大西洋サケにおける亜鉛の例を用いた相補的方法を用いた魚飼料の鉱物供給率の評価

要約

この記事では、大西洋サケのマイクロミネラルの可用性を評価するための体系的なアプローチを詳細に説明します。この方法論には、生物学的複雑性を持つツールとモデルが含まれています:(1)化学種分分析、(2)体外溶解度、(3)細胞株の取り込み研究、および(4)生体魚の研究。

要約

食物のマイクロミネラルの入手可能性を評価することは、魚種のミネラル栄養における大きな課題です。本稿は、大西洋サケ(サルモ・サラー)における亜鉛(Zn)の入手可能性を評価するために、異なる方法論を組み合わせた体系的なアプローチを説明することを目的としています。いくつかのZn化学種が大西洋サケ飼料に存在することができることを考慮して、Znの入手可能性は、飼料中に存在するZn化学種の影響を受けていると仮定した。したがって、本研究では、第1のプロトコルは、飼料から異なるZn化学種を抽出し、それらをサイズ排除クロマトグラフィー誘導結合プラズマ質量分析法(SEC-ICP-MS)法によって分析する方法についてです。続いて、大西洋サケ飼料中の食事Znの溶解度を評価するin vitro法が開発された。第3のプロトコルは、ニジマス腸細胞株(RTgutGC)を用いた魚腸上皮モデルにおけるZnの取り込みに対するZn化学種組成の変化の影響を研究する方法を記述する。一緒に、 in vitro方法からの知見は、大西洋サケ飼料に補充されたZnの無機および有機供給源の明らかな入手可能性を調べるインビボ研究と比較された。結果は、いくつかのZn化学種が飼料に見つけることができ、有機Zn源の効率は、Znをキレートするために使用されるアミノ酸リガンドに非常に依存することを示した。インビトロ法の知見は、インビボ研究の結果とあまり相関していなかった。それにもかかわらず,この記事で説明したインビトロプロトコルは,Znの入手可能性と魚の飼料におけるその評価に関する重要な情報を提供した。

概要

魚の食事と魚油は、伝統的に大西洋サケ飼料に使用されていました。しかし、これらの成分は、植物ベースの成分¹に置き換えられつつある。飼料組成物の前述の変化は、低食事の可用性をもたらし、大西洋サケ飼料、特に亜鉛(Zn)2におけるミネラルの可用性を向上させる必要性の増加をもたらした。可用性の低下は、Znレベル、Zn化学種または/および飼料マトリックスに存在する抗栄養因子の変化の結果である可能性があります。このシナリオでは、一般的に「有機源」と考えられている添加物の新しい配列は、魚に食物ミネラルのより良い利用可能な供給源である可能性を持って出現しました。したがって、魚に対する鉱物とその供給源の利用可能性を支配する基本的な化学と生理学を理解することが重要です。亜鉛は、すべての生物に不可欠な微量元素^{である 3}.シグナル分子としてのZnの役割は、魚⁴における細胞内レベルと細胞内レベルの両方で説明されている。大西洋サケでは、Zn欠乏症は、骨格異常と様々なZnメタロ酵素^5、6の活性低下と関連している。

本研究では、Znの入手可能性を、様々な化学的および生物学的複雑さの4つの異なる区画に分類することによって、その利用可能性を理解するための体系的なアプローチを説明する。関連する方法は、図1に示されているように 、4つのセクションに記載されている:(1)サイズ排除クロマトグラフィー誘導結合血漿質量分析法⁷を用いた大西洋サケ飼料の可溶性分画におけるZn化学種の評価(2) 大西洋サケ飼料中の補助Znのインビトロ溶解度;(3) インビトロ腸管モデル(RTgutGC)によるZn化学種取り込み^{評価 8;}(4) 大西洋サーモンのZnの明らかな可用性 (サルモ・サラル)⁹.同様のプロトコルは、養殖魚種に栄養関心の他の鉱物(例えば、マンガン、セレン、銅)のために開発することができます。

