使用大西洋鲑鱼锌示例证明的补充方法评估鱼类饲料中的矿物供应情况

摘要

本文详细解释了评估大西洋鲑鱼微矿物可用性的系统方法。该方法包括生物复杂性日益提高的工具和模型:（1） 化学光谱分析，（2） 体外溶血性，（3） 细胞系吸收研究，（4） 活体鱼类研究。

摘要

评估膳食微矿物质的可得性是鱼类矿物营养的一大挑战。本文旨在描述一种系统的方法，结合不同的方法来评估大西洋鲑鱼（萨尔莫萨拉）中锌（Zn）的可用性。考虑到大西洋鲑鱼饲料中可能存在几个Zn化学物种，因此推测Zn的可用性受饲料中存在的Zn化学物种的影响。因此，在这项研究中，第一个协议是关于如何从饲料中提取不同的Zn化学物种，并通过大小排除色谱-感应耦合等离子体质谱（SEC-ICP-MS）方法分析它们。随后，开发了一种体外方法，以评估大西洋鲑鱼饲料中膳食Zn的溶解性。第三个协议描述了使用虹鱼肠道细胞系（RTgutGC）研究改变Zn化学物种成分对鱼肠道上皮模型中Zn吸收的影响的方法。将体外方法的发现与一项体内研究进行了比较，该研究检查了Zn补充大西洋鲑鱼饲料的无机和有机来源的明显可用性。结果表明，在饲料中可以发现几个Zn化学物种，有机Zn源的效率在很大程度上取决于用于溷合Zn的氨基酸配体。体外方法的发现与体内研究的结果相关性较小。然而，本文中描述的体外协议提供了有关 Zn 可用性及其在鱼类饲料中的评估的关键信息。

引言

鱼粉和鱼油传统上用于大西洋鲑鱼饲料。然而，这些成分正越来越多地被植物性成分¹所取代。上述饲料成分的改变导致饮食供应不足，对改善大西洋鲑鱼饲料，特别是锌^（Zn）2的矿物供应的需求增加。可用性减少可能是 Zn 水平、Zn 化学物种或/和饲料基质中存在的抗营养因素发生变化的结果。在这种情况下，一系列被普遍视为"有机来源"的添加剂已经出现，有可能成为鱼类更好的膳食矿物质来源。因此，重要的是要了解基本的化学和生理学，以指导矿物及其鱼类来源的供应。锌是所有生物体的基本微量元素^。Zn作为信号分子的作用在鱼⁴的准细胞和细胞内水平上都得到了描述。在大西洋鲑鱼中，Zn缺乏与骨骼异常和各种Zn金属酶^5，6的活性降低有关。

这项研究描述了一种系统的方法来理解Zn的可用性，将其分类为四个不同的化学和生物复杂性的隔间。所涉及的方法分为四个部分，如图1:（1）利用大小排除色谱-感应耦合等离子体质谱（SEC-ICP-MS）方法⁷对大西洋鲑鱼饲料可溶性部分的Zn化学物种的评价:（2） 大西洋鲑鱼饲料中补充Zn的体外溶血性:（3） 评价Zn化学物种吸收体外肠道模型（RTgutGC）8:和 （4） 大西洋鲑鱼 （萨尔莫萨拉尔）⁹中 Zn 的明显可用性。类似的协议可以开发为水产养殖鱼类物种的营养感兴趣的其他矿物（例如锰、氦、铜）。

