대서양 연어의 아연의 예로 입증 된 보완 적 방법을 사용하여 물고기 사료의 미네랄 가용성 평가

요약

이 문서에서는 대서양 연어의 미세 미네랄 가용성을 평가하기 위한 체계적인 접근 방식을 자세히 설명합니다. 방법론은 생물학적 복잡성이 증가하는 도구와 모델을 포함한다: (1) 화학적 분화 분석, (2) 체외 용해도, (3) 세포주에서의 섭취 연구, (4) 생체 내 어류 연구.

초록

식이 마이크로 미네랄의 가용성을 평가하는 것은 어종의 미네랄 영양에 큰 도전이다. 본 기사는 대서양연어(살모 살라)에서아연(Zn)의 가용성을 평가하기 위해 다양한 방법론을 결합한 체계적인 접근법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 대서양 연어 사료에 여러 Zn 화학 종이 존재할 수 있다는 점을 고려할 때, Zn 가용성이 사료에 존재하는 Zn 화학 종의 영향을 받는것으로 가설되었습니다. 따라서, 본 연구에서, 제1 프로토콜은 사료로부터 다른 Zn 화학종을 추출하고 크기 배제 크로마토그래피-유도 결합된 혈장 질량 분광법(SEC-ICP-MS) 방법으로 분석하는 방법에 관한 것이다. 그 후, 대서양 연어 사료에서 식이 Zn의 용해도를 평가하기 위해 체외 방법이 개발되었습니다. 세 번째 프로토콜은 레인보우 송어 창자 세포주 (RTgutGC)를 사용하여 물고기 장 상피 모델에서 Zn의 섭취에 Zn 화학 종 조성을 변경하는 영향을 연구하는 방법을 설명합니다. 함께, 체외 방법에서 사실 인정은 대서양 연어 사료에 보충된 Zn의 무기 및 유기 근원의 명백한 가용성을 검토하는 생체 내 연구 결과와 비교되었습니다. 그 결과, 여러 Zn 화학 종은 사료에서 발견될 수 있으며 유기 Zn 소스의 효율성은 Zn을 chelate하는 데 사용되는 아미노산 리간드에 매우 의존한다는 것을 보여주었습니다. 체외 방법의 사실 인정은 생체 내 연구 결과의 그 결과와 더 적은 상관관계가 있었습니다. 그럼에도 불구하고 이 문서에서 설명된 체외 프로토콜은 Zn 가용성 및 생선 사료의 평가에 관한 중요한 정보를 제공했습니다.

서문

생선 식사와 생선 기름은 전통적으로 대서양 연어 사료에 사용되었습니다. 그러나, 이러한 성분은 점점 식물 성 성분에 의해 대체 되고있다^1. 앞서 언급한 사료 조성의 변화로 인해 식이 가용성이 낮아지고 대서양 연어 사료, 특히 아연(Zn)^2의미네랄 가용성 을 개선할 필요성이 증가했습니다. 감소된 가용성은 Zn 수준, Zn 화학 종 또는/및 사료 매트릭스에 존재하는 반영양 인자의 변화의 결과일 수 있습니다. 이 시나리오에서, 일반적으로 '유기 소스'로 간주 첨가제의 새로운 배열은 물고기에 식이 미네랄의 더 나은 사용 가능한 소스 되 고의 잠재력으로 등장 했다. 따라서 미네랄과 물고기에 대한 공급원의 가용성을 지배하는 근본적인 화학 및 생리학을 이해하는 것이 중요합니다. 아연은 모든 살아있는 유기체^3에필수적인 미량 원소입니다. 신호 분자로서 Zn의 역할은 물고기^4의세포세포 및 세포 내 수준에서 모두 기술되었다. 대서양 연어에서, Zn 결핍은 골격 이상및 다양한 Zn 금속^효소의감소 된 활동과 연관되어있다^5,6.

이 연구는 다양한 화학 적 및 생물학적 복잡성의 네 가지 구획으로 분류하여 Zn 가용성을 이해하는 체계적인 접근 방식을 설명합니다. 관련 방법은 도 1에서볼 수 있듯이 4개의 섹션으로 설명되어 있습니다 : (1) 크기 배제 크로마토그래피-유도 결합 된 혈장 질량 분광법 (SEC-ICP-MS) 방법을 사용하여 대서양 연어 사료의 수용성 분획에서 Zn 화학 종의 평가^7; (2) 대서양 연어 사료에서 보충 Zn의 체외 용해도; (3) 시험장 모델(RTgutGC)^8에의한 Zn 화학종 섭취평가; 및 (4) 대서양 연어에서 Zn의 명백한 가용성(살모 살라)⁹. 양식 물고기 종에 영양 관심의 다른 미네랄 (예를 들어, 망간, 셀레늄, 구리)에 대해 유사한 프로토콜을 개발할 수 있습니다.

