los alimentos y la eficiencia de una fuente orgánica de Zn depende en gran medida del ligando de aminoácidos utilizado para quelar Zn. Los hallazgos de los métodos in vitro tuvieron menos correlación con el resultado del estudio in vivo. Sin embargo, los protocolos in vitro descritos en este artículo proporcionaron información crucial sobre la disponibilidad de Zn y su evaluación en los alimentos para peces.

Introducción

La harina y el aceite de pescado se usaban tradicionalmente en la alimentación del salmón del Atlántico. Sin embargo, estos ingredientes están siendo reemplazados cada vez más por ingredientes de origen vegetal¹. El cambio antes mencionado en la composición del alimento ha resultado en una baja disponibilidad dietética y una mayor necesidad de mejorar la disponibilidad de minerales en los alimentos para salmón del Atlántico, especialmente zinc (Zn)². La disponibilidad reducida podría ser el resultado de un cambio en el nivel de Zn, las especies químicas de Zn y/o los factores antinutricionales presentes en la matriz de alimentación. En este escenario, ha surgido una nueva gama de aditivos considerados genéricamente como "fuentes orgánicas" con el potencial de ser una mejor fuente disponible de minerales dietéticos para los peces. Por lo tanto, es importante comprender la química y la fisiología fundamentales que rigen la disponibilidad de minerales y sus fuentes para los peces. El zinc es un oligoelemento esencial para todos los organismos vivos³. El papel del Zn como molécula de señalización se ha descrito tanto a nivel paracelular como intracelular en peces⁴. En el salmón del Atlántico, la deficiencia de Zn se ha asociado con anomalías esqueléticas y actividad reducida de varias metaloenzimas de Zn^5,6.

Este estudio describe un enfoque sistemático para comprender la disponibilidad de Zn clasificándolo en cuatro compartimentos diferentes de complejidad química y biológica variada. Los métodos involucrados se describen en cuatro secciones, como se puede ver en la Figura 1:(1) evaluación de especies químicas de Zn en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico utilizando un método de cromatografía de exclusión de tamaño-espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (SEC-ICP-MS)⁷; (2) solubilidad in vitro del Zn suplementado en los piensos para salmón del Atlántico; (3) evaluación de la absorción de especies químicas de Zn por modelo intestinal in vitro (RTgutGC)⁸; y (4) disponibilidad aparente de Zn en salmón del Atlántico (Salmo salar)⁹. Se pueden desarrollar protocolos similares para otros minerales (por ejemplo, manganeso, selenio, cobre) de interés nutricional para las especies de peces de acuicultura.

Protocolo

El ensayo de alimentación en la sección 4 se realizó de acuerdo con la legislación noruega (FOR-2015-06 - 18-761) y europea (Directiva 2010/63/UE).

1. Evaluación de especies químicas de Zn en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico utilizando un método SEC-ICP-MS

