Оценка минеральной доступности в кормах для рыб с использованием дополнительных методов, продемонстрированная на примере цинка в атлантическом лососе

Резюме

В данной статье подробно объясняется системный подход к оценке наличия микроминеральности у атлантического лосося. Методология включает в себя инструменты и модели с возрастающей биологической сложностью: (1) химический анализ видообразования, (2) растворимость in vitro, (3) исследования поглощения в клеточных линиях и (4) исследования in vivo рыб.

Аннотация

Оценка доступности диетических микроминералов является серьезной проблемой в минеральном питании видов рыб. Целью настоящей статьи является описание системного подхода, сочетающего различные методологии оценки доступности цинка (Zn) в атлантическом лососе(Salmo salar). Учитывая, что несколько химических видов Zn могут присутствовать в корме атлантического лосося, было выдвинуто предположение, что доступность Zn зависит от химических веществ Zn, присутствующих в корме. Таким образом, в данном исследовании первый протокол касается того, как извлечь различные химические виды Zn из корма и проанализировать их методом масс-спектроскопии плазмы с индуктивно-индуктивно связанной плазменной (SEC-ICP-MS) с помощью исключения размеров. Впоследствии был разработан метод in vitro для оценки растворимости диетического Zn в кормах атлантического лосося. Третий протокол описывает метод изучения влияния изменения химического видового состава Zn на поглощение Zn в модели эпителия кишечника рыбы с использованием клеточной линии кишечника радужной форели (RTgutGC). Вместе результаты методов in vitro сравнивались с исследованием in vivo, изучающим очевидную доступность неорганических и органических источников Zn, добавляемых в корма атлантического лосося. Результаты показали, что в кормах можно найти несколько химических видов Zn, и эффективность органического источника Zn очень сильно зависит от аминокислотного лиганда, используемого для хелатного Zn. Результаты методов in vitro имели меньшую корреляцию с результатом исследования in vivo. Тем не менее, протоколы in vitro, описанные в этой статье, предоставили важную информацию о наличии Zn и его оценке в кормах для рыб.

Введение

Рыбная мука и рыбий жир традиционно использовались в кормах для атлантического лосося. Однако эти ингредиенты все чаще заменяются растительными ингредиентами¹. Вышеупомянутый сдвиг в составе кормов привел к низкой диетической доступности и увеличению потребности в улучшении минеральной доступности в кормах для атлантического лосося, особенно цинка (Zn)^2. Снижение доступности может быть результатом изменения уровня Zn, химических веществ Zn и/или антипитательных факторов, присутствующих в матрице корма. В этом сценарии появился новый набор добавок, которые в целом считаются «органическими источниками», которые могут стать более доступным источником диетических минералов для рыбы. Поэтому важно понимать фундаментальную химию и физиологию, регулирующие доступность минералов и их источников для рыб. Цинк является важным микроэлементом для всех живых организмов³. Роль Zn как сигнальной молекулы была описана как на параклеточном, так и на внутриклеточном уровне у рыб^4. У атлантического лосося дефицит Zn был связан со скелетными аномалиями и снижением активности различных металлоферментов^{Zn 5,6.}

Это исследование описывает систематический подход к пониманию доступности Zn путем его классификации на четыре различных отдела различной химической и биологической сложности. Используемые методы описаны в четырех разделах, как видно на фиг.1: (1)оценка химических веществ Zn в растворимой фракции корма атлантического лосося с использованием размерно-исключающей хроматографии с индуктивно связанной плазменной масс-спектроскопией (SEC-ICP-MS) метод^7; (2) растворимость in vitro дополненного Zn в корме для атлантического лосося; (3) оценка поглощения химических веществ Zn кишечной моделью in vitro (RTgutGC)^8; и (4) очевидная доступность Zn в атлантическом лососе(Salmo salar)^9. Аналогичные протоколы могут быть разработаны для других минералов (например, марганца, селена, меди), представляющих питательный интерес для видов рыб аквакультуры.

протокол

Испытание кормления в разделе 4 проводилось в соответствии с норвежским (FOR-2015-06 - 18-761) и европейским законодательством (Директива 2010/63/EU).

