Atlantik Somonunda Çinko Örneğiyle Gösterilen Tamamlayıcı Yöntemler Kullanılarak Balık Yemlerinde Mineral Kullanılabilirliğinin Değerlendirilmesi

Özet

Bu makalede, Atlantik somonunda mikro mineral kullanılabilirliğini değerlendirmek için sistematik bir yaklaşım ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Metodoloji, biyolojik karmaşıklığı artan araç ve modelleri içerir: (1) kimyasal spektasyon analizi, (2) in vitro çözünürlük, (3) hücre hatlarında alım çalışmaları ve (4) in vivo balık çalışmaları.

Özet

Diyet mikro minerallerinin mevcudiyetini değerlendirmek, balık türlerinin mineral beslenmesinde önemli bir zorluktur. Bu makale, Atlantik somonunda(Salmo salar)çinko (Zn) mevcudiyetini değerlendirmek için farklı metodolojileri birleştiren sistematik bir yaklaşımı tanımlamayı amaçlamaktadır. Atlantik somon yemlerinde birkaç Zn kimyasal türünün bulunabileceği göz önüne alındığında, Zn mevcudiyetinin yemde bulunan Zn kimyasal türlerinden etkilendiği varsayılmıştı. Bu nedenle, bu çalışmada, ilk protokol farklı Zn kimyasal türlerinin yemden nasıl çıkarılacağı ve bunların bir boyut dışlama kromatografisi-endüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi (SEC-ICP-MS) yöntemi ile analiz etmekle ilgilidir. Daha sonra, Atlantik somon yemlerinde diyet Zn'nin çözünürlüğünü değerlendirmek için bir in vitro yöntem geliştirilmiştir. Üçüncü protokol, gökkuşağı alabalık bağırsak hücre hattı (RTgutGC) kullanarak bir balık bağırsak epitel modelinde Zn kimyasal tür bileşimini değiştirmenin Zn alımı üzerindeki etkisini incelemek için yöntemi açıklar. Birlikte, in vitro yöntemlerden elde edilen bulgular, Atlantik somon yemlerine takviye edilen inorganik ve organik Zn kaynaklarının belirgin mevcudiyetini inceleyen bir in vivo çalışma ile karşılaştırıldı. Sonuçlar, yemlerde birkaç Zn kimyasal türünün bulunabileceğini ve organik bir Zn kaynağının verimliliğinin Zn'yi şelatlamak için kullanılan amino asit ligand'a çok bağlı olduğunu göstermiştir. In vitro yöntemlerin bulguları in vivo çalışmanın sonucu ile daha az korelasyona sahipti. Bununla birlikte, bu makalede açıklanan in vitro protokoller, Zn'nin mevcudiyeti ve balık yemlerindeki değerlendirmesi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır.

Giriş

Atlantik somon yemlerinde geleneksel olarak balık unu ve balık yağı kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu bileşenler giderek daha fazla bitki bazlı bileşenlerle değiştirilmektedir¹. Yem bileşimindeki yukarıda belirtilen kayma, düşük diyet mevcudiyeti ve Atlantik somon yemlerinde, özellikle çinko (Zn) 2'de mineral kullanılabilirliğini artırmaya yönelik ihtiyacın artmasına neden^olmuştur. Kullanılabilirlik azalması, yem matrisinde bulunan Zn seviyesindeki, Zn kimyasal türlerindeki veya/ve besin karşıtı faktörlerdeki bir değişikliğin bir sonucu olabilir. Bu senaryoda, genel olarak 'organik kaynaklar' olarak kabul edilen yeni bir dizi katkı maddesi, balıklar için daha iyi bir diyet minerali kaynağı olma potansiyeli ile ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, minerallerin ve balık kaynaklarının mevcudiyetini düzenleyen temel kimya ve fizyolojiyi anlamak önemlidir. Çinko tüm canlı organizmalar için önemli bir eser elementtir³. Zn'nin sinyal molekülü olarak rolü balıklarda hem paraselüler hem de hücre içi düzeyde tanımlanmıştır⁴. Atlantik somonunda, Zn eksikliği iskelet anormallikleri ve çeşitli Zn metalloenzimlerin aktivitesinin azalması ile ilişkilendirilmiştir^5,6.

Bu çalışma, Zn kullanılabilirliğini çeşitli kimyasal ve biyolojik karmaşıklığın dört farklı bölmesine kategorize ederek anlamak için sistematik bir yaklaşımı açıklar. İlgili yöntemler, Şekil 1'dede görülebileceği gibi dört bölümde açıklanmıştır: (1) Atlantik somon yeminin çözünür fraksiyonunda Zn kimyasal türlerinin bir boyut dışlama kromatografisi-endüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi (SEC-ICP-MS) yöntemi kullanılarak değerlendirilmesi^7; (2) Atlantik somon yemlerinde takviyeli Zn'nin in vitro çözünürlüğü; (3) in vitro intestinal model (RTgutGC)⁸ile değerlendirme Zn kimyasal türleri alımı; ve (4) Atlantik somonunda Zn'nin görünür mevcudiyeti (Salmo salar)⁹. Su ürünleri balık türlerine besinsel ilgi alanı olan diğer mineraller (örneğin manganez, selenyum, bakır) için de benzer protokoller geliştirilebilir.