1. Tampón de extracción (100 mM Tris-HCl, pH 8.5)
   1. Prepare el tampón de extracción disolviendo una cantidad adecuada de tris(hidroximetil)aminometano para alcanzar la fuerza iónica deseada (100 mM) en ultrapuro H₂O.
   2. Ajuste el pH de la solución a pH 8.5 con la solución de HCl, monitoreando el cambio de pH con un medidor de pH.
2. Preparación de muestras de piensos
   NOTA: La muestra de alimento utilizada se formuló a base de alimento comercial para salmón del Atlántico, que contiene fuentes de proteínas principalmente de ingredientes de origen vegetal (es decir, aproximadamente 5% de proteína de pescado, 10% de aceite de pescado, 68% de proteína de origen vegetal y 12% de aceite de origen vegetal). El sulfato de zinc se complementó con el alimento.
   1. Moler la muestra de alimento a mano con un mortero y un mortero.
   2. Tamice la muestra de alimentación para asegurarse de que la extracción se realiza en una fracción de alimentación con un tamaño de partícula similar (de 850 μm a 1,12 mm).
   3. Proceda a realizar la extracción de Zn.
3. Extracción de zinc de una muestra de alimento
   1. Pesar aproximadamente 0,5 g de pienso por triplicado en tubos cónicos de 15 ml.
   2. Añadir el tampón de extracción (5 mL de 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) a las muestras.
   3. Extraiga las muestras en un rotador (20 rpm) a 4 °C durante 24 h.
   4. Separar las fracciones solubles y no solubles por centrifugación durante 10 min a 3000 x g.
   5. Utilice un filtro de jeringa desechable de 0,45 μm para filtrar la fracción soluble.
   6. Transfiera las muestras filtradas a los tubos limpios.
   7. Realice el análisis de especiación de Zn en las fracciones solubles utilizando SEC-ICP-MS, como se describe en el paso 1.6.
      NOTA: En la Figura 2se describe un resumen del procedimiento para la extracción de Zn de una muestra de alimentación.
4. Solución de fase móvil (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7.5)
   1. Preparar la solución de fase móvil disolviendo 6.057 g de tris(hidroximetil)aminometano en 1 L de solución de MeOH al 3% (v/v).
   2. Ajuste el pH de la solución a pH a 7.5 con la solución de HCl, monitoreando el cambio de pH con un medidor de pH.
   3. Filtre la solución de fase móvil a través de un filtro de membrana de 0,45 μm.
5. Calibración de peso molecular del rango de separación de columnas SEC
   1. Calibre el rango de separación realizando una calibración de peso molecular.
      NOTA: En este estudio se utilizaron tiroglobulina (660 kDa), superóxido dismutasa Zn/Cu (32 kDa), mioglobina (17 kDa) y vitamina B12 (1,36 kDa).
   2. Preparar cada una de las normas con una concentración conocida en ultrapura H₂O.
   3. Prepare un vial de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) agregando 250 μL de estándar a un vial.
   4. Cargue los viales con estándares a la secuencia de las muestras.
   5. Ejecute la calibración de peso molecular al principio y al final de la secuencia analítica, monitoreando ¹²⁷I (tiroglobulina), ⁶⁶Zn (superóxido dismutasa Zn/Cu), ⁵⁷Fe (mioglobina) y ⁵⁹Co (vitamina B12).
      NOTA: La calibración del peso molecular se realiza simultáneamente con el análisis de especiación de Zn.
6. Análisis de especiación de zinc utilizando SEC-ICP-MS
   NOTA: El análisis de especiación de Zn por el método SEC-ICP-MS se desarrolló en base a los principios descritos en otra parte^10,11 y se realizó una mayor optimización para el análisis de un alimento para salmón del Atlántico⁷.
   1. Realice el análisis de especiación de Zn en las fracciones solubles mediante el uso de una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y un HPLC junto con espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS).
   2. Prepare un vial de HPLC añadiendo 250 μL de fracción soluble a un vial.
   3. Antes del análisis, aumente todas las muestras con 0,5 μL de vitamina B12. Este paso permite corregir los turnos de tiempos de retención, monitoreando ⁵⁹Co.
   4. Diluir la fracción soluble con tampón de extracción (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) y ajustar a un volumen final de 1 mL.
   5. Prepare la secuencia de ejecución de las muestras en orden aleatorio.
   6. Ajuste el ICP-MS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   7. Siga la configuración del instrumento para el HPLC y el ICP-MS realizando el análisis de especiación de Zn (consulte la Tabla 1).

2. Solubilidad in vitro del Zn suplementado en la alimentación del salmón del Atlántico

NOTA: La muestra de alimento utilizada se formuló a base de alimentos comerciales para salmón del Atlántico, que contiene fuentes de proteínas principalmente de ingredientes de origen vegetal (es decir, aproximadamente 5% de harina de pescado, 10% de aceite de pescado, 68% de ingredientes de origen vegetal y 12% de aceite vegetal).