프로토콜

섹션 4의 먹이 시험은 노르웨이어 (FOR-2015-06 - 18-761) 및 유럽 법률 (지침 2010/63 / EU)에 따라 수행되었습니다.

1. SEC-ICP-MS 방법을 사용하여 대서양 연어 사료의 수용성 분수에서 Zn 화학 종의 평가

1. 추출 버퍼 (100 mM Tris-HCl, pH 8.5)
   1. 초순수_H2O에서원하는 이온 강도(100mMMM)에 도달하기 위해 적절한 양의 트라이(하이드록시메틸)아미노메탄을 용해하여 추출 버퍼를 준비한다.
   2. HCl 용액을 사용하여 솔루션의 pH를 pH 8.5로 조정하여 pH 미터로 pH 변화를 모니터링합니다.
2. 사료 샘플 준비
   참고: 사용된 사료 샘플은 주로 식물성 성분(예: 약 5%의 생선 단백질, 10%의 생선 기름, 68%의 식물성 단백질 및 12%의 식물성 오일)에서 단백질 공급원을 함유한 대서양 연어의 상업용 사료를 기반으로 제조되었습니다. 아연 황산염은 사료로 보충되었다.
   1. 유봉과 박격포를 사용하여 수작업으로 사료 샘플을 갈아냅니다.
   2. 이송 샘플을 체로 하여 유사한 입자 크기(850 μm에서 1.12mm)의 유사한 입자 크기로 이송 분획에서 추출이 수행되도록 합니다.
   3. Zn 추출을 수행하려면 진행합니다.
3. 사료 샘플에서 아연 추출
   1. 15mL 원물 튜브에 삼중으로 공급의 약 0.5 g의 무게.
   2. 추출 버퍼(100m Tris-HCl의 5mL, pH 8.5)를 샘플에 추가합니다.
   3. 24시간 동안 4°C에서 회전기(20rpm)에서 샘플을 추출한다.
   4. 3000 x g에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 수용성 및 비 용해성 분획을 분리합니다.
   5. 0.45 μm 일회용 주사기 필터를 사용하여 가용성 분획을 필터링합니다.
   6. 여과된 샘플을 세척 튜브로 옮기습니다.
   7. 1.6단계에서 설명한 바와 같이 SEC-ICP-MS를 사용하여 수용성 분획에서 Zn 분석수행.
      참고: 피드 샘플에서 Zn 추출 절차의 요약은 그림 2에설명되어 있습니다.
4. 모바일 위상 솔루션 (50mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7.5)
   1. 6.057g의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 3% MeOH 용액(v/v)으로 용해시키는 모바일 상용액을 준비한다.
   2. HCl 용액을 사용하여 솔루션의 pH를 7.5로 조정하여 pH 미터로 pH 변화를 모니터링합니다.
   3. 0.45 μm 멤브레인 필터를 통해 이동 상 용액을 필터링합니다.
5. SEC 컬럼 분리 범위의 분자량 교정
   1. 분자량 교정을 수행하여 분리 범위를 보정합니다.
      참고: 이 연구에서는 티로글로불린(660 kDa), Zn/Cu 슈퍼옥사이드 디스무스타제(32kDa), 미오글로빈(17kDa), 비타민 B12(1.36 kDa)가 사용되었다.
   2. 초순수 H₂O에서 공지된 농도로 각 표준을 준비한다.
   3. 유리병에 250 μL의 표준을 추가하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 병병을 준비합니다.
   4. 샘플의 시퀀스 실행에 표준으로 바이알을 로드합니다.
   5. 분석 서열의 시작과 끝에 분자량 교정을 실행하여 ¹²⁷I(티로글로불린), ⁶⁶Zn(Zn/Cu superoxide dismutase), 57Fe(myoglobin) 및 ⁵⁹Co(비타민 B12)를 모니터링합니다.
      참고: 분자량 교정은 Zn 분석과 함께 동시에 수행됩니다.
6. SEC-ICP-MS를 이용한 아연 스펙케이션 분석
   참고: SEC-ICP-MS 방법에 의한 Zn 분석은 다른 곳에서 설명된 원리에 기초하여 개발되었다^10,11 및 추가 최적화는 대서양 연어 사료 7의 분석을 위해^{수행되었다.}
   1. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼과 유도 결합된 혈장 질량 분광법(ICP-MS)과 결합된 HPLC를 사용하여 수용성 분획에 대한 Zn 분화 분석을 수행합니다.
   2. 바이알에 용해 분수 250 μL을 추가하여 HPLC 바이알을 준비합니다.
   3. 분석하기 전에 모든 샘플을 비타민 B120.5μL로 스파이크합니다. 이 단계를 사용하면 보존 시간 이동을 수정하여 ⁵⁹Co를 모니터링할 수 있습니다.
   4. 추출 버퍼(100m Tris-HCl, pH 8.5)로 수용성 분획을 희석하고 최종 부피 1mL에 적응합니다.
   5. 임의순서로 시퀀스 실행을 준비합니다.
   6. 제조업체의 지침에 따라 ICP-MS를 조정합니다.
   7. Zn 분석수행HPLC 및 ICP-MS의 계측기 설정을 따릅니다(표 1참조).