1. Оценка химических веществ Zn в растворимой фракции корма атлантического лосося методом SEC-ICP-MS

1. Экстракционный буфер (100 мМ Tris-HCl, pH 8,5)
   1. Готовят экстракционный буфер путем растворения соответствующего количества трис(гидроксиметил)аминометана для достижения желаемой ионной силы (100 мМ) в сверхчистом_H2O.
   2. Отрегулируйте pH раствора до pH 8,5 с раствором HCl, контролируя изменение pH с помощью pH-метра.
2. Подготовка образцов кормов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использованный образец корма был составлен на основе коммерческих кормов для атлантического лосося, содержащих источники белка в основном из растительных ингредиентов (т.е. приблизительно 5% рыбьего белка, 10% рыбьего жира, 68% растительного белка и 12% растительного масла). Сульфат цинка добавляли в корм.
   1. Измельчите образец корма вручную с помощью пестиков и ступки.
   2. Просеиваем образец корма, чтобы гарантировать, что экстракция выполняется в кормовой фракции с аналогичным размером частиц (от 850 мкм до 1,12 мм).
   3. Приступайте к извлечению Zn.
3. Извлечение цинка из образца корма
   1. Взвесите приблизительно 0,5 г корма в трехместных пробирках по 15 мл.
   2. Добавьте к образцам буфер экстракции (5 мл 100 мМ Tris-HCl, рН 8,5).
   3. Извлекайте образцы в ротаторе (20 об/мин) при 4 °C в течение 24 ч.
   4. Отделяют растворимые и нерастворимые фракции центрифугированием в течение 10 мин при 3000 х г.
   5. Используйте одноразовый шприцевой фильтр 0,45 мкм для фильтрации растворимой фракции.
   6. Перенесите отфильтрованные образцы в чистые пробирки.
   7. Выполните анализ видообразования Zn в растворимых фракциях с использованием SEC-ICP-MS, как описано в шаге 1.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Краткое описание процедуры извлечения Zn из образца корма описано на рисунке 2.
4. Раствор подвижной фазы (50 мМ Tris-HCl + 3% MeOH, рН 7,5)
   1. Готовят раствор подвижной фазы, растворяя 6,057 г трис(гидроксиметил)аминометана в 1 л 3% раствора MeOH (v/v).
   2. Отрегулируйте pH раствора до pH до 7,5 с помощью раствора HCl, контролируя изменение pH с помощью рН-метра.
   3. Фильтруйте раствор подвижной фазы через мембранный фильтр 0,45 мкм.
5. Калибровка молекулярной массы диапазона разделения колонн SEC
   1. Откалибруйку диапазона разделения, выполнив калибровку молекулярной массы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовались тиреоглобулин (660 кДа), супероксиддисмутаза Zn/Cu (32 кДа), миоглобин (17 кДа) и витамин B12 (1,36 кДа).
   2. Готовят каждый из эталонов с известной концентрацией в сверхчистом_H2O.
   3. Приготовьте флакон с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), добавив во флакон 250 мкл стандартного образца.
   4. Загрузите флаконы со стандартами для последовательного выполнения образцов.
   5. Выполните калибровку молекулярной массы в начале и в конце аналитической последовательности, контролируя ¹²⁷I (тиреоглобулин), ⁶⁶Zn (супероксиддисмутаза Zn / Cu), 57 Fe (миоглобин) и ⁵⁹Co (витамин B12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка молекулярной массы выполняется одновременно с анализом видообразования Zn.
6. Анализ видообразования цинка с использованием SEC-ICP-MS
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ видообразования Zn методом SEC-ICP-MS был разработан на основе принципов, описанных в других разделах^10,11, и дальнейшая оптимизация была выполнена для анализа корма для атлантического лосося^7.
   1. Выполните анализ видообразования Zn на растворимых фракциях с помощью колонки исключающей хроматографии (SEC) и ВЭЖХ в сочетании с масс-спектроскопией плазмы с индуктивно связанной (ICP-MS).
   2. Приготовьте флакон вэжх, добавив во флакон 250 мкл растворимой фракции.
   3. Перед анализом дополняйте все образцы 0,5 мкл витамина B12. Этот шаг позволяет корректировать время удержания сдвигов, контролируя ⁵⁹Co.
   4. Разбавить растворимую фракцию экстракционным буфером (100 мМ Tris-HCl, рН 8,5) и довести до конечного объема 1 мл.
   5. Подготовьте последовательный запуск образцов в случайном порядке.
   6. Настройте ICP-MS в соответствии с инструкциями производителя.
   7. Следуйте настройкам приборов для ВЭЖХ и ICP-MS, выполняющих анализ видообразования Zn (см. таблицу 1).

