Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de Stat3

Resumen

Este protocolo describe un método canónico para entender los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo. Este método utiliza un modelo de ratón transgénico y algunas técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético.

Resumen

Los modelos transgénicos del ratón son potentes para entender los genes críticos que controlan la diferenciación y la actividad del osteoclast, y para estudiar mecanismos y tratamientos farmacéuticos de la osteoporosis. Los ratones de catepsina K (Ctsk)-Cre han sido ampliamente utilizados para estudios funcionales de osteoclastos. El transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) es relevante en la homeostasis ósea, pero su papel en los osteoclastos in vivo sigue estando mal definido. Para proporcionar la evidencia in vivo de que STAT3 participa en la diferenciación de osteoclastos y el metabolismo óseo, se generó un modelo de ratón de deleción Stat3 osteoclasta específico(Stat3 ^{fl / fl;} Ctsk-Cre) y analizó su fenotipo esquelético. La exploración de Micro-CT y la reconstrucción 3D implicaron la masa creciente del hueso en los ratones condicionales del golpe de gracia. La coloración de H&E, la coloración doble roja de la caleína y del alizarin, y la coloración ácida tartrato-resistente de la fosfatasa (TRAMPA) fueron realizadas para detectar metabolismo del hueso. En definitiva, este protocolo describe algunos métodos y técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético y estudiar los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo.

Introducción

El hueso esquelético es el principal órgano de carga del cuerpo humano y está bajo la presión del entorno interno y externo durante la marcha y el ejercicio¹. A lo largo de la vida, los huesos pasan continuamente por la auto-renovación, que es equilibrada por osteoblastos y osteoclastos. El proceso de los osteoclastos que limpian los huesos viejos y los osteoblastos que forman el hueso nuevo mantiene la homeostasis y la función mecánica del sistema esquelético^2. La alteración en el equilibrio puede inducir enfermedades metabólicas óseas, como la osteoporosis. La osteoporosis, que es causada por el exceso de actividad osteoclástica, es prevalente a nivel mundial y causa pérdidas económicas sustanciales a la sociedad^2,3,4. De acuerdo con el número limitado de fármacos disponibles para el tratamiento de la osteoporosis y su riesgo de efectos adversos^4,es importante desvelar los detalles de la formación y actividad de los osteoclastos.

Los osteoclastos derivados del linaje hematopoyético monocitos/macrófagos tienen múltiples núcleos (pueden tener de 2 a 50 núcleos) y son grandes (generalmente mayores de 100 μm de diámetro)^2. Aunque la exploración de mecanismos y la investigación de las drogas para los desordenes osteoclastic se hayan mejorado extensamente vía cultura osteoclasta in vitro, las reacciones orgánicas complicadas hacen in vivo la evidencia indispensable para la terapia apuntada. Debido a las similitudes genéticas y fisiopatológicas entre ratones y humanos, los modelos de ratón genéticamente modificados se utilizan comúnmente para estudiar los mecanismos y los tratamientos farmacéuticos de las enfermedades humanas in vivo⁶. El sistema Cre-loxP es una tecnología ampliamente utilizada para la edición de genes de ratón y ha permitido a los investigadores investigar las funciones de los genes de una manera específica de tejidos/células⁵. La catepsina K (CSTK) es una cisteína proteasa secretada por osteoclastos que puede degradar el colágeno^{óseo 8.} Está bien aceptado que CTSK se expresa selectivamente en osteoclastos maduros; por lo tanto, los ratones Ctsk-Cre son considerados como una herramienta útil para estudios funcionales de osteoclastos y se ha utilizado^6.

La familia del transductor de señales y activador de la transcripción (STAT) es clásica y altamente significativa en la inmunidad y en la progresión y desarrollo del cáncer^7,8. Entre siete ESTAT, STAT3 se divulga para ser el más relevante al homeostasis del hueso^9,10. Varios estudios in vivo han reportado que la inactivación específica de STAT3 en osteoblastos disminuye la formación^{ósea 9,10.} Sin embargo, la evidencia sólida con respecto a la participación de STAT3 en la formación de osteoclastos y el metabolismo óseo in vivo todavía es limitada. Recientemente, proporcionamos evidencia in vivo con un modelo de ratón de deleción Stat3 osteoclasta específico(Stat3^{fl / fl;} Ctsk-Cre, en adelante llamado Stat3^Ctsk) que STAT3 participa en la diferenciación osteoclasta y metabolismo óseo¹¹. En el presente estudio, describimos los métodos y protocolos que utilizamos para analizar los cambios en la masa ósea, la histomorfología ósea y el anabolismo óseo y el catabolismo de los ratones Stat3^Ctsk con el fin de estudiar la influencia de la deleción osteoclasta-específica de STAT3 en la homeostasis ósea.