プロトコル

セクション4の給餌試験は、ノルウェー語(FOR-2015-06 - 18-761)と欧州の法律(指令2010/63/EU)に従って行われました。

1. SEC-ICP-MS法による大西洋サケ飼料の可溶性分率におけるZn化学種の評価

1. 抽出 バッファー (100 mM トリス-HCl、pH 8.5)
   1. 適量のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを溶解して抽出バッファーを調製し、所望のイオン強度(100 mM)を超純度_H2Oに到達します。
   2. HCl溶液でpH 8.5に溶液のpHを調整し、pHメーターでpH変化を監視します。
2. 飼料サンプルの調製
   注:使用される飼料サンプルは、主に植物ベースの成分(すなわち、約5%の魚タンパク質、10%の魚油、68%の植物ベースのタンパク質および12%植物ベースの油)からのタンパク質源を含む、大西洋サケの市販飼料に基づいて製剤化された。硫酸亜鉛を飼料に添加した。
   1. 乳鉢と乳鉢を使用して、手でフィードサンプルを粉砕します。
   2. フィードサンプルをふるいにかけると、抽出が同様の粒子サイズ(850 μmから1.12mm)のフィード分数で確実に行われます。
   3. Zn抽出を実行する。
3. 飼料サンプルからの亜鉛抽出
   1. 15 mLの円錐形の管に三重に供給のおよそ0.5gの重量を量る。
   2. 抽出バッファー (5 mL 100 mM Tris-HCl、pH 8.5) をサンプルに加えます。
   3. 4 °Cで24時間、回転器(20rpm)でサンプルを抽出します。
   4. 可溶性と非可溶性の分画を、3000 x gで10分間遠心分離して分離 する。
   5. 0.45 μm の使い捨てシリンジフィルターを使用して、可溶性分数をフィルター処理します。
   6. フィルター処理されたサンプルをクリーンチューブに移します。
   7. ステップ1.6で説明したように、SEC-ICP-MSを用いて可溶性分数でZn種分分析を行う。
      注: フィードサンプルからのZn抽出手順の概要を 図2に示します。
4. 移動相ソリューション(50 mMトリス-HCl + 3%MeOH、pH 7.5)
   1. 3%MeOH溶液(v/v)の1 Lでトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンの6.057 gを溶解する移動相溶液を調製します。
   2. HCl溶液でpHから7.5まで溶液のpHを調整し、pHメーターでpH変化を監視します。
   3. 0.45 μmの膜フィルターを介して移動相溶液をフィルター処理します。
5. SECカラム分離範囲の分子量較正
   1. 分子量キャリブレーションを行って分離範囲を較正します。
      注:この研究では、チログロブリン(660 kDa)、Zn/Cuスーパーオキシドジスムターゼ(32kDa)、ミオグロビン(17 kDa)およびビタミンB12(1.36kDa)が使用されました。
   2. 超純粋な_H2Oで既知の濃度で各標準を準備します。
   3. 250 μLの標準をバイアルに加えて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)バイアルを用意します。
   4. サンプルのシーケンス実行に標準のバイアルをロードします。
   5. 分析配列の最初と最後に分子量較正を実行し ^、127I(チログロブリン ^)、66Zn(Zn/Cuスーパーオキシドジスムターゼ ^)、57Fe(ミオグロビン ^)、59Co(ビタミンB12)を監視します。
      メモ:分子量キャリブレーションはZn種分分析と同時に行われます。
6. SEC-ICP-MSを用いた亜鉛種分分析
   注: SEC-ICP-MS法によるZn種分分析は、大西洋サケ飼料⁷の分析のために他の場所で説明した^10、11の原理に基づいて開発され^、さらなる最適化が行われました。
   1. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムと、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)と結合したHPLCを用いて、可溶性分画に対するZn種分分析を行います。
   2. 250 μL の可溶性分率をバイアルに加えて、HPLC バイアルを準備します。
   3. 分析の前に、0.5 μLのビタミンB12でサンプルを全てスパイクします。このステップは ^、59Coを監視し、保持時間のシフトを修正することができます。
   4. 抽出バッファー (100 mM Tris-HCl、pH 8.5) で可溶性分率を希釈し、最終体積 1 mL に調整します。
   5. サンプルのシーケンス実行をランダムな順序で準備します。
   6. 製造元の指示に従って ICP-MS を調整します。
   7. Zn 種分分析を実行する HPLC および ICP-MS の計測器設定に従ってください( 表 1を参照)。