2. Растворимость in vitro дополненного Zn в корме для атлантического лосося

ПРИМЕЧАНИЕ: Использованный образец корма был составлен на основе коммерческих кормов для атлантического лосося, содержащих источники белка в основном из растительных ингредиентов (т.е. приблизительно 5% рыбной муки, 10% рыбьего жира, 68% растительных ингредиентов и 12% растительного масла).

1. Измельчите образцы корма для атлантического лосося в течение 10 с при 3000 об/мин с помощью ножевой мельницы и храните при 4 °C до дальнейшего анализа.
2. Взвесьте ~0,2 г образцов подачи, измельченных на этапе 2.1, и добавьте радиоинследователь Zn⁽⁶⁵Zn) известной удельной активности в пробочку объемом 5 мл (с колпачком).
   ВНИМАНИЕ: Эта процедура должна выполняться внутри радионуклидного набора. Человек, выполняющий этот шаг, должен быть обучен и сертифицирован для работы с радиоизотопами. Необходимо строго соблюдать меры безопасности и предосторожности, рекомендованные администрацией радиационной безопасности института.
3. Затем готовят пресноводный кишечный просветный буферный раствор, как описано ниже.
   1. Для солевого раствора А взвесьте 11,65 г NaNO_3,0,55 г KNO₃ и 0,4 г MgSO_4. Растворите соли в сверхчистом_H2O и отрегулируйте до конечного объема 60 мл.
   2. Для солевого раствора B взвесьте 0,31 г Ca(NO₃₎₂· _{4 4 H2}O. Растворите соли в сверхчистом_H2O и отрегулируйте до конечного объема 10 мл.
   3. Используйте 500 мМ раствора HEPES в качестве раствора соли C.
   4. Для солевого раствора D взвесьте 1,2 г_MgCl2,растворите соль в сверхчистом_H2O и отрегулируйте до конечного объема 20 мл.
   5. Для солевого раствора Е взвесьте 0,9 г MgSO_4,растворите соль в сверхчистом_H2O и отрегулируйте до конечного объема 20 мл.
   6. Готовят раствор пирувата, растворяя 0,55 г CH₃COCOONa в 10 мл сверхчистого_H2O.
   7. Растворить 0,9 г галактозы_(С6Н12О₆₎в сверхчистом_Н2О.
   8. Хорошо растворяют с помощью магнитной мешалки и стерилизуют растворы солей A, B, D и E путем автоклавирования, а раствор С, пируват и галактозу фильтрацией через шприцевой фильтр 200 мкм.
   9. После приготовления различных бульонных растворов, чтобы приготовить 100 мл рабочего раствора буфера, смешать вышеуказанные приготовленные растворы в следующей пропорции: 6,8 мл солевого раствора А, 4,14 мл В, 5 мл С, 2,5 мл D, 1,5 мл Е и 1,14 мл пирувата и галактозы. Внесите объем до 100 мл с помощью деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный выше буфер теперь будет представлять ионный состав кишечного просвета, обнаруженного у пресноводных лососевых.
4. Подготовьте шесть других аликвот буфера, описанного на этапе 2.6, и добавьте одну из следующих аминокислот (цистеин, метионин, глицин, гистидин, лизин и аргинин) для достижения конечной молярной концентрации 5 мМ.
5. Добавьте к образцу корма просветный буфер пресной воды кишечника (реакционный объем = 3 мл; рН 7,4).
6. Повторите этап 2.5 с буферами, описанными в 2.4 (в присутствии различных аминокислот в концентрации 5 мМ).
7. Закройте трубки и дайте им вращаться во вращательном спиннере в течение 30 минут при 25 оборотах в минуту.
8. Отделяйте растворимые и нерастворимые фракции центрифугированием в течение 10 мин при 1157 х г.
9. Используйте гамма-кассер для измерения количества в минуту (cpm) ⁶⁵Zn в растворимых и нерастворимых фракциях.
10. Рассчитайте долю радиоизотопов Zn⁽⁶⁵Zn), присутствующих в растворимых и нерастворимых фракциях.