2. 대서양 연어 사료에 보충 Zn의 체외 용해도

참고: 사용된 사료 샘플은 주로 식물성 성분(예: 생선 식사 약 5%, 생선 기름 10%, 식물성 성분 68%, 식물성 기름 12%)에서 단백질 공급원을 함유한 대서양 연어의 상업용 사료를 기반으로 제조되었습니다.

1. 칼 공장을 사용하여 3000 rpm에서 10 s에 대한 대서양 연어 사료 샘플을 갈아서 추가 분석이 될 때까지 4 °C에 보관하십시오.
2. 2.1 단계에서 접지되는 사료 샘플의 ~0.2 g의 무게는5mL 부피 샘플 튜브(캡 포함)에서 공지된 특정 활성의 Zn radiotracer(65 Zn)를 추가합니다.
   주의: 이 절차는 방사성 핵종 제품군 내에서 수행해야 합니다. 이 단계를 수행하는 사람은 라디오 동위원소를 처리하도록 훈련하고 인증받아야 합니다. 연구소의 방사선 안전 행정에 의해 권고된 안전 및 예방 조치는 엄격히 준수해야 합니다.
3. 그런 다음 아래에 설명된 바와 같이 담수 장 발광 완충액을 준비한다.
   1. 염용액 A의 경우, NaNO_3의11.65 g, KNO_3의 0.55 g, MgSO_4의0.4 g의 무게. 초순수 H₂O로 소금을 녹이고 60mL의 최종 부피에 적응합니다.
   2. 소금 용액 B의 경우, 0.31 g의 Ca(NO₃₎₂· ₄ H₂O. 초순수 H₂O로 소금을 녹이고 최종 부피 인 10 mL에 적응합니다.
   3. 500m HEPES 스톡 솔루션을 소금 용액 C로 사용하십시오.
   4. 소금 용액 D의 경우 MgCl_2의1.2 g의 무게, 초퓨어 H₂O로 소금을 용해하고 20 mL의 최종 부피에 적응하십시오.
   5. 염용액 E의 경우 MgSO_4의0.9 g의 무게, 초퓨어 H₂O로 소금을 용해하고 20mL의 최종 부피에 적응한다.
   6. 초퓨어 H₂O의 10mL에 CH₃COCOONa0.55 g를 용해하여 피루바테 용액을 준비하십시오.
   7. 초순수 H₂O에 갈라콘토세(C₆H₁₂O_6)를0.9 g드실한다.
   8. 자기 교반기를 사용하여 잘 녹이고 200 μm 주사기 필터를 통해 여과하여 용액 C, 피루바테 및 갈라토스를 자동화하여 소금 용액 A, B, D 및 E를 살균합니다.
   9. 다른 스톡 솔루션의 준비 후, 완충제의 작업 용액 100mL를 준비한 후, 위의 준비된 솔루션을 다음 비율로 혼합합니다: 6.8 mL의 소금 용액 A, B의 4.14 mL, C5mL, D 2.5mL, E1.5mL, 1.14 mL 각각의 pyvate 및 galatos. 탈온화된 물을 사용하여 100mL로 볼륨을 구성합니다.
      참고: 위의 버퍼는 이제 담수 연어에서 발견되는 장 루멘의 이온 조성을 나타냅니다.
4. 단계 2.6에 설명된 완충제의 6개의 다른 알리쿼시를 준비하고 다음 아미노산(시스테인, 메티오닌, 글리신, 히스티딘, 리신 및 아르기닌)를 추가하여 최종 어금니 농도5m에 도달한다.
5. 담수 장 발광 버퍼(반응 부피 = 3mL; pH 7.4)를 사료 샘플에 추가합니다.
6. 2.4에 기재된 완충제와 함께 2.5를 반복한다(5mM 농도에서 상이한 아미노산의 존재).
7. 튜브를 닫고 25 rpm에서 30 분 동안 회전 스피너에서 회전 할 수 있습니다.
8. 1157 x g에서 10 분 동안 원심 분리하여 수용성 및 불용성 분획을 분리하십시오.
9. 감마 점원을 사용하여 수용성 및 불용성 분획에서 ⁶⁵Zn의 분당 카운트(cpm)를 측정합니다.
10. 수용성 및 비 수용성 분획에 존재하는^Zn(65Zn)의 무선 동위원소의 비율을 계산합니다.