2. 大西洋サケ飼料中のサプリメントZnのインビトロ溶解度

注:使用される飼料サンプルは、主に植物ベースの成分(すなわち、約5%の魚の食事、10%の魚油、68%の植物ベースの成分と12%植物油)からのタンパク質源を含む、大西洋サケの市販飼料に基づいて製剤化されました。

1. ナイフミルを使用して3000 rpmで10 sの大西洋サケ飼料サンプルを粉砕し、さらに分析するまで4°Cで保存します。
2. ステップ2.1で約0.2gのフィードサンプルを粉砕し、5mL体積サンプルチューブ(キャップ付き)に既知の比活性のZn放射性トレーサ⁽⁶⁵Zn)を加える。
   注意: この手順は、放射性核種スイート内で実行する必要があります。このステップを実行する人は、無線同位体を処理するための訓練と認定を受ける必要があります。研究所の放射線安全管理によって助言される安全および予防措置は厳密に従わなければならない。
3. 次に、以下に説明する淡水腸ルミナル緩衝液を調製する。
   1. 塩溶液Aの場合、11.65gのNaNO 3、0.55gのKNO₃およびMgSO₄の0.4gを量る。塩を超純度_H2Oに溶かし、60mLの最終体積に調整します。
   2. 塩溶液Bの場合、重さはCa(NO₃₎₂の_0.31gを量る ·₄H₂O. 塩を超純度_H2Oに溶かし、最終体積10mLに調整します。
   3. 500 mM HEPES ストック溶液を塩溶液Cとして使用する。
   4. 塩溶液Dの場合_、MgCl2の1.2gを秤量し、塩を超純粋な_H2Oに溶解し、20mLの最終体積に調整する。
   5. 塩溶液Eの場合_、MgSO4の0.9gを秤量し、塩を超純粋な_H2Oに溶解し、最終容積20mLに調整する。
   6. 超純_H2Oの10 mLにCH₃COCOONaの0.55 gを溶解することによりピルビン酸溶液を調製する。
   7. 0.9 gのガラクトース (C₆H₁₂O₆₎を超純度 H₂O に溶解します。
   8. 磁気撹拌機を使用してよく溶解し、オートクレーブ加工により塩溶液A、B、D、Eを殺菌し、200μmのシリンジフィルターを通してろ過して溶液C、ピルビン酸およびガラクトースを殺菌します。
   9. 異なるストック溶液を調製した後、バッファーの100mLの作業溶液を調製し、上記の調製溶液を以下の割合で混合する:6.8mLの塩溶液A、4.14mLのB、5 mLのC、2.5mLのD、1.5mLのE、および1.14mLのピルビン酸およびガラクトート。脱イオン水を使用して100 mLに体積を構成します。
      注:上記のバッファーは、淡水サルモデイドに見られる腸管腔のイオン組成を表します。
4. ステップ2.6に記載のバッファーの他の6つのアリコートを調製し、5mMの最終的なモル濃度に達するために、次のアミノ酸(システイン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、リジンおよびアルギニン)のいずれかを加える。
5. 淡水腸の発光バッファー (反応量 = 3 mL; pH 7.4) をフィードサンプルに加えます。
6. ステップ2.5を2.4に記載された緩衝液で繰り返す(5mM濃度で異なるアミノ酸が存在する場合)。
7. チューブを閉じ、回転スピナーで回転させ、25rpmで30分間回転させます。
8. 1157 x g で 10 分間遠心分離して可溶性分率と非可溶性分画を分離 します。
9. ガンマテラーを使用して、可溶性および非可溶性の分率で ⁶⁵Znの1分あたりの数(cpm)を測定します。
10. 可溶性および非可溶性画分に存在する^Zn(65Zn)の無線同位体の割合を計算する。