3. Оценка поглощения химических веществ Zn с использованием кишечной модели in vitro (RTgutGC)

1. Культура клеток RTgutGC
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все рабочие материалы, используемые на этом этапе, должны быть стерильными.
   1. Осторожно оживите замороженные клетки RTgutGC на водяной бане при температуре 20 °C.
   2. Аккуратно вылейте в пипетку раствор, содержащий клетки, и суспендируйте их в 10 мл среды L15, содержащей 10% фетальной бытовой сыворотки (FBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10% FBS используется только для восстановления замороженных клеток. Для последующего прохождения используется FBS на уровне 5%. Состав ФБС может варьироваться между партиями, поэтому желательно покупать и запасать столько, сколько требуется из одной партии, чтобы избежать межсерийных вариаций в составе сыворотки.
   3. Добавьте клеточную суспензию в колбы для 75^см2 культуры клеток и инкубируют в инкубаторе, установленном при 19 °C при нормальной атмосфере.
   4. Проверяют клетки и при слиянии (80% слияние, оценивают визуально, исследуя плотность клеточной поверхности под микроскопом), расщепляют клетки на новые колбы (последующее прохождение) или собирают урожай для использования в экспериментах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример клеток RTgutGC через 1 ч и 1 неделю после посева в колбы для культивирования клеток показан на фиг.3.
2. Сбор клеток и подготовка к экспериментам по воздействию
   1. Дважды промыть клетки раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 1 мл. После каждой промывки выкачивайте раствор ЭДТА с помощью стерильной всасываемой трубки.
   2. Обработайте клетки трипсином (0,7 мл трипсина, в 0,25% в фосфатно-буферном физиологическом растворе [PBS]).
   3. Осторожно поверните колбу под острыми углами, чтобы распределить трипсин по всей поверхности колбы.
   4. Продолжайте вращение в течение 2 мин, пока клетки отсоеся.
   5. После осторожного вращения в течение 2 мин добавьте 10 мл среды L15/FBS для нейтрализации трипсина.
   6. Декантированную клеточную суспензию в коническую нижнюю центрифужную трубку с помощью стерильной пипетки и центрифуги в течение 3 мин при 130 х г.
   7. Определить плотность собранных клеток можно методом ручного подсчета с помощью гемоцитометра.
   8. Добавьте необходимый объем среды L15/FBS для достижения плотности ячейки 5 x 10⁴ ячеек/мл.
   9. Засеять клетки на пластины из 24 скважин путем пипетирования 1 мл клеточной суспензии на скважину для достижения конечной плотности клеток 5 х 10⁴ ячейки / скважина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать мультираздаточные пипетки, чтобы свести к минимуму вариации и сократить время.
   10. Поместите семенные пластины в инкубатор при нормальной атмосфере при 19 °C в течение 48 ч перед экспериментами.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин хранить при -20 °C; Раствор ЭДТА и среда L15/FBS при 4 °C. Отрегулируйте температуру всех рабочих растворов и сред до 19 °C непосредственно перед использованием.
3. Подготовка экспозиционной среды
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен под вытяжным капотом в асептических и стерильных условиях.
   1. Готовят L15/ex путем смешивания 6,8 мл солевого раствора А (этап 2.3.1), 1,14 мл В (этап 2.3.2), 5 мл С (этап 2.3.3) и 1,14 мл пирувата (этап 2.3.6) и галактозы (этап 2.3.7). Внесите объем до 100 мл с помощью дистиллированной воды класса стерильной клеточной культуры.
   2. Готовят FW путем смешивания 6,8 мл солевого раствора A (2.3.1), 4,14 мл B (2.3.2), 5 мл C (2.3.3), 2,5 мл D (2.3.4), 1,5 мл E (2.3.5) и 1,14 мл пирувата (2.3.6) и галактозы (2.3.7). Внесите объем до 100 мл с помощью стерильной дистиллированной воды клеточной культуры.
   3. Количественная оценка концентраций ионов в средах воздействия с использованием МСП-МС, как описано в другом месте^12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируемые концентрации ионных веществ в препаратах сред представлены в таблице 2.
4. Анализы притока цинка⁽⁶⁵Zn)
   1. Высевают ячейки RTgutGC на пластины из 24 скважин (5 x 10⁴ ячейки/лунка) в полную среду L15/FBS.
   2. Инкубировать в течение 48 ч в инкубаторе с нормальной атмосферой при 19 °C.
   3. Довести все экспериментальные препараты среды до рН 7,4 с использованием 0,5 М NaOH в присутствии или отсутствии L-метионина (L-Met) или DL-метионина (DL-Met) при концентрации 2 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка рН буферов, описанная в разделе 3.4.3, должна быть выполнена заново перед обработкой клеток на этапе 3.4.5.
   4. После завершения инкубационного периода удалите среду из колодцев и тщательно промойте ПБС.
   5. Добавьте экспериментальную жиму FW с поправкой на pH и дайте акклиматизироваться в течение 20 мин.
   6. Подвергайте клетки RTgutGC воздействию номинальных концентраций 3,07, 6,14, 12,27 и 24,55 мкМ ⁶⁵Zn(II) (как ZnCl_2;~4 кБк/мл) в средах, описанных на этапе 3.4.3.
   7. Сразу после этого держите клетки в инкубаторе при 19 °C в течение 15 минут.
   8. После того, как 15-минутная инкубация закончится, аспирируют супернатант культуры и удаляют из лунки.
   9. Промыть клетки ледяной холодной средой FW (с 200 мкМ Zn, рН 7,4), а затем закалить, добавив 5 мМ этиленгликоля-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA) буфер (рН 7,4) в течение 5 мин, чтобы избавиться от любых адсорбированных ⁶⁵Zn(II).
   10. Подвергают клетки воздействию вышеуказанных сред препаратов в присутствии или отсутствии 10 мМ 2-Аминобицикло [2.2.1]гептан-2-карбоновой кислоты (БКГ), ингибитора транспорта аминокислот.
   11. После периода воздействия 15 мин повторите шаги 3.4.8 и 3.4.9.
   12. Ячейки RtgutGC будут прилипать к дну скважин в виде монослоя. Переваривайте клетки, используя 0,2% горячее моющее средство додецилсульфата натрия (SDS) (100 мкл / хорошо).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием раствор SDS необходимо поместить на 1 ч в водяную баню, установленную на 90 °C.
   13. Аспирировать и восстановить клеточный дигестат в пробирку объемом 1,5 мл.
   14. Измерьте радиоактивность клеточных перевариваемых с помощью гамма-счетчика.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Количество в минуту (cpm) должно быть скорректировано на радиоактивный распад, фоновую активность и подвергнуто расчетам конкретной активности в соответствии с формулами, описанными Гловером и Хогстрандом^13.
   15. Чтобы количественно оценить концентрацию белка в клетках, гомогенизируйте клетки с 500 мкл 0,5 M NaOH.
   16. Используйте набор для анализа Брэдфорда для измерения концентрации белка в образце клетки, с бытовым сывороточным альбумином (BSA) в качестве стандарта.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Как только концентрация белка количественно определена, скорость поглощения Zn клетками RTgutGC может быть выражена в виде пмоле Zn мин^-1 мг^-1 белка.