3. 체외 내 모델(RTgutGC)을 사용하여 Zn 화학 종 섭취 평가

1. RTgutGC 세포 배양
   참고: 이 단계에서 사용되는 모든 작업 재료는 멸균되어야 합니다.
   1. 20°C로 설정된 수조에서 냉동 RTgutGC 세포를 부드럽게 부활시보냅니다.
   2. 세포를 포함하는 용액을 부드럽게 피펫하고 10% 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 L15 배지의 10mL에서 이를 일시 중단한다.
      참고: 10% FBS는 냉동 셀을 되살리기 위해서만 사용됩니다. 후속 통로의 경우 FBS는 5%로 사용됩니다. FBS의 구성은 배치마다 다를 수 있으므로 혈청 조성물의 배치 간 변동을 피하기 위해 단일 배치에서 필요한 만큼 구입하고 재고하는 것이 좋습니다.
   3. 75cm² 세포 배양 플라스크에 세포 현탁액을 추가하고 정상적인 대기 하에서 19 °C로 설정된 인큐베이터에 인큐베이션을 넣습니다.
   4. 세포를 확인하고 컨실수(80% 합류, 현미경 하에서 세포 표면의 밀도를 검사하여 시각적으로 평가), 세포를 새로운 플라스크(후속 통로)로 분할하거나 실험에 사용할 수 있는 수확을 한다.
      참고: 세포 배양 플라스크에 시드후 RTgutGC 세포의 1h 및 1주일 의 예가 도 3에도시된다.
2. 세포 수확 및 노출 실험 준비
   1. 1mL 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA) 용액으로 두 번 세척합니다. 세척 할 때마다 멸균 흡입 튜브를 사용하여 EDTA 용액을 제거하십시오.
   2. 트립신 (트립신의 0.7 mL, 인산 완충 식염수 [PBS]에서 0.25 %로 세포를 치료하십시오.
   3. 플라스크를 급성 각도로 부드럽게 회전하여 플라스크 표면을 따라 트립신을 펼립니다.
   4. 세포가 분리되는 동안 2분 동안 회전을 계속합니다.
   5. 부드럽게 2 분 동안 회전 한 후, 트립신을 중화시키기 위해 L15 / FBS 매체의 10 mL을 추가합니다.
   6. 생성된 세포 현탁액을 멸균 파이펫과 원심분리기를 사용하여 원뿔형 하부 원심분리기 튜브로 130 x g로3분 동안 디포징한다.
   7. 혈류계를 사용하여 수동 계수를 사용하여 수확 된 세포의 밀도를 결정합니다.
   8. L15/FBS 배지의 필요한 부피를 추가하여 5 x 10⁴ 셀/mL의 세포 밀도를 달성합니다.
   9. 5 x 10 4 세포의 최종 세포 밀도를 달성하기 위해 우물 당 셀 서스펜션 1 mL을 파이프팅하여²⁴ 웰 플레이트에 세포를 시드하십시오.
      참고: 다중 디스펜싱 파이펫을 사용하여 변동을 최소화하고 시간을 줄이는 것이 좋습니다.
   10. 실험 전에 48시간 동안 19°C의 정상적인 대기 하에서 인큐베이터에 시드 플레이트를 놓습니다.
       참고 : 트립신은 -20 ° C에 저장; EDTA 용액 및 L15/FBS 미디어 4°C. 사용하기 직전에 모든 작업 솔루션 및 미디어의 온도를 19°C로 조정합니다.
3. 노출 미디어 준비
   참고 : 이 단계는 무균 및 멸균 조건하에서 연기 후드 아래에서 수행해야합니다.
   1. 6.8mL의 염용액 A(2.3.1), B1.14mL(2.3.2단계), C 5mL(2.3.3단계), 1.14mL(단계 2.3.6) 및 갈라토스(2.3.7단계)를 혼합하여 L15/ex를 준비한다. 멸균 세포 배양등급 증류수를 사용하여 100mL로 볼륨을 구성합니다.
   2. 6.8mL의 염용액 A(2.3.1), B(2.3.2), C 5mL(2.3.3), D 2.5mL를 혼합하여 FW준비 (2.3.4), E(2.3.5), 1.14mL 각각 피루바테(2.3.6) 및 갈라토스(2.3.7). 멸균, 세포 배양등급 증류수를 사용하여 100mL까지 볼륨을 구성합니다.
   3. 다른 곳에서 설명된 바와 같이 ICP-MS를 사용하여 노출 매체에서 이온의 농도를 정량화한다^12.
      참고: 미디어 준비에서 분석된 이온 농도는 표 2에제시된다.
4. 아연⁽⁶⁵Zn) 유입 에세이
   1. RTgutGC 세포를 완전한 L15/FBS 배지에서 24웰 플레이트(5 x 10⁴ 세포/웰)에 시드합니다.
   2. 19°C에서 정상적인 대기를 가진 인큐베이터에서 48h의 배양.
   3. L-메티오닌(L-Met) 또는 DL-메티오닌(DL-Met)의 부재 시 0.5 M NaOH를 사용하여 모든 실험 미디어 제제를 pH 7.4로 조정하여 2mM 농도에서 조정한다.
      참고: 3.4.3에 기재된 완충제의 pH 조정은 3.4.5 단계에서 세포를 치료하기 전에 신선하게 수행되어야 한다.
   4. 인큐베이션 기간이 완료된 후, 우물에서 배지를 제거하고 PBS로 철저히 헹구십시오.
   5. pH 조정 FW 실험 매체를 추가하고 20분 동안 적응할 수 있습니다.
   6. RTgutGC 세포를 3.4.3 단계에서 기술된 매체에서 3.07, 6.14, 12.27 및 24.55 μM ⁶⁵Zn(II)(II)(ZnCl_2;~~4kBq/mL)의 명목 농도에 노출한다.
   7. 즉시 인큐베이터에 세포를 19°C에서 15분 동안 보관하십시오.
   8. 15 분 잠복이 끝난 후, 문화 슈퍼네티드를 흡인하고 우물에서 제거하십시오.
   9. 얼음 차가운 FW 배지 (200 μM Zn, pH 7.4)로 세포를 헹구고 5 mM 에틸렌 글리콜 비스 (β-아미노에틸 에테르)를 추가하여 담금질 -N, N,N', N'tetraaceacid acid (EGTA) 버퍼 (PH 7.4) 5 minor에 대한 ^모든,5 minor에 대한
   10. 10mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] heptane-2-carboxylicacid 산 (BCH), 아미노산 수송 억제제의 존재 또는 부재에서 위의 미디어 제제에 세포를 노출.
   11. 노출 기간이 15분 이내인 후 3.4.8 및 3.4.9단계를 반복합니다.
   12. RtgutGC 세포는 단층으로 우물의 바닥에 부착됩니다. 0.2% 뜨거운 나트륨 도데실 황산염(SDS) 세제(100 μL/웰)를 사용하여 세포를 소화한다.
       참고: SDS 용액은 사용하기 전에 90°C로 설정된 수조에 1h로 배치되어야 합니다.
   13. 흡인 하 고 1.5 mL 튜브로 세포 digestate를 복구.
   14. 감마 카운터를 사용하여 세포 소화의 방사능을 측정합니다.
       참고: 분당 카운트(cpm)는 방사성 붕괴, 배경 활동에 대해 수정해야 하며 글로버와^{호그스트랜드(13)가}설명한 공식에 따라 특정 활동 계산을 받습니다.
   15. 세포의 단백질 농도를 정량화하기 위해, 0.5 M NaOH의 500 μL로 세포를 균질화한다.
   16. 브래드포드 분석 키트를 사용하여 소 세럼 알부민(BSA)을 표준으로 사용하여 세포 샘플의 단백질 농도를 측정합니다.
       참고: 단백질 농도가 정량화되면 RTgutGC 세포에 의한 Zn 섭취량의 비율은 Pmoles Zn^{min-1 mg-1} 단백질로 발현될 수 있습니다.