Protocolo

Todos los métodos relacionados con los animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai.

1. Cría de ratones de deleción Stat3 específicos de osteoclasto

NOTA: Stat3^{fl /fl} ratones se obtuvieron comercialmente. Los ratones Ctsk-Cre fueron proporcionados por S. Kato (Universidad de Tokio, Tokio, Japón^12). Los ratones fueron criados y mantenidos bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en la instalación animal institucional bajo condiciones estandarizadas.

1. Emparejar un ratón macho sexualmente maduro con dos ratones hembra de la misma edad. Después de 18 días, revise los controles diarios de recién nacidos. Separe las hembras preñadas y manténgala sola si es necesario. Cambie los ratones machos entre diferentes jaulas de cría si los ratones hembra no estaban preñados dentro de 1 mes del emparejamiento.
2. Cruza ratones^fl/fl Stat3a ratones Ctsk-Cre (F0). Recorte las colas para el genotipado y mantenga el macho Stat3^{fl /+}; Ratones Ctsk-Cre hasta que son sexualmente maduros, que es alrededor de 6 semanas de edad (F1). Utilice los siguientes cebadores: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
3. Cruz 6-semana de edad macho Stat3^{fl /+}; Ratones Ctsk-Cre con hembras de ratones Stat3^fl/fl. Recorte las colas para el genotipado y mantenga el macho Stat3 ^{fl / fl}; Ratones Ctsk-Cre hasta que son sexualmente maduros, que es alrededor de 6 semanas de edad (F2).
4. Cruz 6-semana de edad macho Stat3 ^fl/fl; Ratones Ctsk-Cre con ratones hembras Stat3^fl/fl (F3). Recorte las colas para el genotipado y reemplace los ratones reproductores viejos con ratones más jóvenes a tiempo (F3 + N).

2. Recolección de especímenes

1. Eutanasia seis pares de ratones machos de 8 semanas de edad Stat3^fl/fl y Stat3^Ctsk littermate por separado con asfixia de dióxido de carbono.
   NOTA: El caudal de CO₂ desplaza el 30% del volumen de la jaula por minuto (por ejemplo, para una jaula de 45 cm x 30 cm x 30 cm, la tasa de flujo de CO₂ es de 40 L/min).
2. Coloque los ratones en decúbito supino. Dislocar las articulaciones bilaterales de la cadera suavemente con la mano. Use tijeras oftálmicas para cortar la piel verticalmente de la tibia distal y luego diseccione toda la piel de la extremidad posterior.
3. Corte el ligamento articular de la articulación de la cadera derecha y la articulación de la rodilla con tijeras para separar la extremidad posterior. Corte el trocánter y la unión del peroné y luego sumerja el miembro posterior en paraformadehído al 4%. Mantenga las extremidades posteriores derechas para el paso 3. Corte adecuadamente el hueso en ambos extremos para sumergir completamente y fijar la médula ósea con paraformadehído al 4%.
4. Corte el ligamento articular de la articulación izquierda de la cadera y la articulación de la rodilla con tijeras, retire suavemente el tejido blando y separe cuidadosamente la tibia y el fémur. Sumergir la tibia y el fémur por separado en etanol al 75%. Mantenga los fémures para el paso 4 y las tibias para el paso 6. Asegúrese de mantener el trocánter intacto.

3. Preparación de la sección de parafina

1. Fijar el miembro posterior derecho en paraformadehído al 4% a 4 °C durante 48 h.
2. Descalcificar: Lavar suavemente las muestras con 1x PBS durante 10 min 3 veces. Descalcificar las muestras en EDTA al 15% (150 g EDTA en 800 mL de ddH₂O y 100 mL de PBS 10x) con un descalcificador ultrasónico durante 3 a 4 semanas hasta que los huesos puedan ser doblados. Reemplácelo con líquido descalcificante fresco cada dos días.
3. Lave suavemente las muestras 3x con 1x PBS y luego sumérjalas en etanol al 75% a 4 °C durante la noche.
4. Deshidratar: En el segundo día, sumergir secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno, cada una durante 1 h dos veces.
5. Sumergir los especímenes en 1/2 xileno 1/2 parafina durante 30 min. Sumergir los ejemplares en parafina a 65 °C durante la noche.
6. Incrustar: Seleccione un tanque de incrustación adecuado para la incrustación. Coloque la tibia uniformemente debajo. Coloque el fémur y la tibia en un ángulo de 90°. Después de que la parafina se haya enfriado y solidificado por completo, retírela del tanque de incrustación. Numerar los especímenes y almacenarlos a -20 °C durante la noche.
7. Cortar secciones de 5 μm de espesor continuamente usando el microtomo. Corte de 20 a 40 secciones. Extienda las secciones en agua de 37 °C, adhiérelas a los portaobjetos del microscopio y hornee a 42 °C durante la noche.