3. インビトロ腸管モデル(RTgutGC)によるZn化学種取り込みの評価

1. RTgutGC細胞培養
   注:このステップで使用されるすべての作業材料は、無菌でなければなりません。
   1. 20°Cに設定された水浴で、凍ったRTgutGC細胞を優しく蘇生させます。
   2. 細胞を含む溶液を軽くピペットアウトし、10%胎児ウシ血清(FBS)を含むL15培地(FBS)の10mLに懸濁液を使用します。
      注:10%FBSは、凍結したセルを復活させるためだけに使用されます。後続のパッセージでは、FBSは5%で使用されます。FBSの組成はバッチによって異なるため、血清組成物のバッチ間の変動を避けるために、単一のバッチから必要な限り購入してストックすることをお勧めします。
   3. 細胞懸濁液を^75cm2 細胞培養フラスコに加え、通常の雰囲気下で19°Cにセットしたインキュベーターでインキュベートする。
   4. 細胞をチェックし、コンフルエント(80%合流、顕微鏡下で細胞表面の密度を調べることによって視覚的に評価する)、新しいフラスコ(その後の通路)に細胞を分割するか、実験に使用するために収穫する場合。
      注: RTgutGC細胞の例を 1 時間と 1 週間後の細胞培養フラスコに播種した後、 図 3に示します。
2. 細胞の収穫と暴露実験の準備
   1. 1 mL エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)溶液で細胞を2回洗浄します。各洗浄後、無菌吸引管を用いてEDTA溶液をサイフォンアウトする。
   2. トリプシン(0.7 mLのトリプシン、0.25%のリン酸緩衝生理食塩分[PBS])で細胞を治療します。
   3. フラスコを鋭角に軽く回転させ、フラスコの表面に沿ってトリプシンを広げます。
   4. セルが切り離されている間、2分間回転を続けます。
   5. 2分間ゆっくり回転させた後、L15/FBS培地を10mL加えてトリプシンを中和します。
   6. 130 x g で 3 分間、滅菌ピペットと遠心分離機を使用して、得られた細胞懸濁液を円錐底遠心管にデカン トします。
   7. ヘモサイトメーターを使用して手動でカウントすることにより、収穫された細胞の密度を決定します。
   8. L15/FBS媒体の必要な容積を加えて、5 x 10⁴ セル/mLのセル密度を達成します。
   9. 5 x 10 4細胞/ウェルの最終的な細胞密度を達成するために、ウェルあたり1 mLの細胞懸濁液をピペット化して^、24 ウェルプレートに細胞を播種します。
      注:好ましくは、マルチディスペンスピペットを使用して、変動を最小限に抑え、時間を短縮します。
   10. 実験前に、19°Cの通常の雰囲気下で、培養器に播種したプレートを置きます。
       注:トリプシンは-20 °Cで保存されます。4 °CのEDTA溶液およびL15/FBS媒体。 使用する直前にすべての作業ソリューションとメディアの温度を19 °Cに調整してください。
3. 露光媒体の準備
   注:このステップは無菌および無菌条件下でヒュームフードの下で行われなくてはなっ.
   1. 塩溶液A6.8 mL(ステップ2.3.1)、1.14mLのB(ステップ2.3.2)、5 mLのC(ステップ2.3.3)、および1.14mLのピルビン酸(ステップ2.3.6)とガラクトース(ステップ2.3.7)を混合してL15/exを調製します。滅菌細胞培養グレードの蒸留水を使用して体積を100 mLに構成します。
   2. 6.8 mLの塩溶液A(2.3.1)、4.14 mLのB(2.3.2)、5 mLのC(2.3.3)、2.5 mLのDを混合してFWを準備する (2.3.4)、1.5 mLのE(2.3.5)、1.14mLのピルビン酸(2.3.6)およびガラクトース(2.3.7)。無菌、細胞培養グレードの蒸留水を使用して、体積を100 mLに構成します。
   3. 露光媒体中のイオン濃度を、他の場所に記載されているICP-MSを用いて定量化する^。
      注: メディアの準備で分析されたイオン濃度を 表 2に示します。
4. 亜鉛⁽⁶⁵Zn)流入アッセイ
   1. 完全なL15/FBS培地でRTgutGC細胞を24ウェルプレート(5 x 10⁴ 細胞/ウェル)にシードします。
   2. 通常の雰囲気を持つインキュベーターで48時間インキュベートします。
   3. 2 mM濃度でL-メチオニン(L-Met)またはDL-メチオニン(DL-Met)の有無に0.5 M NaOHを使用して、すべての実験培地製剤をpH 7.4に調整します。
      注: 3.4.3 で説明したバッファーの pH 調整は、ステップ 3.4.5 でセルを処理する前に新たに行う必要があります。
   4. インキュベーション期間終了後、ウェルから培地を取り出し、PBSで十分に洗いすめます。
   5. pH調整されたFW実験培地を加え、20分間順応します。
   6. RTgutGC細胞を、ステップ3.4.3で説明したメディアの3.07、6.14、12.27および24.55 μM ⁶⁵Zn(II)(ZnCl_2;~4kBq/mL)の公称濃度に曝します。
   7. 直後に、細胞を19°Cで15分間保ちます。
   8. 15分のインキュベーションが終わった後、培養上清を吸引し、ウェルから取り出す。
   9. 氷冷FW培地(200 μM Zn、pH 7.4)で細胞をリンスし、5mのエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N',N',N'-テトラ酢酸(EGTA)バッファー(pH 7.4)を加えて5分間、任意の5分間の吸着剤を得ます。
   10. アミノ酸輸送阻害薬である10mM2-アミノビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-カルボン酸(BCH)の存在下または不存在下で細胞を上記培地製剤に暴露する。
   11. 15分の露光期間の後、ステップ3.4.8と3.4.9を繰り返します。
   12. RtgutGC細胞は、単層としてウェルの底に付着する。0.2%熱いドデシル硫酸ナトリウム(SDS)洗剤(100 μL/well)を使用して細胞を消化します。
       注:SDS溶液は、使用前に90°Cに設定されたウォーターバスに1時間置く必要があります。
   13. 吸引し、細胞掘り地を1.5 mLチューブに回収します。
   14. ガンマカウンターを使って細胞消化の放射能を測定する。
       注:1分あたりの数(cpm)は、放射性崩壊、バックグラウンド活動のために修正する必要があり、グローバーとホグストランド¹³で記述された式に従って特定の活動計算を受ける必要があります。
   15. 細胞のタンパク質濃度を定量化するには、細胞を0.5 M NaOHの500 μLで均質化します。
   16. ブラッドフォードアッセイキットを使用して、牛血清アルブミン(BSA)を標準として、細胞サンプル中のタンパク質濃度を測定します。
       注:タンパク質濃度を定量化すると、RTgutGC細胞によるZn取り込み速度は、pmoles Zn^{min-1 mg-1} タンパク質として発現することができます。