4. 대서양 연어에서 식이 Zn의 명백한 가용성(살모 살라)

참고: 대서양 연어 사료는 상업적인 사료를 기반으로 제조되었으며, 주로 식물성 성분(예: 생선 단백질 약 5%, 생선 기름 10%, 식물성 단백질 68%, 식물성 오일 12%)에서 단백질 공급원을 함유하고 있습니다. 2개의 사료는 150 mg/kg의 사료의 Zn 농도를 달성하기 위하여 무기 근원 (Zn sulphate) 또는 유기 근원 (글리신의 Zn chelate)로 보충되었습니다. 또한, Yttrium 산화물(feed grade)은 명백한 가용성 계수의 계산을 가능하게 하기 위해 불활성 마커로서 0.01%로 사료에 첨가되었다.

1. 대서양 연어 (살모브리드 변형, 나이 1 세 이상, 혼합 섹스 그룹) 물고기실험 조건에 사용 될 때까지 그들의 각 탱크에 적응.
2. 매일 사료 섭취량을 모니터링하여 대서양 연어의 적응을 평가합니다.
   참고 : 이 시험은 삼중 탱크에서 수행되었기 때문에 총 6 개의 탱크가 사용되었습니다. 수유 시험 중 수온은 0.3°C± 11.9± 용존 산소 포화도는 101± 5%였다.
3. 11 일 동안 실험 피드와 물고기를 공급합니다.
4. 물 리터 당 트리카인 메탄 황산 스톡 용액6 mL를 사용하여 과다 복용하여 물고기를 안락사시하십시오.
5. 같은 탱크에서 배설물의 풀링 샘플을 수집하여 복부 지느러미에서 항문으로 줄무늬로 접시에 넣습니다.
6. 주걱으로 접시에서 대변을 50 mL 원문 튜브로 제거하고 즉시 샘플을 -20 ° C에 저장합니다.
   참고: 샘플은 추가 분석이 끝날 때까지 -20°C로 유지되었습니다.
7. -80°C에서 72h의 대변 샘플을 동결하십시오.
8. 유봉과 박격포를 사용하여 대변 샘플을 미세 한 분말로 수동으로 균질화합니다.
9. ICP-MS를 사용하여 사료 및 대변 샘플에서 Zn 및 Yttrium의 농도를 결정합니다(다른 곳에서 설명된 대로^9).
10. 다음 수식을 사용하여 명백한 가용성 계수(AAC, %) 결정합니다.
    