1. Moler las muestras de alimento de salmón del Atlántico durante 10 s a 3000 rpm utilizando un molino de cuchillas y almacenar a 4 ° C hasta un análisis adicional.
2. Pesar ~ 0.2 g de las muestras de alimentación molidas en el paso 2.1 y agregar el radiotrazador Zn⁽⁶⁵Zn) de actividad específica conocida en un tubo de muestra de volumen de 5 ml (con una tapa).
   PRECAUCIÓN: Este procedimiento debe realizarse dentro de una suite de radionúclidos. La persona que realiza este paso debe estar capacitada y certificada para manejar isótopos de radio. Las medidas de seguridad y precaución aconsejadas por la administración de seguridad radiológica del instituto deben seguirse estrictamente.
3. Luego prepare la solución tampón luminal intestinal de agua dulce como se describe a continuación.
   1. Para la solución salina A, pesar 11,65 g de NaNO₃, 0,55 g de KNO₃ y 0,4 g de MgSO₄. Disolver las sales en ultrapura H₂O y ajustar a un volumen final de 60 mL.
   2. Para la solución salina B, pesar 0,31 g de Ca(NO₃)₂· ₄ H₂O. Disolver las sales en ultrapuro H₂O y ajustar a un volumen final de 10 mL.
   3. Utilice la solución de caldo HEPES de 500 mM como solución salina C.
   4. Para la solución salina D, pesar 1,2 g de MgCl_2,disolver la sal en ultrapuro H₂O y ajustar a un volumen final de 20 mL.
   5. Para la solución salina E, pesar 0,9 g de MgSO_4,disolver la sal en ultrapuro H₂O y ajustar a un volumen final de 20 ml.
   6. Preparar solución de piruvato disolviendo 0,55 g de CH₃COCOONa en 10 mL de ultrapuro H₂O.
   7. Disolver 0,9 g de galactosa (C₆H₁₂O₆) en ultrapuro H₂O.
   8. Disolver bien utilizando un agitador magnético y esterilizar las soluciones salinas A, B, D y E mediante autoclave, y la solución C, piruvato y galactosa por filtración a través de un filtro de jeringa de 200 μm.
   9. Después de la preparación de las diferentes soluciones de stock, para preparar 100 mL de solución de trabajo del tampón, mezcle las soluciones preparadas anteriormente en la siguiente proporción: 6.8 mL de solución salina A, 4.14 mL de B, 5 mL de C, 2.5 mL de D, 1.5 mL de E y 1.14 mL cada una de piruvato y galactosa. Ensa consanita el volumen hasta 100 ml con agua desionizada.
      NOTA: El tampón anterior ahora representará la composición iónica de la luz intestinal que se encuentra en los salmónidos de agua dulce.
4. Preparar otras seis alícuotas del tampón descrito en el paso 2.6 y añadir uno de los siguientes aminoácidos (cisteína, metionina, glicina, histidina, lisina y arginina) para alcanzar una concentración molar final de 5 mM.
5. Añadir el tampón luminal intestinal de agua dulce (volumen de reacción = 3 ml; pH 7,4) a la muestra de alimentación.
6. Repita el paso 2.5 con los tampones descritos en 2.4 (en presencia de diferentes aminoácidos a una concentración de 5 mM).
7. Cierre los tubos y déjelos girar en un girador giratorio durante 30 minutos a 25 rpm.
8. Separar las fracciones solubles y no solubles mediante centrifugación durante 10 min a 1157 x g.
9. Utilice un cajero gamma para medir los recuentos por minuto (cpm) de ⁶⁵Zn en las fracciones solubles y no solubles.
10. Calcular la proporción de los isótopos de radio de Zn⁽⁶⁵Zn) presentes en las fracciones solubles y no solubles.