4. 大西洋サーモンの食事Znの明らかな可用性 (サルモサラー)

注:大西洋サケ飼料は、主に植物ベースの成分(すなわち、約5%の魚タンパク質、10%の魚油、68%の植物ベースのタンパク質および12%植物油)からのタンパク質源を含む商業的な飼料に基づいて製剤化された。2つの飼料を、150mg/kgのZn濃度の供給を達成するために、無機源(Zn硫酸塩)または有機源(グリシンのZnキレート)を加えた。さらに、イトリウム酸化物(供給グレード)を不活性マーカーとして0.01%でフィードに添加し、見かけの可用性係数の計算を可能にした。

1. 魚が実験条件に慣れるまで、それぞれのタンクに大西洋サケ(SalmoBreed株、年齢1+年、男女混合群)を順応させます。
2. 毎日の飼料摂取量を監視することで、大西洋サケの順応を評価します。
   注:この試験は三重タンクで行われ、合計6つのタンクが使用されました。摂食試験中は、水温は11.9±0.3°C、溶存酸素飽和度は101±5%であった。
3. 11日間の実験飼料で魚を養います。
4. 水のリットル当たり6 mLのトリケインメタンスルホネートストック溶液を使用して過剰摂取して魚を安楽死させる。
5. 腹側のひれからアヌスに縞模様を付け、同じタンクから魚の便のサンプルをプレートに集めます。
6. 50 mL円錐形チューブにヘラでプレートから便を取り出し、すぐに-20°Cでサンプルを保存します。
   注:サンプルは、さらなる分析まで-20°Cに保たれていました。
7. -80°Cで72時間、フェースサンプルを凍結乾燥させます。
8. 手動で害虫とモルタルを使用して細かい粉末に便サンプルを均質化します。
9. ICP-MSを用いて、飼料および排泄物サンプル中のZnおよびイットリウムの濃度を^{決定する(}下記9)。
10. 次の式を使用して、見かけの可用性係数 (AAC、%)
    