Protokol

Bölüm 4'teki besleme denemesi Norveççe (FOR-2015-06 - 18-761) ve Avrupa mevzuatına (Direktif 2010/63/AB) göre gerçek gerçekleştirildi.

1. Sec-ICP-MS yöntemi kullanılarak Atlantik somon yeminin çözünür fraksiyonunda Zn kimyasal türlerinin değerlendirilmesi

1. Ekstraksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, pH 8.5)
   1. Ultra saf H₂O'da istenen iyonik mukavemete (100 mM) ulaşmak için uygun miktarda tris (hidroksimetil)aminometan eriterek ekstraksiyon tamponu hazırlayın.
   2. Çözeltinin pH'ını HCl çözümü ile pH 8.5'e ayarlayın ve pH değişimini bir pH ölçerle takip edin.
2. Yem örneklerinin hazırlanması
   NOT: Kullanılan yem örneği, esas olarak bitki bazlı bileşenlerden (%5'e kadar balık proteini, %10 balık yağı, %68 bitki bazlı protein ve %12 bitki bazlı yağ) protein kaynakları içeren Atlantik somonu için ticari yemlere dayalı olarak formüle edilmiştir. Çinko sülfat yem için desteklendi.
   1. Yem örneğini bir pestle ve harç kullanarak elle öğütün.
   2. Ekstraksiyonun benzer parçacık boyutuna (850 μm ila 1,12 mm) sahip bir besleme fraksiyonunda gerçekleştirilmesini sağlamak için besleme örneğini elekleyin.
   3. Zn çıkarma işlemini gerçekleştirmeye devam edin.
3. Yem örneğinden çinko ekstraksiyonu
   1. 15 mL konik borulara üç taraflı olarak yaklaşık 0,5 g yem ağırlığındadır.
   2. Ekstraksiyon tamponu (5 mL 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) numunelere ekleyin.
   3. Numuneleri 24 saat boyunca 4 °C'de bir rotatorda (20 rpm) çıkarın.
   4. Çözünür ve çözünmeyen fraksiyonları 3000 x g'da10 dakika santrifüjleme ile ayırın.
   5. Çözünür fraksiyonu filtrelemek için 0,45 μm tek kullanımlık şırınna filtresi kullanın.
   6. Filtrelenmiş numuneleri temiz tüplere aktarın.
   7. 1.6. adımda açıklandığı gibi SEC-ICP-MS kullanarak çözünür kesirlerde Zn belirtim çözümlemesi gerçekleştirin.
      NOT: Bir besleme örneğinden Zn ekstraksiyonu prosedürünün bir özeti Şekil 2'de açıklanmıştır.
4. Mobil faz çözümü (50 mM Tris-HCl + %3 MeOH, pH 7,5)
   1. 6.057 g tris (hidroksimetil)aminometan çözünen mobil faz çözeltisini %3 MeOH çözeltisinin (v/v) 1 L'sinde hazırlayın.
   2. PH değişimini bir pH ölçerle izleyerek, çözümün pH'ını HCl çözümüyle pH'a 7,5'e ayarlayın.
   3. Mobil faz sokumunu 0,45 μm membran filtresinden geçirin.
5. SEC sütun ayırma aralığının moleküler ağırlık kalibrasyonu
   1. Moleküler ağırlık kalibrasyonu yaparak ayırma aralığını kalibre edin.
      NOT: Bu çalışmada tiroglobulin (660 kDa), Zn/Cu süperoksit dismutaz (32 kDa), miyoglobin (17 kDa) ve B12 vitamini (1.36 kDa) kullanılmıştır.
   2. Standartların her birini ultra saf H₂O'da bilinen bir konsantrasyonla hazırlayın.
   3. Bir şişeye 250 μL standart ekleyerek yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) şişesi hazırlayın.
   4. Şişeleri örneklerin sıralı çalışmasına standartlarla yükleyin.
   5. Moleküler ağırlık kalibrasyonunu analitik dizinin başında ve sonunda çalıştırın, ¹²⁷I (tiroglobulin), ^{66 Zn}(Zn/Cu süperoksit dismutaz), ⁵⁷Fe (miyoglobin) ve ⁵⁹Co (B12 vitamini) izlenmesini izler.
      NOT: Moleküler ağırlık kalibrasyonu, Zn speciation analizi ile aynı anda gerçekleştirilir.
6. SEC-ICP-MS kullanılarak çinko spektrasyon analizi
   NOT: SEC-ICP-MS yöntemi ile Zn spesifikasyon^{analizi,10 , 11'in}başka bir yerinde açıklanan ilkelere dayanarak geliştirilmiş^ve Atlantik somon yemi⁷analizi için daha fazla optimizasyon gerçeklenmiştir.
   1. Bir boyut dışlama kromatografisi (SEC) sütunu ve endüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS) ile birleştirilmiş bir HPLC kullanarak çözünür fraksiyonlar üzerinde Zn spesifikasyon analizini gerçekleştirin.
   2. Bir şişeye 250 μL çözünür fraksiyon ekleyerek bir HPLC şişesi hazırlayın.
   3. Analizden önce, tüm örnekleri 0,5 μL B12 vitamini ile çivilenin. Bu adım, saklama süreleri vardiyalarını düzeltmeye ve ⁵⁹Co'nun izlenmesine olanak tanır.
   4. Çözünür fraksiyonu ekstraksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) ile seyreltin ve 1 mL'lik son hacme ayarlayın.
   5. Örneklerin sıra çalışmasını rasgele sırayla hazırlayın.
   6. ICP-MS'i üreticinin yönergelerine göre ayarlayın.
   7. Zn speciation analizini gerçekleştiren HPLC ve ICP-MS için cihaz ayarlarını izleyin (bkz. Tablo 1).