결과

SEC-ICP-MS 방법을 사용하여 대서양 연어 사료의 수용성 분수에서 Zn 화학 종의 평가
SEC-ICP-MS 방법은 대서양 연어 사료의 수용성 분획에서 발견되는 Zn 화학 종에 대한 데이터를 제공합니다. 도 4는 용해분에서 발견되는 Zn의 크로마토그래피 프로파일을 보여 줍니다. 이 크로마토그램은 SEC-ICP-MS 방법을 사용하여 수득하였다. 대서양 연어 사료의 수용성 분획에서 봉우리를 함유한 5개의 Zn이 발견되었습니다. 각 피크는 다른 분자량을 가지고; 피크 1(~600kDa), 피크 2, 피크 3(32~17kDa), 피크 4(17~1.36kDa), 피크 5(> 1.36 kDa). 피크 4는 가장 풍부했고, 그 다음으로 각각 2, 3, 5, 1이 그 뒤를 이었다. 수용성 분획에서 발견되는 Zn 화학 종은 사용되는 사료에 해양 기반 및 식물 기반 성분과 보충 형태 (즉, Zn 황산염)를 모두 포함하기 때문에 다른 소스를 가질 수 있습니다. Zn 화학 종의 분자량 범위는 이 화합물이 금속 단백질일 지도 모른다는 것을 건의했습니다.

대서양 연어 사료에 보충 Zn의 체외 용해도
보충의 용해도 ⁶⁵아미노산의 존재에서 Zn 증가. 모든 테스트 된 아미노산 보충의 용해도 증가 ⁶⁵Zn. Methionine, 글리신, 시스테인, 히스티딘, 그리고 리신 향상 ⁶⁵Zn 용해도; 높은 용해도는 히스티딘과 리신(그림 5)으로발견되었다.

시험장 모델(RTgutGC)을 이용한 Zn 종 섭취 평가
RTgutGC 세포에서 Apical 아연 섭취량은 2 mM 농도에서 L-Met 또는 DL-Met의 존재에 의해 크게 영향을 받았다. 더욱이, RTgutGC 세포에서 Zn 섭취량에 메티오닌의 영향은 BCH (아미노산 수송 시스템 차단제)의 존재에 의해 부정적인 영향을 받았으며, BCH로 치료되지 않은 세포와 비교할 때(도 6).

대서양 연어에서 식이 Zn의 명백한 가용성(살모 살라)
대서양 연어에 대 한 실용적인 피드에서, 명백한 Zn 가용성 무기 소스와 보충 할 때 동일 했다 (Zn 황산염) 또는 유기 소스 (글리신의 Zn chelate). 대서양 연어의 Zn(%, n = 3)의 명백한 가용성에 대한 추정값은 무기 공급원(Zn sulphate)을 보충할 때 31%± 12%, 유기 공급원(글리신의 Zn chelate)을 보충할 때 31%± 3%였습니다.

그림 1: 보완적인 방법을 사용하여 광물 가용성을 평가하는 체계적인 접근 방식의 요약입니다. 이 접근법은 Zn 표본, 장 내 Zn 용해도, 장 세포에 의한 Zn 섭취 및 Zn 명백한 가용성을 포함하여 대서양 연어의 아연 가용성을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 피드 샘플에서 Zn 추출 절차의 요약입니다. 아연은 가벼운 추출 조건을 사용하여 사료 샘플에서 추출됩니다. 추출 다음에 Zn 분석이 뒤따릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 세포 배양 플라스크에서 시드 후 RTgutGC 셀 1h (왼쪽)와 1 주 (오른쪽)의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 대서양 연어 사료의 수용성 분획에서 Zn 함유 피크를 나타내고 SEC-ICP-MS에 의해 분석된 크로마토그램. 세 개의 복제는 파란색, 빨간색 및 검은색 선이 특징입니다. 티로글로불린(660kDa, 모니터링 ^127I),Zn/Cu 슈퍼옥사이드 디스뮤타스(32kDa, 모니터링 ^66Zn),미오글로빈(17kDa, 모니터링 ^57Fe),비타민 B12(1.36kDa, 모니터링 ^59Co)를사용하여 분자량 교정을 수행했습니다. 피크 1 (P1): ~600 kDa, 보유 시간 (RT) 8.2 분; 피크 2+3 (P2+3): 32 ~ 17 kDa, RT 14.2 + 15.3 분; 피크 4 (P4): 17에서 1.36 kDa, RT 16.3 분; 피크 5 (P5): > 1.36 kDa, Rt 23.2 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 대서양 연어 사료에서 보충 Zn의 체외 용해도에 아미노산의 영향. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. 데이터는 단방향 ANOVA를 통해 분석되었고, Dunnet의 다중 비교 테스트가 이어졌으며 각 AA 그룹의 평균을 대조군(AA 없음)과 비교했습니다. 별표는 ANOVA(P값 < 0.05(*), < 0.01(**), < 0.001(***), < 0.0001(****)의 중요성 수준을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 메티오닌과 아미노산 수송 억제제의 영향 (2-아미노비시클로 [2.2.1] 헵탄-2-카로실산, BCH, 10 mMM). 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시됩니다. 데이터는 양방향 ANOVA를 통해 분석되었으며, 그 다음으로 Tukey의 다중 비교 테스트와 p < 0.05 수준의 중요성이 있었습니다. 그룹 간의 포스트 혹시 차이는 막대 위의 슈퍼스크립트 문자로 표시됩니다. 다른 슈퍼스크립트가 있는 막대는 통계적으로 다릅니다(p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