3. Evaluación de la absorción de especies químicas de Zn utilizando un modelo intestinal in vitro (RTgutGC)

1. Cultivo de células RTgutGC
   NOTA: Todos los materiales de trabajo utilizados en este paso deben ser estériles.
   1. Revive las células RTgutGC congeladas suavemente en un baño de agua a 20 °C.
   2. Pipetee suavemente la solución que contiene las células y suspenda en 10 ml de medio L15 que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS).
      NOTA: El 10% de FBS solo se usa para revivir las células congeladas. Para el paso posterior, FBS se utiliza al 5%. La composición de FBS puede variar entre lotes, por lo que es recomendable comprar y almacenar tanto como sea necesario de un solo lote para evitar variaciones entre lotes en la composición del suero.
   3. Añadir la suspensión celular a matraces de cultivo celular de 75 cm² e incubar en una incubadora a 19 °C en atmósfera normal.
   4. Verifique las células y cuando estén confluentes (80% de confluencia, evalúe visualmente examinando la densidad de la superficie celular bajo un microscopio), divida las células en nuevos matraces (paso posterior) o recolecte para usar en experimentos.
      NOTA: Un ejemplo de las células RTgutGC 1 h y 1 semana después de la siembra a los matraces de cultivo celular se muestra en la Figura 3.
2. Recolección celular y preparación para experimentos de exposición
   1. Lave las células dos veces con 1 ml de solución de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA). Después de cada lavado, desvía la solución de EDTA con un tubo de succión estéril.
   2. Tratar las células con tripsina (0,7 ml de tripsina, en un 0,25% en solución salina tamponada con fosfato [PBS]).
   3. Gire suavemente el matraz en ángulos agudos para extender la tripsina a lo largo de la superficie del matraz.
   4. Continúe la rotación durante 2 minutos, mientras las celdas se separan.
   5. Después de girar suavemente durante 2 min, agregue 10 ml de medio L15 / FBS para neutralizar la tripsina.
   6. Decantar la suspensión celular resultante en un tubo cónico de centrífuga inferior utilizando una pipeta estéril y centrífuga durante 3 min a 130 x g.
   7. Determine la densidad de las células cosechadas mediante el conteo manual utilizando hemocitómetro.
   8. Agregue el volumen requerido del medio L15 / FBS para alcanzar una densidad celular de 5 x 10⁴ celdas / ml.
   9. Sembrar las células en placas de 24 pozos pipeteando 1 ml de suspensión celular por pozo para alcanzar la densidad celular final de 5 x 10⁴ células/pozo.
      NOTA: Preferiblemente use pipetas de dispensación múltiple para minimizar la variación y reducir el tiempo.
   10. Coloque las placas secuedradas en una incubadora bajo atmósfera normal a 19 °C durante 48 h antes de los experimentos.
       NOTA: Tripsina para almacenar a -20 °C; Solución EDTA y medios L15/FBS a 4 °C. Ajuste la temperatura de todas las soluciones y medios de trabajo a 19 °C justo antes de su uso.
3. Preparación de medios de exposición
   NOTA: Este paso debe realizarse bajo la campana de humos en condiciones asépticas y estériles.
   1. Preparar L15/ex mezclando 6,8 ml de solución salina A (paso 2.3.1), 1,14 ml de B (paso 2.3.2), 5 ml de C (paso 2.3.3) y 1,14 ml de piruvato (paso 2.3.6) y galactosa (paso 2.3.7). Ensa consaní el volumen hasta 100 ml utilizando agua destilada estéril de grado de cultivo celular.
   2. Preparar FW mezclando 6,8 ml de solución salina A (2.3.1), 4,14 ml de B (2.3.2), 5 ml de C (2.3.3), 2,5 ml de D (2.3.4), 1,5 ml de E (2.3.5) y 1,14 ml de piruvato (2.3.6) y galactosa (2.3.7). Ensanche el volumen hasta 100 ml utilizando agua destilada estéril de grado de cultivo celular.
   3. Cuantificar las concentraciones de iones en los medios de exposición utilizando ICP-MS como se describe en otra parte¹².
      NOTA: Las concentraciones iónicas analizadas en las preparaciones de medios se presentan en la Tabla 2.
4. Ensayos de afluencia de zinc⁽⁶⁵Zn)
   1. Sembrar las células RTgutGC en placas de 24 pozos (5 x 10⁴ células/pozo) en medio completo L15/FBS.
   2. Incubar durante 48 h en una incubadora con atmósfera normal a 19 °C.
   3. Ajustar todas las preparaciones de medios experimentales a pH 7.4 usando 0.5 M NaOH en presencia o ausencia de L-metionina (L-Met) o DL-metionina (DL-Met) a una concentración de 2 mM.
      NOTA: El ajuste del pH de los tampones descritos en 3.4.3 debe realizarse recién antes del tratamiento de las células en el paso 3.4.5.
   4. Después de completar el período de incubación, retire el medio de los pomos y enjuague bien con PBS.
   5. Agregue el medio experimental FW ajustado al pH y deje que se aclimate durante 20 minutos.
   6. Exponer las células RTgutGC a concentraciones nominales de 3,07, 6,14, 12,27 y 24,55 μM ⁶⁵Zn(II) (como ZnCl₂; ~4 kBq/mL) en los medios descritos en el paso 3.4.3.
   7. Inmediatamente después, mantenga las células en la incubadora a 19 °C durante 15 min.
   8. Después de que termine la incubación de 15 minutos, aspire el sobrenadante de cultivo y retire del pozo.
   9. Enjuague las células con medio FW helado (con 200 μM Zn, pH 7.4) y luego esconda mediante la adición del tampón de etilenglicol-bis(éter β-aminoetilo)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) de 5 mM (pH 7.4) durante 5 min, para deshacerse de cualquier ⁶⁵Zn(II) adsorbido.
   10. Exponer las células a las preparaciones de medios anteriores en presencia o ausencia de 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] ácido heptano-2-carboxílico (BCH), un inhibidor del transporte de aminoácidos.
   11. Después del período de exposición de 15 min, repita los pasos 3.4.8 y 3.4.9.
   12. Las células RtgutGC se adherirán al fondo de los pozos como una monocapa. Digiera las células usando detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) caliente al 0,2% (100 μL/pozo).
       NOTA: La solución SDS debe colocarse durante 1 h en un baño de agua a 90 °C antes de su uso.
   13. Aspirar y recuperar el digestato celular en un tubo de 1,5 ml.
   14. Mida la radiactividad de los digestos celulares utilizando un contador gamma.
       NOTA: Los recuentos por minuto (cpm) deben corregirse para la desintegración radiactiva, la actividad de fondo y se someten a cálculos de actividad específicos siguiendo las fórmulas descritas por Glover y Hogstrand¹³.
   15. Para cuantificar la concentración de proteínas de las células, homogeneizar las células con 500 μL de 0,5 M NaOH.
   16. Utilice un kit de ensayo de Bradford para medir la concentración de proteínas en la muestra celular, con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar.
       NOTA: Una vez cuantificada la concentración de proteínas, la tasa de absorción de Zn por las células RTgutGC se puede expresar como proteína pmoles Zn min^-1 mg^-1.