2. Atlantik somon yemlerinde takviyeli Zn'nin in vitro çözünürlüğü

NOT: Kullanılan yem örneği, esas olarak bitki bazlı bileşenlerden (%5'e kadar balık unu, %10 balık yağı, %68 bitki bazlı içerik ve %12 bitkisel yağ) protein kaynakları içeren Atlantik somonu için ticari yemlere dayanarak formüle edilmiştir.

1. Atlantik somon yem örneklerini bir bıçak değirmeni kullanarak 3000 rpm'de 10 sn öğütün ve bir sonraki analize kadar 4 °C'de saklayın.
2. Adım 2.1'de besleme numunelerinin ~0,2 g'ını tartın ve 5 mL hacimli bir numune tüpüne (kapaklı) bilinen belirli aktivitenin Zn radyotracer'ını⁽⁶⁵Zn) ekleyin.
   DİkKAT: Bu prosedür bir radyonüklid paketi içinde yapılmalıdır. Bu adımı gerçekleştiren kişi radyo izotoplarını işlemek için eğitilmeli ve sertifikalandırılmalıdır. Enstitünün radyasyon güvenliği idaresi tarafından tavsiye edilen güvenlik ve ihtiyati tedbirlere kesinlikle uyulmalıdır.
3. Daha sonra aşağıda açıklandığı gibi tatlı su bağırsak ışık tampon çözeltisini hazırlayın.
   1. Tuz çözeltisi A için, 11,65 g NaNO_3,0,55 g KNO₃ ve 0,4 g MgSO₄ağırlığındadır. Tuzları ultra saf H₂O'da çözün ve 60 mL'lik son hacme ayarlayın.
   2. Tuz çözeltisi B için 0,31 g Ca(NO₃₎₂· ₄ H₂O. Tuzları ultra saf H₂O'da çözün ve 10 mL'lik son hacme ayarlayın.
   3. Tuz çözeltisi C olarak 500 mM HEPES stok çözeltisi kullanın.
   4. Tuz çözeltisi D için, 1,2 g MgCl₂ağırlığında, tuzu ultra saf H₂O'da çözün ve 20 mL'lik son hacme ayarlayın.
   5. Tuz çözeltisi E için, 0,9 g MgSO₄ağırlığında, tuzu ultra saf H₂O'da çözün ve 20 mL'lik son hacme ayarlayın.
   6. 0,55 g CH₃COCOONa'yı 10 mL ultra saf H₂O'da çözerek piruvat çözeltisi hazırlayın.
   7. Ultra saf H 2 O'da_0,9g galaktozu (C 6 H₁₂O₆₎çözün.
   8. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak iyice çözün ve A, B, D ve E tuz çözeltilerini otomatik olarak kaplayarak sterilize edin ve C, piruvat ve galaktozu 200 μm şırınga filtresinden filtrasyonla çözün.
   9. Farklı stok çözeltilerinin hazırlanmasından sonra, tamponun 100 mL çalışma çözeltisini hazırlamak için, yukarıdaki hazırlanmış çözeltileri aşağıdaki oranda karıştırın: 6,8 mL tuz çözeltisi A, 4,14 mL B, 5 mL C, 2,5 mL D, 1,5 mL E ve 1,14 mL piruvat ve galakto. Deiyonize su kullanarak hacmi 100 mL'ye kadar yapın.
      NOT: Yukarıdaki tampon artık tatlı su salmonidlerinde bulunan bağırsak lümeninin iyonik bileşimini temsil edecektir.
4. Adım 2.6'da açıklanan tamponun diğer altı aliquotunu hazırlayın ve 5 mM'lik son azı dişi konsantrasyonuna ulaşmak için aşağıdaki amino asitlerden birini (sistein, metisin, glisin, histidin, lizin ve arginin) ekleyin.
5. Tatlı su bağırsak ışık tamponu (reaksiyon hacmi = 3 mL; pH 7.4) besleme örneğine ekleyin.
6. 2.4'te açıklanan tamponlarla (5 mM konsantrasyonda farklı amino asitlerin varlığında) 2.5 adımını tekrarlayın.
7. Tüpleri kapatın ve 25 rpm'de 30 dakika boyunca döner bir spinner içinde dönmelerine izin verin.
8. Çözünür ve çözünmeyen fraksiyonları 1157 x g'da10 dakika santrifüjleme ile ayırın.
9. Çözünür ve çözünmeyen kesirlerde dakika başına ^{65 Zn}sayısını (cpm) ölçmek için gama veznedar kullanın.
10. Çözünür ve çözünmeyen fraksiyonlarda bulunan^{Zn (65}Zn) radyo izotoplarının oranını hesaplayın.