HPLC 설정
열	SEC 열 (30cm x 7.8mm, 5 μm 입자 크기) + 가드 컬럼(7 μm 입자 크기)
교정 범위	1.0 × 104 - 5.0 × 105 다
모바일 단계	50 mM 트리스-HCl + 3% MeOH (pH 7.5)
유량	0.7 mL 분-1
사출 볼륨	50 μL
ICP-MS 설정
전진 력	1550 W
플라즈마 가스 흐름	15.0 L 분-1
캐리어 가스 흐름	0.86 L min-1
메이크업 가스 흐름	0.34 L min-1
연연 시간	동위원소 당 0.1 s
모니터링된 동위원소	127 I, 66Zn, 59Co, 57Fe

표 1. HPLC 및 ICP-MS에 대한 계측기 설정 개요입니다.

화학 조성 (mM)	L15/전	실험 매체(L15/FW)
질산 나트륨	155	155
질산칼륨	6.2	6.2
황산 마그네슘	3.8	19.5
질산칼슘	1.5	5.4
헤페스	5	5
염화 마그네슘	-	15
피루바테 나트륨	5.7	5.7
갈락토세	5.7	5.7
pH	7.1	7.4
이온 강도	178	258
이온 조성 (mM)
칼슘, Ca2+ *	1.6 ± 0.1	5.3 ± 0.2
마그네슘, Mg2+ *	3.9 ± 0.3	32.5 ± 0.7
칼륨, K+ *	8.2 ± 1.2	8.6 ± 1.1
나트륨, Na+ *	160 ± 3	157 ± 2
질산염, NO3- **	164	172.4
황산염, SO4- **	3.8	18.7
염화물,클라이드 - **	1.5	31.5

표 2. 실험용 미디어의 화학적 및 이온 조성을 테스트하였다.

토론

Zn의 장 흡수는 Zn 종^13의화학적 형태에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 이와 관련하여, 이 문서에 설명된 프로토콜의 사용은 대서양 연어에서 Zn의 '가용성'의 근본적인 화학 적 및 생물학적 측면에 대한 순차적 연구를 허용했습니다.

이 연구는 Zn 표본 분석 방법의 사용을 보고했다. SEC-ICP-MS 방법은 대서양 연어 사료의 수용성 분획에 존재하는 Zn 화학 종의 분자량에 관한 정성적 데이터를 제공했습니다. 이는 분자량 교정 기준(즉, 티로글로불린(660kDa), Zn/Cu 수퍼옥사이드 디스무타스(32kDa), 미오글로빈(17kDa), 비타민 B12(1.36kDa)의 보존 시간을 비교하여 달성하였다. Zn 표본 분석에서 발견된 과제는 분석 표준의 부족으로 인해 알려지지 않은 Zn 화학 종의 식별이었습니다. SEC에서 분자의 분리는 고정 된 단계에서 기공에 비해 자신의 크기를 기반으로합니다. 원칙적으로, 더 큰 분자는 더 빨리 여행할 것이고, 먼저 용례하고, 더 작은 분자는 나중에^14를보례하면서 느리게 여행할 것입니다. 따라서, 피크를 포함하는 각 Zn은 유사한 분자량^15를가진 몇몇 화합물을 포함할 수 있습니다. 이것은 또한 알려지지 않은 Zn 화학 종을 확인하는 도전에 기여합니다. 더욱이, 몇몇 온화한 추출 조건은 Zn의 추출을 위해 시험되었습니다. 추출된 Zn은 낮았습니다(~10%). 온화한 추출 조건은 Zn 화학 종을 그대로 유지하기 위해 적용되었지만 이것은 추출 효율^7을손상시킬 수 있습니다.