4. Кажущаяся доступность диетического Zn в атлантическом лососе(Salmo salar)

ПРИМЕЧАНИЕ: Корма для атлантического лосося были разработаны на основе коммерческих кормов, содержащих источники белка в основном из растительных ингредиентов (т.е. примерно 5% рыбьего белка, 10% рыбьего жира, 68% растительного белка и 12% растительного масла). Два корма были дополнены неорганическим источником (сульфат Zn) или органическим источником (хелат Zn глицина) для достижения концентрации Zn 150 мг/кг корма. Кроме того, оксид иттрия (кормовой сорт) добавляли в корм под 0,01% в качестве инертного маркера, чтобы можно было рассчитать коэффициент кажущейся доступности.

1. Акклиматизируйте атлантического лосося (штамм SalmoBreed, возраст 1+ лет, смешанные половые группы) в соответствующих аквариумах до тех пор, пока рыба не будет использована в экспериментальных условиях.
2. Оцените акклиматацию атлантического лосося, контролируя его ежедневное потребление корма.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это испытание проводилось в тройных танках, таким образом, было использовано в общей сложности шесть танков. Во время испытания кормления температура воды составляла 11,9 ± 0,3 °C, а насыщение растворенным кислородом составляло 101 ± 5%.
3. Кормите рыб экспериментальными кормами в течение 11 дней.
4. Усыпить рыбу путем передозировки, используя 6 мл раствора трикаина метансульфоната на литр воды.
5. Соберите объединенный образец кала рыбы из того же аквариума в тарелку, перемещая от вентрального плавника к анусу.
6. Удалите кал из пластины шпателем в коническую трубку 50 мл и немедленно храните образцы при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы хранились при -20 °C до дальнейшего анализа.
7. Сублимационная сушка образцов кала в течение 72 ч при -80 °C.
8. Вручную гомогенизируйте образец кала в мелкий порошок с использованием пестиков и ступки.
9. Определить концентрацию Zn и иттрия в образцах кормов и фекалий с помощью ICP-MS (как описано в другом месте^9).
10. Определите коэффициент кажущейся доступности (AAC, %) по следующей формуле:
    