3. Zn kimyasal türlerinin in vitro intestinal modeli (RTgutGC) kullanılarak alınması değerlendirmesi

1. RTgutGC hücreleri kültürü
   NOT: Bu adımda kullanılan tüm çalışma malzemeleri steril olmalıdır.
   1. Donmuş RTgutGC hücrelerini 20 °C'de ayarlanmış bir su banyosunda hafifçe canlandırın.
   2. Hücreleri içeren çözeltiyi hafifçe pipetle atın ve % 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 mL L15 ortamında askıya alın.
      NOT: %10 FBS sadece donmuş hücreleri canlandırmak için kullanılır. Sonraki geçiş için FBS% 5 oranında kullanılır. FBS bileşimi partiler arasında değişebilir, bu nedenle serum bileşimindeki partiler arası varyasyonları önlemek için tek bir partiden gerektiği kadar satın almanız ve stoklamak tavsiye edilir.
   3. Hücre süspansiyonu 75 cm² hücre kültürü şişesine ekleyin ve normal atmosfer altında 19 °C'de ayarlanmış bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
   4. Hücreleri kontrol edin ve birleştiğinde (%80 izdiham, mikroskop altında hücre yüzeyinin yoğunluğunu inceleyerek görsel olarak değerlendirin), hücreleri yeni şişelere bölün (sonraki geçiş) veya deneylerde kullanmak için hasat yapın.
      NOT: Hücre kültürü şişelerine tohumlamadan 1 saat 1 hafta sonra RTgutGC hücrelerinin bir örneği Şekil 3'tegösterilmiştir.
2. Hücre hasadı ve maruz kalma deneylerine hazırlık
   1. Hücreleri 1 mL etileniaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, steril bir emme tüpü kullanarak EDTA çözeltisini sifonleyin.
   2. Hücreleri tripsin ile tedavi edin (0.7 mL tripsin, fosfat tamponlu salinde % 0.25'te [PBS]).
   3. Tripini şişenin yüzeyine yaymak için şişeyi akut açılarda hafifçe döndürün.
   4. Hücreler ayrılırken 2 dakika boyunca döndürmeye devam edin.
   5. 2 dakika hafifçe döndükten sonra, tripsin nötralize etmek için 10 mL L15 / FBS orta ekleyin.
   6. Elde eden hücre süspansiyonu, steril bir pipet ve santrifüj kullanarak 130 x g'da 3 dakika boyunca konik bir alt santrifüj tüpüne deklare edin.
   7. Hemositometre kullanarak manuel sayarak hasat edilen hücrelerin yoğunluğunu belirleyin.
   8. 5 x 10⁴ hücre/mL hücre yoğunluğu elde etmek için gerekli L15/FBS ortamı hacmini ekleyin.
   9. 5 x 10 4 hücre/kuyunun son hücre yoğunluğuna elde etmek için kuyu başına 1 mL hücre süspansiyonu pipetleme ile hücreleri²⁴ kuyu plakalarına tohumlayın.
      NOT: Varyasyonu en aza indirmek ve zamanı azaltmak için tercihen çok dağıtımlı pipetler kullanın.
   10. Tohumlu plakaları deneylerden önce 48 saat boyunca 19 °C'de normal atmosfer altında bir inkübatöre yerleştirin.
       NOT: -20 °C'de saklanacak tripsin; 4 °C'de EDTA çözümü ve L15/FBS ortamı. Kullanımdan hemen önce tüm çalışma çözümlerinin ve ortamların sıcaklığını 19 °C'ye ayarlayın.
3. Pozlama ortamlarının hazırlanması
   NOT: Bu adım duman kaputunun altında aseptik ve steril koşullarda yapılmalıdır.
   1. 6,8 mL tuz çözeltisi A (adım 2,3,1), 1,14 mL B (adım 2,3,2), 5 mL karıştırarak L15/ex hazırlayın C (adım 2.3.3) ve 1.14 mL her biri piruvat (adım 2.3.6) ve galaktoz (adım 2.3.7). Steril hücre kültürü sınıfı damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL'ye kadar yapın.
   2. 6,8 mL tuz çözeltisi A (2,3,1), 4,14 mL B (2,3,2), 5 mL C (2,3,3), 2,5 mL karıştırarak FW hazırlayın D (2.3.4), 1.5 mL E (2.3.5) ve 1.14 mL her biri pirvavat (2.3.6) ve galaktoz (2.3.7). Steril, hücre kültürü sınıfı damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL'ye kadar yapın.
   3. Başka bir yerde açıklandığı gibi ICP-MS kullanarak pozlama medyasındaki iyon konsantrasyonlarını ölçün¹².
      NOT: Medya preparatlarında analiz edilen iyonik konsantrasyonlar Tablo 2'desunulmuştur.
4. Çinko⁽⁶⁵Zn) akın tahlilleri
   1. RTgutGC hücrelerini tam L15/FBS ortamında 24 kuyu plakasına (5 x^{10 4} hücre/kuyu) tohumlayın.
   2. 19 °C'de normal atmosfere sahip bir inkübatörde 48 saat kuluçkaya yatırın.
   3. L-methionine (L-Met) veya DL-methionine (DL-Met) 2 mM konsantrasyonda varlığında veya yokluğunda 0,5 M NaOH kullanarak tüm deneysel medya preparatlarını pH 7.4'e ayarlayın.
      NOT: 3.4.3'te açıklanan tamponların pH ayarının, 3.4.5.
   4. Kuluçka süresinin tamamlanmasından sonra, ortamı kuyulardan çıkarın ve PBS ile iyice durulayın.
   5. pH ayarlı FW deneysel medyayı ekleyin ve 20 dakika boyunca iklimlendirmeye izin verin.
   6. RTgutGC hücrelerini, 3.4.3 adımında açıklanan ortamda 3.07, 6.14, 12.27 ve ^24.55μM 65 Zn(II)_{(ZnCl 2}; ~4 kBq/mL olarak) nominal konsantrasyonlarına maruz maruzleyin.
   7. Hemen ardından, inkübatördeki hücreleri 19 °C'de 15 dakika tutun.
   8. 15 dakikalık inkübasyon bittikten sonra, kültürün üst kültürünü epire edin ve kuyudan çıkarın.
   9. Hücreleri buz gibi FW ortamıyla durulayın (200 μM Zn ile, pH 7.4) ve daha sonra 5 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N,N,N', N'-tetraasetik asit (EGTA) tamponunu (pH 7.4) 5 dakika boyunca ekleyerek söndürerek, herhangi bir adsorbe ⁶⁵Zn(II) kurtulmak için.
   10. Amino asit taşıma inhibitörü olan hetan-2 karboksilik asit (BCH) 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] varlığında veya yokluğunda hücreleri yukarıdaki ortam preparatlarına maruz bırakmayın.
   11. 15 dakikalık pozlama süresinden sonra, 3.4.8 ve 3.4.9 adımlarını tekrarlayın.
   12. RtgutGC hücreleri tek katmanlı olarak kuyuların dibine yapışacak. %0,2 sıcak sodyum dodecyl sülfat (SDS) deterjan (100 μL/kuyu) kullanarak hücreleri sindirin.
       NOT: SDS çözeltisinin kullanılmadan önce 90 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna 1 saat boyunca yerleştirilmesi gerekir.
   13. Hücreyi 1,5 mL'lik bir tüpe sindirin ve kurtarın.
   14. Gama sayacı kullanarak hücre özetlerinin radyoaktivitesini ölçün.
       NOT: Dakika başına sayımların (cpm) radyoaktif bozulma, arka plan etkinliği için düzeltilmesi gerekir ve Glover ve Hogstrand¹³tarafından açıklanan formülleri izleyerek belirli aktivite hesaplamalarına tabi tutulur.
   15. Hücrelerin protein konsantrasyonlarını ölçmek için, hücreleri 500 μL 0,5 M NaOH ile homojenize edin.
   16. Standart olarak sığır serum albümin (BSA) ile hücre örneğindeki protein konsantrasyonu ölçmek için bir Bradford test kiti kullanın.
       NOT: Protein konsantrasyonu ölçüldükten sonra, RTgutGC hücrelerinin Zn alım oranı pmoles Zn min^-1 mg^-1 protein olarak ifade edilebilir.