4. Disponibilidad aparente de Zn dietético en salmón del Atlántico (Salmo salar)

NOTA: Los alimentos para salmón del Atlántico se formularon a base de alimentos comerciales, que contienen fuentes de proteínas principalmente de ingredientes de origen vegetal (es decir, aproximadamente 5% de proteína de pescado, 10% de aceite de pescado, 68% de proteína de origen vegetal y 12% de aceite de planta). Dos alimentos se complementaron con una fuente inorgánica (sulfato de Zn) o una fuente orgánica (quelato de Zn de glicina) para lograr una concentración de Zn de 150 mg / kg de alimento. Además, se agregó óxido de itrio (grado de alimentación) al alimento al 0,01% como marcador inerte para permitir el cálculo del coeficiente de disponibilidad aparente.

1. Aclimatar el salmón del Atlántico (cepa SalmoBreed, edad 1+ años, grupos mixtos) en sus respectivos tanques hasta que los peces se acostumbren a las condiciones experimentales.
2. Evaluar la aclimatación del salmón del Atlántico mediante el control de su ingesta diaria de alimento.
   NOTA: Esta prueba se realizó en tanques triplicados, por lo que se utilizaron un total de seis tanques. Durante el ensayo de alimentación, la temperatura del agua fue de 11,9 ± 0,3 °C y la saturación de oxígeno disuelto fue de 101 ± 5%.
3. Alimente a los peces con alimentos experimentales durante 11 días.
4. Sacrificar a los peces por sobredosis usando 6 ml de solución de caldo de metanosulfonato de tricaína por litro de agua.
5. Recolecte una muestra agrupada de heces de los peces del mismo tanque en un plato mediante rayas desde la aleta ventral hasta el ano.
6. Retire las heces de la placa con una espátula en un tubo cónico de 50 ml y almacene inmediatamente las muestras a -20 ° C.
   NOTA: Las muestras se mantuvieron a -20 °C hasta un análisis adicional.
7. Seque congele las muestras de heces durante 72 h a -80 °C.
8. Homogeneice manualmente la muestra de heces en un polvo fino utilizando un mortero y mortero.
9. Determinar la concentración de Zn e itrio en las muestras de alimento y heces utilizando un ICP-MS (como se describe en otra parte^9).
10. Determinar el coeficiente de disponibilidad aparente (CAA, %) utilizando la siguiente fórmula:
    

Resultados

Evaluación de especies químicas de Zn en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico utilizando un método SEC-ICP-MS
El método SEC-ICP-MS proporciona datos sobre las especies químicas de Zn que se encuentran en la fracción soluble de la alimentación del salmón del Atlántico. La Figura 4 ilustra el perfil cromatográfico de Zn encontrado en la fracción soluble. Este cromatograma se obtuvo utilizando el método SEC-ICP-MS. Se encontraron cinco picos que contenían Zn en las fracciones solubles de la alimentación del salmón del Atlántico. Cada pico tiene un peso molecular diferente; pico uno (~ 600 kDa), pico dos y pico tres (de 32 a 17 kDa), pico cuatro (de 17 a 1,36 kDa) y pico cinco (> 1,36 kDa). El pico cuatro fue el más abundante, seguido por el pico dos, tres, cinco y uno, respectivamente. Las especies químicas de Zn que se encuentran en la fracción soluble pueden tener diferentes fuentes porque el alimento utilizado contiene ingredientes marinos y vegetales, y forma suplementada (es decir, sulfato de Zn). El rango de peso molecular de las especies químicas de Zn sugirió que estos compuestos podrían ser metaloproteínas.