Результаты

Оценка химических веществ Zn в растворимой фракции корма атлантического лосося с использованием метода SEC-ICP-MS
Метод SEC-ICP-MS предоставляет данные о химических видах Zn, обнаруженных в растворимой фракции корма атлантического лосося. На фиг.4 показан хроматографический профиль Zn, обнаруженный в растворимой фракции. Эта хроматограмма была получена с использованием метода SEC-ICP-MS. Пять Zn-содержащих пиков были обнаружены в растворимых фракциях корма атлантического лосося. Каждый пик имеет различную молекулярную массу; пик один (~ 600 кДа), пик два и пик третий (от 32 до 17 кДа), пик четыре (от 17 до 1,36 кДа) и пик пять (> 1,36 кДа). Пик четыре был самым обильным, за ним следовали пик два, три, пять и один соответственно. Химические вещества Zn, обнаруженные в растворимой фракции, могут иметь различные источники, поскольку используемый корм содержит как морские, так и растительные ингредиенты, а также дополненную форму (т.е. сульфат Zn). Диапазон молекулярной массы химических видов Zn предполагает, что эти соединения могут быть металлопротеинами.

Растворимость in vitro дополненного Zn в кормах для атлантического лосося
Растворимость добавляемых ⁶⁵Zn повышается в присутствии аминокислот. Все испытуемые аминокислоты повышали растворимость добавляемых ⁶⁵Zn. Метионин, глицин, цистеин, гистидин и лизин улучшали ^{растворимость на 65}Zn; более высокая растворимость была обнаружена при гистидине и лизине(рисунок 5).

Оценка поглощения видов Zn с использованием кишечной модели in vitro (RTgutGC)
На апикальный захват цинка в клетках RTgutGC значительно влияло присутствие L-Met или DL-Met в концентрациях 2 мМ. Кроме того, влияние метионина на поглощение Zn в клетках RTgutGC отрицательно влияло присутствие BCH (блокатора транспортной системы аминокислот) по сравнению с клетками, необработанными BCH(рисунок 6).

Очевидная доступность диетического Zn в атлантическом лососе(Salmo salar)
В практических кормах для атлантического лосося очевидная доступность Zn была одинаковой при приеме добавок с неорганическим источником (сульфат Zn) или органическим источником (хелат Zn глицина). Оценочные значения кажущейся доступности Zn (%, n = 3) у атлантического лосося составили 31% ± 12% при приеме добавок с неорганическим источником (сульфат Zn) и 31% ± 3% при дополнении органического источника (хелат Zn глицина).

Рисунок 1:Краткое изложение системного подхода к оценке минеральной доступности с использованием дополнительных методов. Этот подход был использован для изучения доступности цинка в атлантическом лососе, включая видообразование Zn, растворимость Zn в кишечной среде, поглощение Zn кишечными клетками и кажущуюся доступность Zn. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Краткое изложение процедуры извлечения Zn из образца корма. Цинк извлекается из образца корма с использованием мягких условий экстракции. За извлечением следует анализ видообразования Zn. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Пример клеток RTgutGC через 1 ч (слева) и 1 неделю (справа) после посева в колбы для культуры клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4:Хроматограмма, показывающая Zn-содержащие пики из растворимой фракции корма атлантического лосося и проанализированная SEC-ICP-MS. Три реплики характеризуются синей, красной и черной линиями. Калибровку молекулярной массы проводили с использованием тиреоглобулина (660 кДа, мониторинг ¹²⁷I), супероксиддисмутазы Zn/Cu (32 кДа, мониторинг ⁶⁶Zn), миоглобина (17 кДа, мониторинг ⁵⁷Fe), витамина B12 (1,36 кДа, мониторинг ⁵⁹Co); Пик 1 (P1): ~600 кДа, время удержания (RT) 8,2 мин; Пик 2+3 (P2+3): от 32 до 17 кДа, RT 14,2 + 15,3 мин; Пик 4 (P4): от 17 до 1,36 кДа, RT 16,3 мин; Пик 5 (P5): > 1,36 кДа, Rt 23,2 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Влияние аминокислот на растворимость in vitro добавляемого Zn в кормах атлантического лосося. Данные представлены в виде среднего ± УР (n = 3). Данные были проанализированы с помощью односторонней ANOVA, за которой последовал тест на множественное сравнение Даннета, сравнивающий среднее значение каждой группы АА с контрольной группой (без АА). Звездочками обозначен уровень значимости ANOVA (P-значения < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) и < 0,0001 (****)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6:Влияние метионина и ингибитора транспорта аминокислот (2-Аминобицикло [2.2.1]гептан-2-карбоновой кислоты, BCH, 10 мМ). Данные представлены в виде среднего ± УР (n = 3). Данные были проанализированы с помощью двустороннего ANOVA, за которым последовал тест туки с множественным сравнением с уровнем значимости p < 0,05. Пост-специальные различия между группами представлены в виде надстрочного индекса над полосами; бары с разными надстрочными индексами статистически различны (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Настройки ВЭЖХ
Столбец	Колонка SEC (30 см x 7,8 мм, размер частиц 5 мкм) + защитная колонна (размер частиц 7 мкм)
Диапазон калибровки	1.0 × 104 - 5.0 × 105 да
Мобильная фаза	50 мМ Tris-HCl + 3% MeOH (рН 7,5)
Расход	0,7 мл мин−1
Объем впрыска	50 мкл
Параметры ICP–MS
Мощность вперед	1550 Вт
Поток плазменных газов	15.0 л мин−1
Расход газа-носителя	0,86 л мин−1
Поток подпитывного газа	0,34 л мин−1
Время пребывания	0,1 с на изотоп
Мониторинг изотопов	127 г. I, 66Zn, 59Co, 57Fe