研究方案

第4节的喂养试验是根据挪威（FOR-2015-06 - 18-761）和欧洲立法（指令2010/63/EU）进行的。

1. 使用 SEC-ICP-MS 方法评估大西洋鲑鱼饲料可溶性部分中的 Zn 化学物种

1. 提取 缓冲器 （100 m M Tris-HCl， pH 8.5）
   1. 通过溶解适量的三甲基（羟基）氨基甲烷，在超纯H₂O中达到所需的离子强度（100mM），准备萃取缓冲。
   2. 通过 HCl 解决方案将溶液的 pH 值调整为 pH 8.5，用 pH 仪监控 pH 值的变化。
2. 准备饲料样品
   注:所使用的饲料样本是根据大西洋鲑鱼的商业饲料配制的，主要含有植物性成分的蛋白质来源（即大约5%的鱼蛋白、10%的鱼油、68%的植物性蛋白质和12%的植物性油）。硫酸锌被补充到饲料中。
   1. 用泥浆和砂浆手工研磨饲料样品。
   2. 筛入饲料样品，以确保提取以具有类似颗粒大小（从 850 μm 到 1.12 mm）的源分数进行。
   3. 继续执行 Zn 提取。
3. 从饲料样品中提取锌
   1. 将大约 0.5 克饲料在三重体中重达 15 mL 圆锥形管。
   2. 在样品中加入提取缓冲器（5 mL 100 m M Tris-HCl，pH 8.5）。
   3. 在 4 °C 下以 24 小时在旋转器中提取样品（20 转/分）。
   4. 通过离心将可溶性和非可溶性分数分离 10 分钟，速率为 3000 x g。
   5. 使用 0.45 μm 一次性注射器过滤器过滤可溶性分数。
   6. 将过滤过的样品转移到清洁管中。
   7. 使用 SEC-ICP-MS 在可溶性分数中执行 Zn 规格分析，如第 1.6 步所述。
      注: 图2中描述了从饲料样本中提取Zn的过程摘要。
4. 移动相解决方案 （50 m M Tris-HCl = 3% MeOH， pH 7.5）
   1. 准备移动相溶液溶解 6.057 g 三轮车（羟基甲基）氨基甲烷在 1 L 的 3% MeOH 溶液 （v/v）.。
   2. 通过 HCl 解决方案将溶液的 pH 值调整为 pH 值至 7.5，用 pH 仪监控 pH 值的变化。
   3. 通过 0.45 μm 膜过滤器过滤移动相解决方案。
5. SEC列分离范围的分子重量校准
   1. 通过进行分子量校准来校准分离范围。
      注:在本研究中使用了胸腺蛋白（660 kDa）、Zn/Cu超氧化物脱酶（32 kDa）、肌红蛋白（17 kDa）和维生素B12（1.36 kDa）。
   2. 准备每个标准，已知浓度在超纯H₂O。
   3. 通过在小瓶中加入 250 微升标准，准备高性能液相色谱 （HPLC） 小瓶。
   4. 将符合标准的瓶加载到样品的序列运行中。
   5. 在分析序列的开始和结束时运行分子量校准，监测 ¹²⁷I （甲状腺蛋白 ^）、66Zn（Zn/Cu 超氧化物脱酶 ^）、57Fe（肌红蛋白）和 ⁵⁹Co （维生素 B12）。
      注:分子重量校准与Zn规格分析同时进行。
6. 使用 SEC-ICP-MS 进行锌规格分析
   注:SEC-ICP-MS方法的Zn规格分析是根据其他地方描述的原则开发的^{，对大西洋}鲑鱼饲料⁷的分析进行了进一步优化。
   1. 使用尺寸排除色谱 （SEC） 列和 HPLC 以及电感耦合等离子体质谱 （ICP-MS） 对可溶性分数进行 Zn 光谱分析。
   2. 通过在小瓶中加入 250 μL 的可溶性分数来准备 HPLC 小瓶。
   3. 在分析之前，用0.5微升的维生素B12将所有样品都加入到尖峰。此步骤允许更正保留时间班次，监控 ⁵⁹Co.
   4. 用提取缓冲器（100 m M Tris-HCl，pH 8.5）稀释可溶性分数，并调整到1 mL的最终体积。
   5. 按随机顺序准备样品的序列运行。
   6. 根据制造商的说明调整 ICP-MS。
   7. 按照 HPLC 和 ICP-MS 执行 Zn 规格分析的仪器设置（参见表 1）。