Solubilidad in vitro del Zn suplementado en piensos para salmón del Atlántico
La solubilidad de ⁶⁵Zn suplementados aumentó en presencia de aminoácidos. Todos los aminoácidos probados aumentaron la solubilidad de ⁶⁵Zn suplementados. Metionina, glicina, cisteína, histidina y lisina mejoraron la solubilidad ^{de 65}Zn; se encontró mayor solubilidad con histidina y lisina(Figura 5).

Evaluación de la absorción de especies de Zn utilizando un modelo intestinal in vitro (RTgutGC)
La absorción apical de zinc en las células RTgutGC fue influenciada significativamente por la presencia de L-Met o DL-Met a concentraciones de 2 mM. Además, el impacto de la metionina en la absorción de Zn en las células RTgutGC se vio afectado negativamente por la presencia de BCH (un bloqueador del sistema de transporte de aminoácidos), en comparación con las células no tratadas con BCH (Figura 6).

Disponibilidad aparente de Zn dietético en salmón del Atlántico (Salmo salar)
En los alimentos prácticos para el salmón del Atlántico, la disponibilidad aparente de Zn era la misma cuando se complementaba con una fuente inorgánica (sulfato de Zn) o una fuente orgánica (quelato de Zn de glicina). Los valores estimados para la disponibilidad aparente de Zn (%, n = 3) en el salmón del Atlántico fueron del 31% ± 12% cuando se suplementa con una fuente inorgánica (sulfato de Zn) y del 31% ± 3% cuando se complementa una fuente orgánica (quelato de Zn de glicina).

Figura 1: Resumen del enfoque sistemático para evaluar la disponibilidad de minerales utilizando métodos complementarios. Este enfoque se utilizó para estudiar la disponibilidad de zinc en el salmón del Atlántico, incluida la especiación de Zn, la solubilidad de Zn en el ambiente intestinal, la absorción de Zn por las células intestinales y la disponibilidad aparente de Zn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resumen del procedimiento para la extracción de Zn de una muestra de pienso. El zinc se extrae de una muestra de alimento utilizando condiciones de extracción suaves. La extracción es seguida por el análisis de especiación de Zn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Un ejemplo de las células RTgutGC 1 h (izquierda) y 1 semana (derecha) después de la siembra en los matraces de cultivo celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Un cromatograma que muestra los picos que contienen Zn de la fracción soluble de la alimentación del salmón del Atlántico y analizado por SEC-ICP-MS. Las tres réplicas se caracterizan por las líneas azul, roja y negra. Se realizó una calibración de peso molecular utilizando tiroglobulina (660 kDa, monitoreo ¹²⁷I), superóxido dismutasa Zn/Cu (32 kDa, monitoreo ⁶⁶Zn), mioglobina (17 kDa, monitoreo ⁵⁷Fe), vitamina B12 (1.36 kDa, monitoreo ⁵⁹Co); Pico 1 (P1): ~600 kDa, tiempo de retención (RT) 8.2 min; Pico 2+3 (P2+3): de 32 a 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Pico 4 (P4): de 17 a 1,36 kDa, RT 16,3 min; Pico 5 (P5): > 1.36 kDa, Rt 23.2 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El impacto de los aminoácidos en la solubilidad in vitro del Zn suplementado en la alimentación del salmón del Atlántico. Los datos se presentan como media ± deS (n = 3). Los datos se analizaron a través de ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnet, comparando la media de cada grupo de AA con la del grupo de control (No AA). Los asteriscos denotan el nivel de significancia de ANOVA (valores P < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) y < 0,0001 (****)). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: La influencia de la metionina y un inhibidor del transporte de aminoácidos (ácido 2-aminobiciclo [2.2.1] heptano-2-carboxílico, BCH, 10 mM). Los datos se presentan como media ± deS (n = 3). Los datos se analizaron a través de ANOVA bidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey con p < nivel de significancia de 0,05. Las diferencias post-hoc entre los grupos se representan como una letra de superíndice sobre las barras; las barras con diferentes superíndices son estadísticamente diferentes (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Configuración de HPLC
Columna	Columna SEC (30 cm x 7,8 mm, tamaño de partícula de 5 μm) + columna de protección (tamaño de partícula de 7 μm)
Rango de calibración	1,0 × 104 - 5,0 × 105 Da
Fase móvil	50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7.5)
Gasto	0,7 ml min−1
Volumen de inyección	50 μL
Configuración de ICP–MS
Potencia de avance	1550 W
Flujo de gas de plasma	15,0 L mín−1
Flujo de gas portador	0,86 L mín−1
Flujo de gas de maquillaje	0,34 L min−1
Tiempo de permanencia	0,1 s por isótopo
Isótopos monitoreados	127 I, 66Zn, 59Co, 57Fe