Таблица 1. Обзор настроек приборов для ВЭЖХ и МСП-МС.

Химический состав (мМ)	L15/ex	Экспериментальная среда (L15/FW)
Нитрат натрия	155	155
Нитрат калия	6.2	6.2
Магния сульфат	3.8	19.5
Нитрат кальция	1.5	5.4
ХЕПЕС	5	5
Магния хлорид	-	15
Пируват натрия	5.7	5.7
Галактоза	5.7	5.7
рН	7.1	7.4
Ионная сила	178	258
Ионный состав (мММ)
Кальций, Ca2+ *	1.6 ± 0.1	5.3 ± 0.2
Магний, Мг2+ *	3.9 ± 0.3	32.5 ± 0.7
Калий, К+ *	8.2 ± 1.2	8.6 ± 1.1
Натрий, Na+ *	160 ± 3	157 ± 2
Нитрат, NO3- **	164	172.4
Сульфат, SO4- **	3.8	18.7
Хлорид, Cl- **	1.5	31.5

Таблица 2. Химический и ионный состав экспериментальной среды проверен.

Обсуждение

На кишечное всасывание Zn, по-видимому, влияет химическая форма вида Zn^13. В связи с этим использование протоколов, описанных в данной статье, позволило последовательно изучать химические и биологические аспекты, лежащие в основе «доступности» Zn в атлантическом лососе.

В этом исследовании сообщалось об использовании метода анализа видообразования Zn. Метод SEC-ICP-MS предоставил качественные данные о молекулярной массе химических веществ Zn, присутствующих в растворимой фракции корма атлантического лосося. Это было достигнуто путем сравнения времени удержания калибровочных эталонов молекулярной массы (т.е. тиреоглобулина (660 кДа), супероксиддисмутазы Zn/Cu (32 кДа), миоглобина (17 кДа) и витамина B12 (1,36 кДа)) со временем удержания Zn, содержащего пики. Проблемой, обнаруженной в анализе видообразования Zn, была идентификация неизвестных химических видов Zn из-за отсутствия аналитических стандартов. В SEC разделение молекул основано на их размерах относительно пор в стационарной фазе. В принципе, более крупные молекулы будут путешествовать быстрее, элюируя первыми, а меньшие молекулы будут путешествовать медленнее, элюируя позже^14. Следовательно, каждый Zn, содержащий пик, может содержать несколько соединений с аналогичной молекулярной массой^15. Это также способствует проблеме идентификации неизвестных химических видов Zn. Кроме того, для извлечения Zn было протестировано несколько мягких условий экстракции. Извлеченный Zn был низким (~10%). Мягкие условия экстракции были применены для сохранения химических веществ Zn нетронутыми, но это, возможно, поставило под угрозу эффективность экстракции^7.