2. 大西洋鲑鱼饲料中补充 Zn 的体外溶血性

注:所使用的饲料样本是根据大西洋鲑鱼的商业饲料配制的，主要含有植物性成分的蛋白质来源（即大约5%的鱼粉、10%的鱼油、68%的植物性成分和12%的植物油）。

1. 使用刀磨机将大西洋鲑鱼饲料样品研磨 10 秒，储存在 4 °C，直到进一步分析。
2. 重量 +0.2 g 的饲料样品地面在步骤 2.1 和添加 Zn 无线电跟踪器^（65Zn） 已知的特定活动在 5 mL 体积样品管 （带盖） 。
   警告:此程序必须在放射性核素套件内执行。执行此步骤的人应接受培训并认证以处理无线电同位素。必须严格执行研究所辐射安全管理部门建议的安全防范措施。
3. 然后准备淡水肠道发光缓冲液如下所述。
   1. 对于盐溶液A，重11.65克纳诺3，0.55克KNO₃和0.4克MGSO_4。溶解超纯 H₂O 中的盐，并调整到 60 mL 的最终体积。
   2. 对于盐溶液 B，重量 0.31 克 Ca （NO₃）₂+₄H₂O. 溶解超纯 H₂O 中的盐，并调整到 10 mL 的最终体积。
   3. 使用 500 mM HEPES 库存溶液作为盐溶液 C。
   4. 对于盐溶液 D，重量 1.2 克 MgCl_2，将盐溶解在超纯 H₂O 中，并调整到 20 mL 的最终体积。
   5. 对于盐溶液 E，重 0.9 克 MgSO_4，将盐溶解在超纯 H₂O 中，并调整到 20 mL 的最终体积。
   6. 通过在 10 mL 超纯 H₂O 中溶解 0.55 克 CH₃COCOONa 来准备回旋液。
   7. 溶解 0.9 克甘油（C₆H₁₂O₆） 超纯 H₂O.
   8. 使用磁搅拌器溶解良好，通过自动包装对盐溶液 A、B、D 和 E 进行消毒，并通过 200 μm 注射器过滤器过滤溶液 C、丙酮酸盐和甘蔗糖。
   9. 在准备不同的库存解决方案后，准备 100 mL 的缓冲工作解决方案，将上述准备的解决方案按以下比例混合:6.8 mL 的盐溶液 A、4.14 mL 的 B、5 mL 的 C、2.5 mL 的 D、1.5 mL 的 E 和 1.14 mL 的回旋酸和高糖。使用电离水将体积压缩到 100 mL。
      注:上述缓冲器将代表淡水鲑鱼中发现的肠道流明的离子组成。
4. 准备第 2.6 步中描述的缓冲器的其他六个碱性，并添加以下氨基酸之一（半胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸），以达到 5 mM 的最终摩尔浓度。
5. 将淡水肠道发光缓冲器（反应体积 = 3 mL;pH 7.4）添加到饲料样本中。
6. 重复步骤 2.5 与 2.4 中描述的缓冲器（在 5 mM 浓度下存在不同的氨基酸）。
7. 关闭管子，让它们在旋转微调器中旋转 30 分钟，时间为 25 转。
8. 通过离心将可溶性和非可溶性分数分离 10 分钟，速率为 1157 x g。
9. 使用伽玛出纳器测量可溶性和非可溶性分数中每分钟 ⁶⁵Zn 的计数。
10. 计算可溶性和非可溶性分数中 Zn^（65Zn） 的无线电同位素比例。