4. Atlantik somonunda diyet Zn'nin görünür kullanılabilirliği (Salmo salar)

NOT: Atlantik somon yemleri, esas olarak bitki bazlı bileşenlerden (%5'e kadar balık proteini, %10 balık yağı, %68 bitki bazlı protein ve %12 bitki yağı) protein kaynakları içeren ticari yemlere dayanarak formüle edilmiştir. İki yem, 150 mg / kg yem Zn konsantrasyonu elde etmek için inorganik bir kaynak (Zn sülfat) veya organik bir kaynak (Zn glisin şelat) ile desteklenmiştir. Ek olarak, belirgin kullanılabilirlik katsayısının hesaplanmasını sağlamak için atıl işaretleyici olarak yemlere% 0.01 oranında Yttrium oksit (yem sınıfı) eklendi.

1. Atlantik somonunu (SalmoBreed suşu, yaş 1+ yıl, karma cinsiyet grupları) balıklar deneysel koşullara alışana kadar kendi tanklarında iklimlendir.
2. Günlük yem alımlarını izleyerek Atlantik somonunun birliğini değerlendirin.
   NOT: Bu deneme üç taraflı tanklarda yapıldı, böylece toplam altı tank kullanıldı. Besleme denemesi sırasında su sıcaklığı 11.9 ± 0.3 °C ve çözünmüş oksijen doygunluğu % 101 ±.
3. Balıkları 11 gün boyunca deneysel yemlerle besleyin.
4. Litre su başına 6 mL trikain metanülfonat stok çözeltisi kullanarak balığı aşırı dozda ötenazi edin.
5. Ventral yüzgecinden anüse kadar şeritlenerek aynı tanktan bir tabağa balıklardan havuzlanmış bir dışkı örneği toplayın.
6. Dışkıyı bir spatula ile plakadan 50 mL konik bir tüpe çıkarın ve numuneleri hemen -20 ° C'de saklayın.
   NOT: Numuneler bir sonraki analize kadar -20 °C'de tutulmuştur.
7. Dondurun dışkı örneklerini -80 °C'de 72 saat kurutun.
8. Dışkı örneğini bir pestle ve harç kullanarak ince bir toz haline manuel olarak homojenize edin.
9. ICP-MS kullanarak yem ve dışkı örneklerinde Zn ve Yttrium konsantrasyonunun belirlenmesi (başka bir yerde açıklandığı gibi^9).
10. Aşağıdaki formülü kullanarak görünür kullanılabilirlik katsayısını (AAC, %) belirleyin:
    