시험관 내 용해도 분석에서, 보충 된 Zn의 용해도 (라디오 동위 원소 ⁶⁵ZnCl₂₎아미노산, 특히 히스티딘 및 라이신, Zn의 용해도 증가 표시(그림 5). 시뮬레이션된 위장 조건하에서 체외 용해도 분석법에 직접 사료 샘플을 사용하는 것은 Zn 분화의 변화가 pH^{의존16이라는}지식을 기반으로 한다. 그러나, 기관의 시작 부분에 산성 조건, 돌이킬 수 있는 수 있는 분광기에 있는 몇몇 변경귀착될 수 있습니다 (예를 들면, ZnO-> ZnCl_2,위장에 있는 산성 조건하에서 HCl의 존재). 그럼에도 불구 하 고, Zn 소스는 ZnSO₄ 그리고 매체에서 아미노산에 의해 향상 된 용해도. 다음 질문에 대한 질문은 증가된 용해도가 가용성으로 변환될 수 있다는 것이었습니다. RTgutGC 장 세포주는이 질문을 연구하는 데 사용되었다. 동물에서 미네랄 영양의 맥락에서, 용어 '가용성' 정의 하기 어렵고 동물에 비해 세포에서 차별화 할 수 있습니다 (생체 내). 따라서, '섭취'라는 용어는 장 세포주사용으로 시험관 내 평가에 올 때 사용되었다. 세포주는 동물의 미네랄 가용성을 제어하는 복잡한 규제 과정의 일부인 장 상피에서 Zn 섭취 메커니즘에 대한 유용한 정보를 제공했습니다. RTgutGC 세포는 아미노산의 존재에 Zn의 apical upup에 대 한 더 나은 용량을 유도 (즉, 메티오닌; 그림 6). 그러나, 생체 내 명백한 가용성크게 대서양 연어에서 무기와 유기 Zn 소스 사이 차이가 없었다. 생체 내 가용성 연구에서 Zn 소스 비교는 대서양 연어의 알려진 Zn 요구 사항을 훨씬 능가 하는 식이 Zn 수준에서 만들어졌다^17,총 Zn 농도 150 mg/kg 피드. 사용 가능 여부의 차이는 동물이 포화상태에 도달하기 전에 테스트된 식이 수준이 선형 동적 범위에서 떨어질 때 더 잘 시각화됩니다. 본 생체 내 연구에서, 대서양 연어는 잘 포화 된 소스 간의 Zn 흡수의 차이를 관찰 할 수있다.

요약하자면, 첫 번째 방법은 대서양 연어 사료의 가용성 분획에서 발견되는 다른 Zn 화학 종에 관한 질적 정보를 제공했습니다. 두 번째 방법은, 보충 된 Zn의 체외 용해도는 아미노산 리간드의 존재에서 향상되었다; 세 번째 방법은 아미노산에 의한 용해도가 개선되어 장 상피에서 섭취를 향상시킬 수 있음을 확인했습니다. 반대로, 네 번째 방법은 무기 또는 유기농 공급원에서 대서양 연어에 이르기까지 Zn의 가용성에 있는 차이를 찾아내지 못했습니다. 결론을 내리기 위해 생체 내 결과와 일치하지는 않지만 체외 프로토콜은 Zn 가용성의 다양한 구성 요소를 이해하는 흥미로운 통찰력을 제공했습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Sartorius
0.45 μm membrane filter	Pall
10 % fetal bovine serum	Eurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter	LKB Wallac
24 well plates (Falcon, TPP microplates)	Thermo Fisher Scientific	10048760
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid	Sigma Aldrich	A7902
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks)	TPP Techno Plastic Products AG	90075
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
Bradford assay kit	Bio-Rad	5000001
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5702
L-Cysteine	Sigma Aldrich	30089
DL-methionine	Alfa Aesar	59-51-8
D-methionine	Sigma Aldrich	M9375
Experimental fish feeds	Skretting
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size)	Tosoh
L-Histidine	Sigma Aldrich	53319
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS	Agilent Technologies
Hydrochloric acid	Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck	1.00317
Knife mill	GM 300, Retsch Gmbh
L-15 medium	Invitrogen/Gibco	21083027
L-methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Lysine	Sigma Aldrich	23128
Methanol	LiChrosolv, HPLC grade, Merck	1.06035
Milli-Q water (18.2 MΩ cm)	EMD Millipore Corporation
Myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
NexION 350D ICP-MS	Perkin Elmer
Pasteur pipette	VWR
pH meter	inoLab
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	806552
RTgutGC cells			Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland
SEC column, TSKgel G3000SWxl	Tosoh
Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm)	Retsch
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	436143
Superoxide dismutase	Sigma Aldrich	S7571
Thyroglobulin	Sigma Aldrich	T1001
Tricaine methanesulphonate	PharmaQ
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma Aldrich	252859
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline	Biowest	L0910
Versene EDTA solution	Invitrogen/Gibco	15040-033
Vitamin B12	Sigma Aldrich	V2876
Zinc chelate of glycine	Phytobiotics
Zinc sulphate	Vilomix