3. 使用体外肠道模型（RTgutGC）评估Zn化学物种的吸收量

1. RTgutGC细胞培养
   注:此步骤中使用的所有工作材料应无菌。
   1. 在 20 °C 的水浴中轻轻地恢复冷冻的 RTgutGC 细胞。
   2. 轻轻地移出含有细胞的溶液，并将其悬挂在含有10%胎儿牛血清（FBS）的L10ml L介质中。
      注:10% FBS 仅用于恢复冷冻细胞。对于后续通道，FBS 的使用速度为 5%。FBS 的成分可能因批次而异，因此建议从单批中尽可能多地购买和库存，以避免血清成分的批次间变化。
   3. 将细胞悬浮物添加到 75 厘米² 细胞培养烧瓶中，并在正常大气下设定为 19 °C 的孵化器中孵育。
   4. 检查细胞，当汇合（80%的汇合，通过检查显微镜下细胞表面的密度，将细胞分裂成新的烧瓶（随后通过）或收获用于实验进行视觉评估。
      注:RTgutGC细胞1小时和1周后播种到细胞培养瓶的例子显示在图3。
2. 细胞收获和准备暴露实验
   1. 用1mL乙酰胺四酸（EDTA）溶液清洗细胞两次。每次洗涤后，使用无菌吸管吸出 EDTA 溶液。
   2. 用试丁香（0.7 mL的试丁香，在磷酸盐缓冲盐水[PBS]中0.25%）治疗细胞。
   3. 以锐角轻轻旋转烧瓶，沿着烧瓶表面展开试丁骨。
   4. 继续旋转2分钟，而细胞分离。
   5. 轻轻旋转2分钟后，加入10mL的L15/FBS介质，以中和试林。
   6. 使用无菌移液器和离心机将产生的细胞悬浮物排入锥形底部离心机管中，在 130 x g下 3 分钟。
   7. 使用血细胞计手动计数确定收获细胞的密度。
   8. 添加L15/FBS介质所需的体积，以达到5×10⁴ 细胞/mL的细胞密度。
   9. 将细胞播种到24井板上，每口井输送1兆升的细胞悬浮液，以达到5×10⁴ 细胞/井的最终细胞密度。
      注意:最好使用多点胶移液器，以最大限度地减少变化和减少时间。
   10. 在实验前，将种子板在正常大气下19°C的孵化器中放置48小时。
       注:在 -20 °C 下存储尝试素;EDTA 解决方案和 L15/FBS 介质在 4 °C 下。 使用前将所有工作解决方案和介质的温度调整至 19 °C。
3. 准备曝光媒体
   注:此步骤必须在无菌和无菌条件下的烟雾罩下完成。
   1. 通过混合 6.8 mL 的盐溶液 A（步骤 2.3.1）、B 的 1.14 mL（步骤 2.3.2）、5 mL 来准备 L15/ex C （步骤 2.3.3） 和 1.14 mL 每个陀螺酸盐 （步骤 2.3.6） 和乳糖 （步骤 2.3.7） 。使用无菌细胞培养级蒸馏水将体积达到 100 mL。
   2. 混合 6.8 mL 的盐溶液 A （2.3.1）、 4.14 mL B （2.3.2）、C 5 mL （2.3.3）、2.5 mL 的混合，准备 FW D （2.3.4）， 1.5 mL E （2.3.5） 和 1.14 mL 每个陀螺酸盐 （2.3.6） 和乳糖 （2.3.7）.使用无菌细胞培养级蒸馏水将体积达到 100 mL。
   3. 使用ICP-MS（如其他地方^12）所述，量化暴露介质中离子的浓度。
      注:在媒体准备中分析的离子浓度在 表2中显示。
4. 锌^（65Zn） 流入检测
   1. 将 RTgutGC 细胞播种到 24 井板（5 x 10⁴ 细胞/井）上，在完整的 L15/FBS 介质中。
   2. 在 19 °C 的正常大气中孵育 48 小时。
   3. 调整所有实验介质制剂 pH 7.4 使用 0.5 M NaOH 在在在场或没有 L-甲氨酸 （L-Met） 或 DL-甲氨氨酸 （DL-Met） 在 2 mM 浓度。
      注:在步骤 3.4.5 中描述的缓冲器的 pH 值调整需要在治疗细胞之前进行新鲜完成。
   4. 孵化期结束后，从井中取出介质，用PBS彻底冲洗。
   5. 添加pH调整的FW实验介质，并允许适应20分钟。
   6. 将 RTgutGC 细胞暴露在 3.07、6.14、12.27 和 24.55 μM ⁶⁵Zn（如 ZnCl_{2; +4}kBq/mL）的名义浓度中，在步骤 3.4.3 中描述。
   7. 紧接着，将细胞保持在19°C的孵化器中15分钟。
   8. 15分钟孵化结束后，吸气培养超强，从井中取出。
   9. 用冰冷 FW 介质冲洗细胞（使用 200 μM Zn， pH 7.4）， 然后通过添加 5 mM 乙二醇 （β - 甲基乙醚） - N， N '， N '， N '- 四乙酸 （EGTA） 缓冲 （pH 7.4） 5 分钟， 以摆脱任何吸附 ⁶⁵Zn （II）.
   10. 暴露细胞到上述介质制剂的存在或没有10 mM 2氨基环素 [2.2.1] 六烷-2-碳酸 （BCH）， 氨基酸运输抑制剂.
   11. 暴露期为 15 分钟后，重复步骤 3.4.8 和 3.4.9。
   12. RtgutGC 细胞将作为单层粘附在井底。使用 0.2% 热钠硫酸钠 （SDS） 洗涤剂 （100 μL/井） 消化细胞。
       注意:SDS 解决方案需要在使用前将水浴放置在 1 小时至 90 °C 的浴缸中。
   13. 吸气并恢复细胞消化成1.5mL管。
   14. 使用伽马计数器测量细胞消化的放射性。
       注:每分钟（cpm）计数需要纠正放射性衰变，背景活动，并遵循格洛弗和霍格斯特兰德¹³描述的公式进行特定的活动计算。
   15. 要量化细胞的蛋白质浓度，用 500 微升 0.5 M NaOH 使细胞同质化。
   16. 使用布拉德福德检测试剂盒测量细胞样本中的蛋白质浓度，以牛血清白蛋白 （BSA） 为标准。
       注:一旦蛋白质浓度被量化，RTgutGC细胞的Zn吸收率可以表示为pmoles Zn最小^-1 毫克^-1 蛋白质。