結果

SEC-ICP-MS法による大西洋サケ飼料の可溶性分率におけるZn化学種の評価
SEC-ICP-MS法は、大西洋サケ飼料の可溶性分率に含まれるZn化学種に関するデータを提供する。 図4 は、可溶性画分に見られるZnのクロマトグラフィープロファイルを示す。このクロマトグラムはSEC-ICP-MS法を用いて得られた。ピークを含む5つのZnは、大西洋サケ飼料の可溶性分画に見られた。各ピークは、異なる分子量を有する;ピーク1(〜600kDa)、ピーク2とピーク3(32〜17 kDa)、ピーク4(17〜1.36kDa)およびピーク5(>1.36 kDa)。ピーク4が最も豊富で、次いでピーク2、3、5、1が続いた。可溶性分率に含まれるZn化学種は、使用される飼料に海洋系および植物ベースの成分の両方が含まれているため、異なる供給源を有し得る。また、補足された形態(すなわち、Zn硫酸塩)である。Zn化学種の分子量範囲は、これらの化合物がメタロタンパク質である可能性を示唆した。

大西洋サケ飼料における補剤Znのインビトロ溶解度
アミノ酸の存在下で^65Znを補ったの溶解度が増加した。すべての試験されたアミノ酸は、補充^された65Zn.メチオニン、グリシン、システイン、ヒスチジン、およびリジンの溶解度を増加させました⁶⁵Zn溶解度を改善;ヒスチジンとリジンでより高い溶解性が見つかりました(図5)。

インビトロ腸管モデル(RTgutGC)を用いたZn種取り込みの評価
RTgutGC細胞におけるアペカル亜鉛取り込みは、2mM濃度でのL-MetまたはDL-Metの存在によって有意に影響を受けた。さらに、RTgutGC細胞におけるZn取り込みにおけるメチオニンの影響は、BCH(アミノ酸輸送系ブロッカー)の存在によって悪影響を受け、BCHで処理されていない細胞と比較した場合(図6)。

大西洋サーモンの食事Znの明らかな可用性 (サルモ・ サルラー)
大西洋サケの実用的な飼料では、明らかなZnの入手可能性は、無機源(Zn硫酸塩)または有機源(グリシンのZnキレート)を補う場合と同じであった。大西洋サケにおけるZn(%、n=3)の見かけの利用可能性の推定値は、無機源(Zn硫酸塩)を補う場合は31%±12%、有機源(グリシンのZnキレート)を補う場合は31%±3%であった。

図1:相補的な方法を用いて鉱物の利用可能性を評価する体系的アプローチの概要このアプローチは、Zn種分化、腸内環境におけるZn溶解度、腸細胞によるZn取り込み、Znの明らかな可用性を含む大西洋サケにおける亜鉛の入手可能性を研究するために使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2: フィードサンプルからのZn抽出手順の概要 亜鉛は、軽度の抽出条件を使用して飼料サンプルから抽出されます。抽出の後にZn種分分析が行われます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:細胞培養フラスコに播種した後のRTgutGC細胞1時間(左)と1週間(右)の例を示 します。

図4:大西洋サケ飼料の可溶性分率からZn含有ピークを示し、SEC-ICP-MSで分析したクロマトグラム。 3つの複製は青、赤および黒の線によって特徴付けられる。分子量較正は、チログロブリン(660 kDa、モニタリング ¹²⁷I)、Zn/Cuスーパーオキシドジスムターゼ(32 kDa、モニタリング ⁶⁶Zn)、ミオグロビン(17 kDa、モニタリング ⁵⁷Fe)、ビタミンB12(1.36 kDa、モニタリング ^59Co)を使用して行った。ピーク1(P1):~600kDa、保持時間(RT)8.2分。ピーク2+3(P2+3):32から17 kDa、RT 14.2 + 15.3分。ピーク4(P4):17から1.36 kDa、RT 16.3分。ピーク5(P5):>1.36 kDa、Rt 23.2分。 この図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