Tabla 1. Una descripción general de la configuración del instrumento para HPLC e ICP-MS.

Composición química (mM)	L15/ex	Medio experimental (L15/FW)
Nitrato de sodio	155	155
Nitrato de potasio	6.2	6.2
Sulfato de magnesio	3.8	19.5
Nitrato de calcio	1.5	5.4
HEPES	5	5
Cloruro de magnesio	-	15
Piruvato de sodio	5.7	5.7
Galactosa	5.7	5.7
pH	7.1	7.4
Fuerza iónica	178	258
Composición iónica (mM)
Calcio, Ca2+ *	1,6 ± 0,1	5.3 ± 0.2
Magnesio, Mg2+ *	3,9 ± 0,3	32,5 ± 0,7
Potasio, K+ *	8.2 ± 1.2	8.6 ± 1.1
Sodio, Na+ *	160 ± 3	157 ± 2
Nitrato, NO3- **	164	172.4
Sulfato, SO4- **	3.8	18.7
Cloruro, Cl- **	1.5	31.5

Tabla 2. La composición química e iónica de los medios experimentales probados.

Discusión

La absorción intestinal de Zn parece estar influenciada por la forma química de la especie Zn¹³. En este sentido, el uso de los protocolos descritos en este artículo permitió el estudio secuencial de los aspectos químicos y biológicos subyacentes a la "disponibilidad" de Zn en el salmón del Atlántico.

Este estudio informó el uso de un método de análisis de especiación de Zn. El método SEC-ICP-MS proporcionó datos cualitativos sobre el peso molecular de las especies químicas de Zn presentes en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico. Esto se logró comparando los tiempos de retención de los estándares de calibración de peso molecular (es decir, tiroglobulina (660 kDa), superóxido dismutasa Zn/Cu (32 kDa), mioglobina (17 kDa) y vitamina B12 (1,36 kDa)) con los tiempos de retención de picos que contienen Zn. Un desafío encontrado en el análisis de especiación de Zn fue la identificación de las especies químicas desconocidas de Zn debido a la falta de estándares analíticos. En SEC, la separación de las moléculas se basa en sus tamaños en relación con los poros en la fase estacionaria. En principio, las moléculas más grandes viajarán más rápido, eluyendo primero, y las moléculas más pequeñas viajarán más lentamente, eluiendo más tarde¹⁴. En consecuencia, cada pico de Zn que contiene podría contener varios compuestos con un peso molecular similar¹⁵. Esto también contribuye al desafío de identificar especies químicas desconocidas de Zn. Además, se probaron varias condiciones de extracción suaves para la extracción de Zn. El Zn extraído fue bajo (~10%). Se aplicaron condiciones de extracción suaves para mantener intactas las especies químicas de Zn, pero esto puede haber comprometido la eficiencia de extracción⁷.