4. 大西洋鲑鱼（萨尔莫萨拉尔）中膳食Zn的明显可用性

注:大西洋鲑鱼饲料是根据商业饲料配制的，主要含有植物性成分的蛋白质来源（即大约5%的鱼蛋白、10%的鱼油、68%的植物蛋白和12%的植物油）。两个饲料辅以无机源（Zn硫酸盐）或有机来源（Zn甘氨酸合物），以达到150毫克/千克的Zn浓度饲料。此外，Yttrium 氧化物（饲料等级）以 0.01% 作为惰性标记添加到饲料中，以便计算明显的可用性系数。

1. 将大西洋鲑鱼（盐碱菌株，1岁以上，混血儿）在各自的水箱中适应，直到鱼适应实验条件。
2. 通过监测大西洋鲑鱼的每日饲料摄入量来评估其适应程度。
   注:这次试验是在三合一坦克中进行的，因此总共使用了六辆坦克。在喂养试验期间，水温为11.9±0.3°C，溶解氧饱和度为101±5%。
3. 用实验饲料喂鱼11天。
4. 过量使用每升水中6兆升三甲烷硫酸盐溶液，对鱼实施安乐死。
5. 从同一水箱中收集鱼的粪便样本，从腹鳍条纹到肛门，放入盘子中。
6. 将粪便从盘子中取出，用铲子放入 50 mL 圆锥管中，并立即将样品储存在 -20 °C 下。
   注:样品保持在-20°C，直到进一步分析。
7. 在 -80 °C 下将粪便样本冷冻干燥 72 小时。
8. 手动均匀的粪便样本成细粉使用害虫和砂浆。
9. 使用 ICP-MS（如其他地方⁹所述），确定 Zn 和 Yttrium 在饲料和粪便样本中的浓度。
10. 使用以下公式确定明显可用性系数 （AAC，%）:
    