図5:大西洋サケ飼料中の補助Znのインビトロ溶解度に及ぼすアミノ酸の影響 データはSD±平均として提示されます(n = 3)。データは一方向のANOVAを通じて分析され、次にダンネットの多重比較検定を行い、各AAグループの平均を対照群の平均(No AA)と比較した。アスタリスクは、ANOVA の有意性のレベルを示します (P 値 < 0.05 (*),0.01 (**) <0.001 (**), < 0.0001 (****)、 < 0.0001 (****))。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:メチオニンとアミノ酸輸送抑制剤(2-アミノビシクロ[2.2.1]ヘプタン-2-カルボン酸、BCH、10mM)の影響。データはSD±平均として提示されます(n = 3)。データは双方向のANOVAを通じて分析され、続いてTukeyの多重比較検定がp<0.05レベルの有意性を有する。グループ間のポストホックの違いは、バーの上に上付き文字として表されます。異なる上付き文字を持つバーは統計的に異なります (p < 0.05)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

HPLC 設定
コラム	SEC 列 (30 cm x 7.8 mm、5 μmの粒子サイズ) + ガードカラム(7 μm粒径)
キャリブレーション範囲	1.0 × 104 - 5.0 × 105 Da
モバイルフェーズ	50 mM トリス-HCl + 3% MeOH (pH 7.5)
流量	0.7 mL 分-1
射出量	50 μL
ICP-MS 設定
フォワードパワー	1550 W
プラズマガスの流れ	15.0 L 分-1
キャリアガスの流れ	0.86 L 分-1
メイクアップガスの流れ	0.34 L 分-1
ドウェルタイム	同位体あたり 0.1 秒
同位体の監視	127I, 66Zn, 59Co, 57Fe

表 1.HPLC および ICP-MS の計測器設定の概要。

化学組成(mM)	L15/ex	実験媒体(L15/FW)
硝酸ナトリウム	155	155
硝酸カリウム	6.2	6.2
硫酸マグネシウム	3.8	19.5
硝酸カルシウム	1.5	5.4
ヘペス	5	5
塩化マグネシウム	-	15
ピルビン酸ナトリウム	5.7	5.7
ガラクトース	5.7	5.7
pH	7.1	7.4
イオン強度	178	258
イオン組成物(mM)
カルシウム、Ca2+ *	1.6 ± 0.1	5.3 ± 0.2
マグネシウム、Mg2+ *	3.9 ± 0.3	32.5 ± 0.7
カリウム、K +*	8.2 ± 1.2	8.6 ± 1.1
ナトリウム、Na+ *	160 ± 3	157 ± 2
硝酸塩、NO3- **	164	172.4
硫酸塩、SO4- **	3.8	18.7
塩化物、Cl- **	1.5	31.5

表 2.実験媒体の化学およびイオン組成を試験した。

ディスカッション

Znの腸の吸収は、Zn種¹³の化学形態の影響を受けているようです。この点に関して、この記事に記載されているプロトコルの使用は、大西洋サケにおけるZnの「入手可能性」の根底にある化学的および生物学的側面の逐次的研究を可能にした。

本研究ではZn種化解析法の使用を報告した。SEC-ICP-MS法は、大西洋サケ飼料の可溶性分率に存在するZn化学種の分子量に関する定性的データを提供した。これは、分子量較正基準(すなわち、チログロブリン(660kDa)、Zn/Cuスーパーオキシドジスムターゼ(32kDa)、ミオグロビン(17kDa)およびビタミンB12(1.36kDa)の保持時間とピークを含むZnの保持時間との比較によって達成された。Zn種分分析で見つかった課題は、分析基準の欠如による未知のZn化学種の同定でした。SECでは、分子の分離は、静止相の細孔に対するそのサイズに基づいています。原則として、より大きな分子はより速く移動し、最初に溶出し、より小さな分子は遅く移動し、後に¹⁴を溶出する。その結果、ピークを含む各Znは、類似した分子量¹⁵を有するいくつかの化合物を含んでい得る。これはまた、未知のZn化学種を同定するという課題に貢献しています。また、Znの抽出についていくつかの軽度の抽出条件を試験した。抽出されたZnは低く(〜10%)であった。Znの化学種をそのまま維持するために軽度の抽出条件が適用されたが、これは抽出効率⁷を損なった可能性がある。