Sonuçlar

Sec-ICP-MS yöntemi kullanılarak Atlantik somon yeminin çözünür fraksiyonunda Zn kimyasal türlerinin değerlendirilmesi
SEC-ICP-MS yöntemi, Atlantik somon yeminin çözünür fraksiyonunda bulunan Zn kimyasal türleri hakkında veri sağlar. Şekil 4, çözünür fraksiyonda bulunan Zn'nin kromatografik profilini göstermektedir. Bu kromatogram SEC-ICP-MS yöntemi kullanılarak elde edildi. Atlantik somon yeminin çözünür fraksiyonlarında zirveler içeren beş Zn bulundu. Her tepenin farklı bir moleküler ağırlığı vardır; tepe bir (~ 600 kDa), tepe iki ve tepe üç (32 ila 17 kDa), tepe dört (17 ila 1.36 kDa) ve tepe beş (> 1.36 kDa). Zirve dört en boldu, onu sırasıyla iki, üç, beş ve bir zirve izledi. Çözünür fraksiyonda bulunan Zn kimyasal türleri farklı kaynaklara sahip olabilir, çünkü kullanılan yem hem deniz bazlı hem de bitki bazlı bileşenler ve takviyeli form (yani Zn sülfat) içerir. Zn kimyasal türlerinin moleküler ağırlık aralığı, bu bileşiklerin metalloproteinler olabileceğini öne sürdü.

Atlantik somon yemlerinde takviyeli Zn'nin in vitro çözünürlüğü
Takviye edilen ⁶⁵Zn'nin çözünürlüğü amino asitlerin varlığında arttı. Test edilen tüm amino asitler takviye edilen ⁶⁵Zn. Metiyonin, glisin, sistein, histidin ve lizin çözünürlüğünü artırdı ⁶⁵Zn çözünürlüğünü artırdı; histidin ve lizin ile daha yüksek çözünürlük bulundu (Şekil 5).

Zn türlerinin in vitro intestinal modeli (RTgutGC) kullanılarak alınması değerlendirmesi
RTgutGC hücrelerindeki apikal çinko alımı, 2 mM konsantrasyonlarda L-Met veya DL-Met varlığından önemli ölçüde etkilenmiştir. Ayrıca, metiyoninin RTgutGC hücrelerinde Zn alımı üzerindeki etkisi, BCH ile tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla BCH (amino asit taşıma sistemi engelleyici) varlığından olumsuz etkilenmiştir (Şekil 6).

Atlantik somonunda diyet Zn'nin görünür mevcudiyeti (Salmo salar)
Atlantik somonu için pratik yemlerde, inorganik bir kaynak (Zn sülfat) veya organik bir kaynak (Zn glisin şelat) ile takviye edildiğinde belirgin Zn mevcudiyeti aynıydı. Atlantik somonunda Zn (%, n = 3) görünür kullanılabilirliği için tahmini değerler, inorganik bir kaynakla (Zn sülfat) takviye edildiğinde% 31 ±% 12 ve organik bir kaynağı (glisin Zn chelate) takviye ederken% 31 ±% 3 idi.

Şekil 1: Tamamlayıcı yöntemler kullanarak mineral kullanılabilirliğini değerlendirmek için sistematik yaklaşımın bir özeti. Bu yaklaşım, Zn speciation, bağırsak ortamında Zn çözünürlüğü, bağırsak hücreleri tarafından Zn alımı ve Zn belirgin kullanılabilirliği dahil olmak üzere Atlantik somonunda çinko mevcudiyetini incelemek için kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir besleme örneğinden Zn ekstraksiyonu prosedürünün özeti. Çinko, hafif ekstraksiyon koşulları kullanılarak bir yem örneğinden çıkarılır. Ekstraksiyonu Zn speciation analizi takip ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hücre kültürü şişelerinde tohumlamadan sonra 1 saat (solda) ve 1 hafta (sağda) RTgutGC hücrelerinin bir örneği.

Şekil 4: Atlantik somon yeminin çözünür kısmından Zn içeren zirveleri gösteren ve SEC-ICP-MS tarafından analiz edilen kromatogram. Üç kopya mavi, kırmızı ve siyah çizgilerle karakterizedir. Tiroglobulin (660 kDa, izleme ¹²⁷I), Zn/Cu süperoksit dismutaz (32 kDa, izleme ^{66 Zn),}miyoglobin (17 kDa, izleme ⁵⁷Fe), B12 vitamini (1.36 kDa, izleme ⁵⁹Co) kullanılarak moleküler ağırlık kalibrasyonu yapıldı; Tepe 1 (P1): ~600 kDa, saklama süresi (RT) 8,2 dk; Tepe 2+3 (P2+3): 32 ila 17 kDa, RT 14.2 + 15.3 dk; Tepe 4 (P4): 17 ila 1,36 kDa, RT 16,3 dk; Tepe 5 (P5): > 1.36 kDa, Rt 23.2 dk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Amino asitlerin Atlantik somon yemlerinde takviyeli Zn'nin in vitro çözünürlüğü üzerindeki etkisi. Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak sunulur. Veriler tek yönlü ANOVA ile analiz edildi ve ardından Dunnet'in çoklu karşılaştırma testi, her AA grubunun ortalamasını kontrol grubunun ortalamasıyla karşılaştırdı (No AA). Yıldız işaretleri ANOVA'nın (P değerleri 0,05 (*), < < 0,01 (**), < 0,001 (***) ve < 0,0001 (**)) anlam düzeyini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Methionin ve amino asit taşıma inhibitörünün etkisi (2-Aminobicyclo [2.2.1] heptane-2-karboksilik asit, BCH, 10 mM). Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak sunulur. Veriler iki yönlü ANOVA ile analiz edildi ve ardından Tukey'in p < 0.05 önem düzeyine sahip çoklu karşılaştırma testi yapıldı. Gruplar arasındaki geçici farklılıklar çubukların üzerinde üst simge harf olarak temsil edilir; farklı üst simgelere sahip çubuklar istatistiksel olarak farklıdır (p < 0,05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