结果

使用 SEC-ICP-MS 方法评估大西洋鲑鱼饲料可溶性部分中的 Zn 化学物种
SEC-ICP-MS 方法提供了有关大西洋鲑鱼饲料可溶性部分中发现的 Zn 化学物种的数据。 图4 说明了在可溶性分数中发现的Zn的色谱轮廓。此色谱图是使用 SEC-ICP-MS 方法获得的。在大西洋鲑鱼饲料的可溶性部分发现了五个含有山峰的Zn。每个峰值的分子量都不同:峰一（+ 600 kDa），峰二和峰三（从32至17千达），高峰四（从17至1.36千达）和高峰五（>1.36千达）。高峰四是最丰富的，其次是高峰二，三，五和一，分别。在可溶性部分发现的Zn化学物种可能有不同的来源，因为使用的饲料含有海洋基和植物基成分，以及补充形式（即Zn硫酸盐）。Zn化学物种的分子量范围表明，这些化合物可能是金属蛋白。

大西洋鲑鱼饲料中补充 Zn 的体外溶血性
补充⁶⁵Zn的溶质在氨基酸的存在中增加。所有经过测试的氨基酸都提高了补充^的65Zn. 甲氨酸、甘氨酸、西斯坦、血氨酸和赖氨酸的溶解性提高了⁶⁵Zn溶解性:较高的溶解性被发现与组织丁和赖氨酸（图5）。

使用体外肠道模型 （RTgutGC） 评估 Zn 物种吸收
RTgutGC 细胞中的阿皮锌吸收受到 L-Met 或 DL-Met 在 2 mM 浓度下存在的显著影响。此外，与未用BCH治疗的细胞相比，甲氨基氨基素对RTgutGC细胞Zn吸收的影响受到BCH（氨基酸输送系统阻滞剂）的存在的负面影响。

大西洋鲑鱼（萨尔莫萨拉尔）中膳食Zn的明显可用性
在大西洋鲑鱼的实际饲料中，当补充无机来源（Zn硫酸盐）或有机来源（Zn甘油合物）时，明显的Zn可用性是相同的。在大西洋鲑鱼中，Zn（n = 3）的明显可用性的估计值是31%±12%补充无机来源（Zn硫酸盐）时为31%±3%在补充有机来源（Zn chelate甘油）时为31%。

图1:使用补充方法评估矿物供应的系统方法摘要。该方法用于研究大西洋鲑鱼的锌可用性，包括Zn规格、肠道环境中的Zn溶质、肠道细胞吸收的Zn和Zn明显可用性。请单击此处查看此图的较大版本。

图2:从饲料样本中提取Zn程序的摘要。 锌是使用温和的萃取条件从饲料样品中提取的。提取后进行 Zn 规格分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:在细胞培养瓶中播种后，RTgutGC细胞1小时（左）和1周（右）的示例。请点击这里查看此图的较大版本。

图4:一张色谱图，显示大西洋鲑鱼饲料可溶性部分的含Zn峰值，并由SEC-ICP-MS分析。这三个复制的特点是蓝色，红色和黑色线。分子重量校准使用胸腺素（660 kDa，监测127I），Zn/Cu超氧化物脱酶（32 kDa，监测⁶⁶Zn），肌红蛋白（17kDa，监测^57Fe），维生素B12（1.36千达，监测^59Co）:峰值 1 （P1）: +600 kDa， 保留时间 （RT） 8.2 分钟;峰值 2+3 （P2+3）: 从 32 到 17 kDa， RT 14.2 = 15.3 分钟;峰值 4 （P4）: 从 17 到 1.36 kDa， RT 16.3 分钟;峰值 5 （P5）: > 1.36 kDa， Rt 23.2 分钟。请点击这里查看此图的较大版本。

图5:氨基酸对大西洋鲑鱼饲料中补充Zn体外溶液性的影响。 数据以平均± SD （n = 3） 表示。数据通过单向 ANOVA 进行分析，然后通过 Dunnet 的多次比较测试，将每个 AA 组的平均值与对照组 （No AA） 的平均值进行比较。星号表示 ANOVA（P 值< 0.05 （*）、< 0.01 （**）、< 0.001 （***） 和 < 0.0001 （***） 的重要性级别。 请单击此处查看此图的较大版本。