インビトロ溶解アッセイでは、補ったZnの溶解度(ラジオ同位体⁶⁵ZnCl2として)は、アミノ酸、特にヒスチジンおよびリジンがZnの溶解度を増加することを示した(図5)。シミュレーションされた消化管条件下でのインビトロ溶解アッセイに直接飼料サンプルを使用することは、Zn種分化の変化がpH依存性¹⁶であるという知見に基づいている。しかし、消化管の初めに酸性条件は、不可逆的である可能性のある種分化に何らかの変化をもたらす可能性がある(例えば、ZnO−>ZnCl2、胃内の酸性条件下でHClの存在下で)。それにもかかわらず、ここで用いられるZn源は、ZnSO4であり、その溶解度は培地中のアミノ酸によって改善された。次に答える質問は、溶解度の増加を可用性に変換できるかということです。RTgutGC腸細胞株は、この質問を研究するために使用されました.動物のミネラル栄養の文脈では、「入手可能性」という用語は定義が難しく、動物(in vivo)と比較して細胞(in vitro)で差をつけて調節することができます。それゆえ、腸細胞株を用いたインビトロ評価に関しては「取り込み」という用語が用いられた。細胞株は、動物の鉱物の入手可能性を支配する複雑な調節プロセスの一部である腸上皮におけるZn取り込みメカニズムに関する有用な情報を提供した。RTgutGC細胞は、アミノ酸(すなわち、メチオニン)の存在下でZnのアプリカル取り込みのためのより良い容量を引き出した。図 6.しかし、インビボでの明らかな可用性は、大西洋サケの無機Zn源と有機Zn源の間で有意に異なっていなかった。in vivo可用性試験では、Znソース比較は、大西洋サケ¹⁷の既知のZn要件をはるかに上回る食事Znレベルで行われ、Zn濃度は150mg/kgの総フィードでした。可用性の違いは、動物が飽和に達する前に、テストされた食事レベルが線形ダイナミックレンジに落ちるとき、よりよく視覚化されます。本インビボ研究では、大西洋サケが使用されるソース間のZn吸収の差を観察するために十分に飽和していた可能性がある。

要約すると、最初の方法は、大西洋サケ飼料の可溶性分率に見られる異なるZn化学種に関する定性的情報を提供した。第二の方法は、補充されたZnのインビトロ溶解度がアミノ酸リガンドの存在下で改善された;第三の方法は、アミノ酸による改善された溶解性が腸上皮での取り込みを改善できることを確認しました;逆に、第4の方法は、無機または有機の供給源から大西洋サケへのZnの入手可能性の違いを見つけることができませんでした。結論として、in vivoの知見と一致していないが、in vitroプロトコルはZn可用性のさまざまな構成要素を理解するための興味深い洞察を提供した。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Sartorius
0.45 μm membrane filter	Pall
10 % fetal bovine serum	Eurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter	LKB Wallac
24 well plates (Falcon, TPP microplates)	Thermo Fisher Scientific	10048760
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid	Sigma Aldrich	A7902
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks)	TPP Techno Plastic Products AG	90075
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
Bradford assay kit	Bio-Rad	5000001
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5702
L-Cysteine	Sigma Aldrich	30089
DL-methionine	Alfa Aesar	59-51-8
D-methionine	Sigma Aldrich	M9375
Experimental fish feeds	Skretting
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size)	Tosoh
L-Histidine	Sigma Aldrich	53319
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS	Agilent Technologies
Hydrochloric acid	Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck	1.00317
Knife mill	GM 300, Retsch Gmbh
L-15 medium	Invitrogen/Gibco	21083027
L-methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Lysine	Sigma Aldrich	23128
Methanol	LiChrosolv, HPLC grade, Merck	1.06035
Milli-Q water (18.2 MΩ cm)	EMD Millipore Corporation
Myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
NexION 350D ICP-MS	Perkin Elmer
Pasteur pipette	VWR
pH meter	inoLab
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	806552
RTgutGC cells			Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland
SEC column, TSKgel G3000SWxl	Tosoh
Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm)	Retsch
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	436143
Superoxide dismutase	Sigma Aldrich	S7571
Thyroglobulin	Sigma Aldrich	T1001
Tricaine methanesulphonate	PharmaQ
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma Aldrich	252859
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline	Biowest	L0910
Versene EDTA solution	Invitrogen/Gibco	15040-033
Vitamin B12	Sigma Aldrich	V2876
Zinc chelate of glycine	Phytobiotics
Zinc sulphate	Vilomix