HPLC ayarları
Sütun	SEC sütunu (30 cm x 7,8 mm, 5 μm partikül boyutu) + koruma sütunu (7 μm partikül boyutu)
Kalibrasyon aralığı	1.0 × 104 - 5.0 × 105 Da
Mobil aşama	50 mM Tris-HCl + %3 MeOH (pH 7,5)
Akış hızı	0,7 mL dk−1
Enjeksiyon hacmi	50 μL
ICP-MS ayarları
İleri güç	1550 W
Plazma gazı akışı	15,0 L dk−1
Taşıyıcı gaz akışı	0,86 L dk−1
Makyaj gazı akışı	0,34 L dk−1
Durma zamanı	izotop başına 0,1 sn
İzotoplar izlendi	127 I, 66Zn, 59Co, 57Fe

Tablo 1. HPLC ve ICP-MS için cihaz ayarlarına genel bakış.

Kimyasal bileşim (mM)	L15/eski	Deneysel ortam (L15/FW)
Sodyum nitrat	155	155
Potasyum nitrat	6.2	6.2
Magnezyum sülfat	3.8	19.5
Kalsiyum nitrat	1.5	5.4
HEPES	5	5
Magnezyum klorür	-	15
Sodyum piruvat	5.7	5.7
Galaktoz	5.7	5.7
Ph	7.1	7.4
İyonik güç	178	258
İyonik kompozisyon (mM)
Kalsiyum, Ca2+ *	1.6 ± 0.1	5.3 ± 0.2
Magnezyum, Mg2+ *	3.9 ± 0.3	32,5 ± 0,7
Potasyum, K+ *	8.2 ± 1.2	8.6 ± 1.1
Sodyum, Na+ *	160 ± 3	157 ± 2
Nitrat, NO3- **	164	172.4
Sülfat, SO4- **	3.8	18.7
Klorür, Cl- **	1.5	31.5

Tablo 2. Deneysel medyanın kimyasal ve iyonik bileşimi test edildi.

Tartışmalar

Zn'nin bağırsak emilimi, Zn türünün kimyasal formundan etkilenmiş gibi görünmektedir¹³. Bu bağlamda, bu makalede açıklanan protokollerin kullanılması, Zn'nin Atlantik somonunda 'kullanılabilirliğinin' altında kalan kimyasal ve biyolojik yönlerin ardışık olarak incelenmesine izin verildi.

Bu çalışmada Zn speciation analiz yönteminin kullanıldığı bildirilmiştir. SEC-ICP-MS yöntemi, Atlantik somon yeminin çözünür fraksiyonunda bulunan Zn kimyasal türlerinin moleküler ağırlığı ile ilgili nitel veriler sağladı. Bu, moleküler ağırlık kalibrasyon standartlarının (yani, tiroglobulin (660 kDa), Zn/Cu süperoksit dismutaz (32 kDa), miyoglobin (17 kDa) ve B12 vitamininin (1,36 kDa)) tutma süreleri ile Zn'nin tepeler içeren tutma sürelerinin karşılaştırılması ile elde edildi. Zn speciation analizinde bulunan bir zorluk, analitik standartların eksikliği nedeniyle bilinmeyen Zn kimyasal türlerinin tanımlanmasıydı. SEC'de moleküllerin ayrılması, sabit fazdaki gözeneklere göre boyutlarına dayanır. Prensip olarak, daha büyük moleküller daha hızlı hareket edecek, önce eluting ve daha küçük moleküller daha yavaş hareket edecek, daha sonra¹⁴. Sonuç olarak, tepe içeren her Zn benzer moleküler ağırlığa sahip birkaç bileşik içerebilir¹⁵. Bu aynı zamanda bilinmeyen Zn kimyasal türlerini tanımlama zorluğuna da katkıda bulunur. Ayrıca, Zn'nin çıkarılması için birkaç hafif ekstraksiyon koşulu test edildi. Çıkarılan Zn düşüktü (~%10). Zn kimyasal türlerini sağlam tutmak için hafif ekstraksiyon koşulları uygulandı, ancak bu ekstraksiyon verimliliğini tehlikeye atmış olabilir⁷.