图6:甲氨基氨酸和氨基酸输送抑制剂（2-氨基比环素[2.2.1]乙烷-2-碳酸，BCH，10mM）的影响。数据以平均± SD （n = 3） 表示。数据通过双向 ANOVA 进行分析，随后 Tukey 的多次比较测试与 p < 0.05 级别的重要性进行了分析。各组之间的事后差异表示为酒吧上方的超标字母:具有不同超标的酒吧在统计学上是不同的 （p < 0.05） 。 请单击此处查看此图的较大版本。

HPLC 设置
列	证券交易委员会列 （30 厘米 x 7.8 毫米，5 μm 颗粒大小） = 护栏（7 μm 颗粒大小）
校准范围	1.0 × 104 - 5.0 × 105 Da
移动阶段	50 m Tris - hcl = 3% Meoh （ph 7.5）
流量	0.7 mL 最小+1
注射量	50 微升
ICP-MS 设置
转发功率	1550 W
等离子气体流	15.0 L 最小+1
载波气体流	0.86 L 最小+1
化妆气体流	0.34 L 最小+1
居住时间	每同位素 0.1 s
监测的同位素	127I， 66Zn， 59公司， 57费

表1。HPLC 和 ICP-MS 仪器设置概述。

化学成分 （mM）	L15/前	实验介质（L15/FW）
硝酸钠	155	155
硝酸钾	6.2	6.2
硫酸镁	3.8	19.5
硝酸钙	1.5	5.4
赫佩斯	5	5
氯化镁	-	15
皮鲁瓦酸钠	5.7	5.7
半乳糖	5.7	5.7
酸碱度	7.1	7.4
离子强度	178	258
离子组成 （mM）
钙， Ca2 +	1.6 ± 0.1	5.3 ± 0.2
镁， Mg2+ *	3.9 ± 0.3	32.5 ± 0.7
钾， K=	8.2 ± 1.2	8.6 ± 1.1
钠， Na=	160 ± 3	157 ± 2
硝酸盐， No3- **	164	172.4
硫酸盐， 所以4- **	3.8	18.7
氯化物， Cl- **	1.5	31.5

表2。测试实验介质的化学和离子组成。

讨论

Zn的肠道吸收似乎受到Zn物种¹³的化学形式的影响。在这方面，使用本文中描述的协议，可以依次研究大西洋鲑鱼Zn"可用性"背后的化学和生物方面。

本研究报告了Zn规格分析方法的使用。SEC-ICP-MS方法提供了有关大西洋鲑鱼饲料可溶性部分的Zn化学物种分子量的定性数据。这是通过比较分子量校准标准（即甲状腺蛋白（660 kDa）、Zn/Cu超氧化物脱酶（32 kDa）、肌红蛋白（17 kDa）和维生素B12（1.36 kDa）的保留时间与Zn含峰值的保留时间来实现的。Zn 规格分析中发现的一个挑战是，由于缺乏分析标准，无法识别未知的 Zn 化学物种。在 SEC 中，分子的分离基于其大小相对于静止阶段的毛孔。原则上，较大的分子会跑得更快，先去拉，小分子会跑得慢^，14号以后会变小。因此，每个Zn含有峰值可能含有几个具有相似分子量¹⁵的化合物。这也助长了识别未知Zn化学物种的挑战。此外，还测试了几个温和的萃取条件，以提取Zn。提取的 Zn 较低（+10%）。轻度萃取条件被应用，以保持Zn化学物种完好无损，但这可能已经损害了提取效率^7。