В анализе растворимости in vitro растворимость дополненного Zn (в виде радиоизотопа ⁶⁵ZnCl₂₎показала, что аминокислоты, особенно гистидин и лизин, увеличивают растворимость Zn(рисунок 5). Использование образцов корма непосредственно для анализа растворимости in vitro в смоделированных желудочно-кишечных условиях основано на знании того, что изменение видообразования Zn зависит от рН^16. Однако кислые условия в начале желудочно-кишечного тракта могут привести к некоторому изменению видообразования, которое может быть необратимым (например, ZnO-> ZnCl_2,в присутствии HCl в кислых условиях в желудке). Тем не менее, источником Zn, используемым здесь, является_{ZnSO 4,} растворимость которого была улучшена аминокислотами в среде. Следующий вопрос, на который необходимо ответить, заключался в том, можно ли перевести повышенную растворимость в доступность? Для изучения этого вопроса была использована клеточная линия кишечника RTgutGC. В контексте минерального питания у животных термин «доступность» трудно определить и может регулироваться дифференцированно в клетках (in vitro) по сравнению с животным (in vivo). Следовательно, термин «поглощение» использовался, когда дело доходило до оценки in vitro с использованием кишечной клеточной линии. Клеточная линия предоставила полезную информацию о механизмах поглощения Zn в кишечном эпителии, который является частью сложного регуляторного процесса, регулирующего доступность минералов у животных. Клетки RTgutGC вызывали лучшую способность к апикального поглощению Zn в присутствии аминокислоты (т.е. метионина; Рисунок 6). Однако кажущаяся доступность in vivo существенно не различаться между неорганическими и органическими источниками Zn в атлантическом лососе. В исследовании доступности in vivo сравнение источников Zn проводилось при диетических уровнях Zn, значительно превышающих известные потребности в Zn атлантического лосося^17,общую концентрацию Zn 150 мг / кг корма. Различия в доступности лучше визуализируются, когда тестируемые диетические уровни падают в линейном динамическом диапазоне до того, как животное достигнет насыщения. В настоящем исследовании in vivo возможно, что атлантический лосось был хорошо насыщен для наблюдаемой разницы в поглощении Zn между используемыми источниками.

Таким образом, первый метод предоставил качественную информацию о различных химических видах Zn, обнаруженных в растворимой фракции корма атлантического лосося; второй способ, in vitro растворимость дополненного Zn улучшалась в присутствии аминокислотных лигандов; третий метод подтвердил, что улучшенная растворимость аминокислот может улучшить поглощение эпителия кишечника; и наоборот, четвертый метод не смог найти различий в доступности Zn от неорганического или органического источника до атлантического лосося. В заключение, хотя и не в соответствии с выводами in vivo, протоколы in vitro предоставили интересное понимание различных компонентов доступности Zn.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Sartorius
0.45 μm membrane filter	Pall
10 % fetal bovine serum	Eurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter	LKB Wallac
24 well plates (Falcon, TPP microplates)	Thermo Fisher Scientific	10048760
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid	Sigma Aldrich	A7902
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks)	TPP Techno Plastic Products AG	90075
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
Bradford assay kit	Bio-Rad	5000001
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5702
L-Cysteine	Sigma Aldrich	30089
DL-methionine	Alfa Aesar	59-51-8
D-methionine	Sigma Aldrich	M9375
Experimental fish feeds	Skretting
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size)	Tosoh
L-Histidine	Sigma Aldrich	53319
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS	Agilent Technologies
Hydrochloric acid	Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck	1.00317
Knife mill	GM 300, Retsch Gmbh
L-15 medium	Invitrogen/Gibco	21083027
L-methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Lysine	Sigma Aldrich	23128
Methanol	LiChrosolv, HPLC grade, Merck	1.06035
Milli-Q water (18.2 MΩ cm)	EMD Millipore Corporation
Myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
NexION 350D ICP-MS	Perkin Elmer
Pasteur pipette	VWR
pH meter	inoLab
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	806552
RTgutGC cells			Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland
SEC column, TSKgel G3000SWxl	Tosoh
Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm)	Retsch
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	436143
Superoxide dismutase	Sigma Aldrich	S7571
Thyroglobulin	Sigma Aldrich	T1001
Tricaine methanesulphonate	PharmaQ
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma Aldrich	252859
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline	Biowest	L0910
Versene EDTA solution	Invitrogen/Gibco	15040-033
Vitamin B12	Sigma Aldrich	V2876
Zinc chelate of glycine	Phytobiotics
Zinc sulphate	Vilomix