In vitro çözünürlük tahlilinde, takviyeli Zn'nin çözünürlüğü (radyo izotop ⁶⁵ZnCl₂olarak), amino asitlerin, özellikle histidin ve lizinin, Zn'nin çözünürlüğünü artırdığını gösterir (Şekil 5). Simüle gastrointestinal koşullar altında in vitro çözünürlük tahlilleri için doğrudan yem örneklerinin kullanılması, Zn spesifikasyonundaki değişimin pH'a bağlı olduğu bilgisine dayanmaktadır¹⁶. Bununla birlikte, GI kanalının başındaki asidik koşullar, geri dönüşü olmayan belirtimde bir miktar değişikliğe neden olabilir (örneğin, ZnO -> ZnCl₂, midedeki asidik koşullar altında HCl varlığında). Bununla birlikte, burada kullanılan Zn kaynağı ZnSO_4'tür ve çözünürlüğü ortamdaki amino asitler tarafından geliştirilmiştir. Cevaplanması gereken bir sonraki soru, artan çözünürlük kullanılabilirliğe çevrilebilir mi? Bu soruyu incelemek için RTgutGC bağırsak hücre hattı kullanılmıştır. Hayvanlarda mineral beslenme bağlamında, 'mevcudiyet' teriminin tanımlanması zordur ve hücrelerde (in vitro) bir hayvana (in vivo) kıyasla farklı olarak düzenlenebilir. Bu nedenle, in vitro değerlendirmeye gelince bağırsak hücre hattı kullanılarak 'alım' terimi kullanılmıştır. Hücre hattı, hayvanlarda mineral kullanılabilirliğini yöneten karmaşık düzenleyici sürecin bir parçası olan bağırsak epitelinde Zn alma mekanizmaları hakkında yararlı bilgiler sağladı. RTgutGC hücreleri, bir amino asit (yani, metiyonin) varlığında Zn'nin apikal alımı için daha iyi bir kapasite ortaya çıkarmışlardır; Şekil 6). Bununla birlikte, vivodaki belirgin kullanılabilirlik, Atlantik somonunda inorganik ve organik Zn kaynakları arasında önemli ölçüde farklılık görmedi. In vivo kullanılabilirlik çalışmasında, Zn kaynak karşılaştırması, Atlantik somonu^17'ninbilinen Zn gereksinimlerini çok aşan diyet Zn seviyelerinde yapıldı , toplam Zn konsantrasyonu 150 mg / kg yem. Mevcudiyetteki farklılıklar, test edilen diyet seviyeleri hayvan doygunluğa ulaşmadan önce doğrusal dinamik aralıkta düştüğünde daha iyi görselleştirilir. Mevcut in vivo çalışmada, Atlantik somonlarının kullanılan kaynaklar arasındaki Zn emiliminde gözlenen farka iyi doymuş olması mümkündür.

Özetle, ilk yöntem, Atlantik somon yeminin çözünür fraksiyonunda bulunan farklı Zn kimyasal türleri hakkında nitel bilgi sağladı; ikinci yöntem, takviyeli Zn'nin in vitro çözünürlüğü amino asit ligandlarının varlığında geliştirilmiştir; üçüncü yöntem, amino asitler tarafından iyileştirilmiş çözünürlüğün bağırsak epitelini iyileştirdiğini doğruladı; Tersine, dördüncü yöntem Zn'nin inorganik veya organik kaynaktan Atlantik somon balığına mevcudiyetinde farklılıklar bulamadı. Sonuç olarak, in vivo bulgularla uyumlu olmasa da, in vitro protokoller Zn kullanılabilirliğinin farklı bileşenlerini anlamak için ilginç içgörüler sağlamaktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Sartorius
0.45 μm membrane filter	Pall
10 % fetal bovine serum	Eurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter	LKB Wallac
24 well plates (Falcon, TPP microplates)	Thermo Fisher Scientific	10048760
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid	Sigma Aldrich	A7902
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks)	TPP Techno Plastic Products AG	90075
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
Bradford assay kit	Bio-Rad	5000001
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5702
L-Cysteine	Sigma Aldrich	30089
DL-methionine	Alfa Aesar	59-51-8
D-methionine	Sigma Aldrich	M9375
Experimental fish feeds	Skretting
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size)	Tosoh
L-Histidine	Sigma Aldrich	53319
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS	Agilent Technologies
Hydrochloric acid	Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck	1.00317
Knife mill	GM 300, Retsch Gmbh
L-15 medium	Invitrogen/Gibco	21083027
L-methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Lysine	Sigma Aldrich	23128
Methanol	LiChrosolv, HPLC grade, Merck	1.06035
Milli-Q water (18.2 MΩ cm)	EMD Millipore Corporation
Myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
NexION 350D ICP-MS	Perkin Elmer
Pasteur pipette	VWR
pH meter	inoLab
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	806552
RTgutGC cells			Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland
SEC column, TSKgel G3000SWxl	Tosoh
Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm)	Retsch
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	436143
Superoxide dismutase	Sigma Aldrich	S7571
Thyroglobulin	Sigma Aldrich	T1001
Tricaine methanesulphonate	PharmaQ
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma Aldrich	252859
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline	Biowest	L0910
Versene EDTA solution	Invitrogen/Gibco	15040-033
Vitamin B12	Sigma Aldrich	V2876
Zinc chelate of glycine	Phytobiotics
Zinc sulphate	Vilomix