在体外溶解性测定中，补充Zn（作为放射性同位素 ⁶⁵ZnCl_2）的溶解度表明氨基酸，特别是异丁和赖氨酸，增加了Zn的溶解性（图5）。在模拟胃肠道条件下直接使用饲料样本进行体外溶解性检测是基于Zn光谱变化取决于pH值¹⁶的知识。然而，在胃肠道开始时的酸性条件，可能会导致一些不可逆转的规格变化（例如，ZnO->ZnCl_2，在胃酸性条件下存在HCl）。然而，这里使用的Zn源是ZnSO_4， 其溶质性通过介质中的氨基酸得到改善。下一个要回答的问题是，增加的溶解度能否转化为可用性？RTgutGC肠道细胞系用于研究这个问题。在动物的矿物营养方面，"可用性"一词很难定义，与动物（体内）相比，可以在细胞（体外）中进行差异调节。因此，在使用肠道细胞系进行体外评估时，使用了"吸收"一词。细胞系提供了关于肠道上皮的Zn吸收机制的有用信息，这是控制动物矿物供应的复杂监管过程的一部分。RTgutGC细胞在氨基酸（即甲氨基氨酸）的存在下，为Zn的吸收培养了更好的能力; 图6）。然而，大西洋鲑鱼的无机和有机Zn来源之间在体内的明显可用性没有显著差异。在活体可用性研究中，Zn源比较是在饮食Zn水平远远超过已知的Zn要求大西洋鲑鱼^17，总Zn浓度150毫克/公斤饲料。当测试的饮食水平在动物达到饱和之前处于线性动态范围内时，可用性的差异会更好地可视化。在目前的体内研究中，大西洋鲑鱼可能饱和，以观察到所用来源之间Zn吸收的差异。

总之，第一种方法提供了关于大西洋鲑鱼饲料可溶性部分中发现的不同Zn化学物种的定性信息:第二种方法，在氨基酸配体的存在下，补充Zn的体外溶血性得到改善:第三种方法证实，氨基酸改善溶血性可改善肠道上皮的吸收:相反，第四种方法未能发现Zn从无机或有机来源到大西洋鲑鱼的可用性差异。最后，虽然与体内发现不一致，但体外协议确实为理解 Zn 可用性的不同组件提供了有趣的见解。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm syringe filter	Sartorius
0.45 μm membrane filter	Pall
10 % fetal bovine serum	Eurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter	LKB Wallac
24 well plates (Falcon, TPP microplates)	Thermo Fisher Scientific	10048760
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid	Sigma Aldrich	A7902
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks)	TPP Techno Plastic Products AG	90075
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
Bradford assay kit	Bio-Rad	5000001
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5702
L-Cysteine	Sigma Aldrich	30089
DL-methionine	Alfa Aesar	59-51-8
D-methionine	Sigma Aldrich	M9375
Experimental fish feeds	Skretting
Glycine	Sigma Aldrich	410225
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size)	Tosoh
L-Histidine	Sigma Aldrich	53319
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS	Agilent Technologies
Hydrochloric acid	Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck	1.00317
Knife mill	GM 300, Retsch Gmbh
L-15 medium	Invitrogen/Gibco	21083027
L-methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Lysine	Sigma Aldrich	23128
Methanol	LiChrosolv, HPLC grade, Merck	1.06035
Milli-Q water (18.2 MΩ cm)	EMD Millipore Corporation
Myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
NexION 350D ICP-MS	Perkin Elmer
Pasteur pipette	VWR
pH meter	inoLab
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	806552
RTgutGC cells			Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland
SEC column, TSKgel G3000SWxl	Tosoh
Sieve stainless steel (850?μm - 1.12?mm)	Retsch
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma Aldrich	436143
Superoxide dismutase	Sigma Aldrich	S7571
Thyroglobulin	Sigma Aldrich	T1001
Tricaine methanesulphonate	PharmaQ
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma Aldrich	252859
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline	Biowest	L0910
Versene EDTA solution	Invitrogen/Gibco	15040-033
Vitamin B12	Sigma Aldrich	V2876
Zinc chelate of glycine	Phytobiotics
Zinc sulphate	Vilomix