En el ensayo de solubilidad in vitro, la solubilidad del Zn suplementado (como radioisótopo ⁶⁵ZnCl₂₎indicó que los aminoácidos, especialmente la histidina y la lisina, aumentaron la solubilidad del Zn (Figura 5). El uso de muestras de alimentación directamente para ensayos de solubilidad in vitro en condiciones gastrointestinales simuladas se basa en el conocimiento de que el cambio en la especiación de Zn depende del pH¹⁶. Sin embargo, las condiciones ácidas al comienzo del tracto gastrointestinal pueden dar lugar a algún cambio en la especiación que podría ser irreversible (por ejemplo, ZnO -> ZnCl_2,en presencia de HCl en condiciones ácidas en el estómago). Sin embargo, la fuente de Zn utilizada aquí es ZnSO₄ y su solubilidad fue mejorada por aminoácidos en el medio. La siguiente pregunta a responder fue, ¿se puede traducir el aumento de la solubilidad en disponibilidad? Se utilizó la línea celular intestinal RTgutGC para estudiar esta cuestión. En el contexto de la nutrición mineral en animales, el término "disponibilidad" es difícil de definir y puede regularse diferencialmente en las células (in vitro) en comparación con un animal (in vivo). Por lo tanto, el término "absorción" se utilizó cuando se trataba de la evaluación in vitro utilizando una línea celular intestinal. La línea celular proporcionó información útil sobre los mecanismos de absorción de Zn en el epitelio intestinal, que es parte del complejo proceso regulador que rige la disponibilidad de minerales en los animales. Las células RTgutGC provocaron una mejor capacidad para la absorción apical de Zn en presencia de un aminoácido (es decir, metionina; Figura 6). Sin embargo, la disponibilidad aparente in vivo no difirió significativamente entre las fuentes de Zn inorgánicas y orgánicas en el salmón del Atlántico. En el estudio de disponibilidad in vivo, la comparación de la fuente de Zn se realizó a niveles dietéticos de Zn que exceden con creces los requisitos conocidos de Zn del salmón del Atlántico^17,concentración total de Zn de 150 mg / kg de alimento. Las diferencias en la disponibilidad se visualizan mejor cuando los niveles dietéticos probados caen en el rango dinámico lineal antes de que el animal alcance la saturación. En el presente estudio in vivo, es posible que el salmón del Atlántico estuviera bien saturado para observar la diferencia en la absorción de Zn entre las fuentes utilizadas.

En resumen, el primer método proporcionó información cualitativa sobre diferentes especies químicas de Zn que se encuentran en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico; el segundo método, la solubilidad in vitro del Zn suplementado se mejoró en presencia de ligandos de aminoácidos; el tercer método confirmó que la mejora de la solubilidad por aminoácidos puede mejorar la absorción en el epitelio intestinal; por el contrario, el cuarto método no logró encontrar diferencias en la disponibilidad de Zn de fuente inorgánica u orgánica al salmón del Atlántico. Para concluir, aunque no están alineados con los hallazgos in vivo, los protocolos in vitro proporcionaron información interesante para comprender los diferentes componentes de la disponibilidad de Zn.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Sartorius
0.45 μm membrane filter	Pall
10 % fetal bovine serum	Eurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter	LKB Wallac
24 well plates (Falcon, TPP microplates)	Thermo Fisher Scientific	10048760
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid	Sigma Aldrich	A7902
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks)	TPP Techno Plastic Products AG	90075
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
Bradford assay kit	Bio-Rad	5000001
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5702
L-Cysteine	Sigma Aldrich	30089
DL-methionine	Alfa Aesar	59-51-8
D-methionine	Sigma Aldrich	M9375
Experimental fish feeds	Skretting
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size)	Tosoh
L-Histidine	Sigma Aldrich	53319
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS	Agilent Technologies
Hydrochloric acid	Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck	1.00317
Knife mill	GM 300, Retsch Gmbh
L-15 medium	Invitrogen/Gibco	21083027
L-methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Lysine	Sigma Aldrich	23128
Methanol	LiChrosolv, HPLC grade, Merck	1.06035
Milli-Q water (18.2 MΩ cm)	EMD Millipore Corporation
Myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
NexION 350D ICP-MS	Perkin Elmer
Pasteur pipette	VWR
pH meter	inoLab
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	806552
RTgutGC cells			Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland
SEC column, TSKgel G3000SWxl	Tosoh
Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm)	Retsch
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	436143
Superoxide dismutase	Sigma Aldrich	S7571
Thyroglobulin	Sigma Aldrich	T1001
Tricaine methanesulphonate	PharmaQ
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma Aldrich	252859
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline	Biowest	L0910
Versene EDTA solution	Invitrogen/Gibco	15040-033
Vitamin B12	Sigma Aldrich	V2876
Zinc chelate of glycine	Phytobiotics
Zinc sulphate	Vilomix