4. Exploración y análisis de micro-TC

1. Escanee los fémures izquierdos con un escáner micro-CT. Resolución: 10 μm; Voltaje: 70 kV; Corriente: 114 μA; Fliter: 0.5 mm Al; Paso de rotación: 0.5°.
2. Reconstruya imágenes 3D del hueso cortical y del hueso trabecular utilizando el software de soporte del escáner siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ROIs están en un ancho total de 1 mm de hueso trabecular cerca de la placa de crecimiento distal y en una sección total de 1 mm de ancho de hueso cortical en el centro de los fémures.
3. Calcule los parámetros cuantitativos de la microarquitectura: densidad mineral ósea (DMO), fracción de volumen óseo (BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th.), número trabecular (Tb.N.), separación trabecular (Tb.Sp.) y grosor óseo cortical (Ct.Th.).

5. Tinción trap

1. Hornear las secciones de parafina a 65 °C durante 30 min.
2. Dewax: Sumergir las secciones en xileno durante 10 min. Realice este paso 3x con xileno fresco.
3. Rehidratar: Sumergir las secciones secuencialmente en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y ddH₂O, cada una durante 5 min dos veces.
4. Prepare la solución de tinción utilizando el kit de tinción TRAP siguiendo las instrucciones del fabricante y caliente a 37 °C.
   NOTA: La solución de tinción trap debe prepararse recientemente inmediatamente antes de cada ensayo.
5. Añadir una solución de tinción de 50–100 μL a cada muestra e incubar en una cámara húmeda de 37 °C durante 20–30 min. Compruebe el estado de tinción de los osteoclastos bajo un microscopio de luz cada 5 minutos hasta que se puedan ver osteoclastos multinucleados rojos. Finalizar la reacción con ddH₂O.
6. Contratendía en solución de hematoxilina durante 30 s. Crear un color azul estable por inmersión en 1% solución de amoníaco durante 1 min. Enjuague en agua del grifo que corre lentamente.
7. Monte las secciones con cubrebocas usando bálsamo neutro y seco durante la noche.
8. Captura de 3 a 5 campos de interés mediante un microscopio. Analice el perímetro trabecular por la Imagen J: mida la longitud de la barra de escala (Ls) usando la herramienta 'línea recta' como L1, luego mida la longitud del perímetro trabecular usando la herramienta 'línea segmentada' como L2, la longitud física (Lp)= Ls*L2 /L1). Cuente el número de células TRAP-positivas con más de tres núcleos.

6. Calein y alizarin rojo doble etiquetado

1. Preparación de la muestra: Inyecte por vía intraperitoneal 20 mg/kg de caleína (1 mg/mL en solución de NaHCO_{3 al 2%)} el día 0, y 25 mg/kg de alizarina roja S (AL, 2 mg/mL en H₂O) el día 4. Sacrificar ratones el día 7. Desasocie cuidadosamente las tibias y fije en paraformadehído al 4% a 4 °C durante 48 h.
2. Deshidratar: Después de la fijación, lavar suavemente las tibias 3x con 1x PBS. Sumergir secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno durante 5 min dos veces por separado.
3. Sumergir las muestras en acetona durante 12 h, en 1/2 acetona 1/2 resina durante 2 h, y en resina pura en un horno de secado durante la noche.
   NOTA: La resina fue preparada por resina disponible comercialmente (por ejemplo, Embed 812 Resin) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Incrustar: Agregue resina pura en un tanque de incrustación de gel de sílice adecuado y coloque las muestras suavemente para evitar burbujas. Polimerizar la resina en un horno de secado a 60 °C durante 48 h.
5. Corte las muestras en secciones de 5 μm de espesor continuamente con un microtomo rotatorio. Guarde el resto de las muestras con desecante a temperatura ambiente.
6. Adherir las secciones con pinzas en una gota de 75% de alcohol. Monte las secciones con cubrebocas usando bálsamo neutro. Capture el etiquetado de fluorescencia rojo y verde con un microscopio de fluorescencia.
7. Mida el ancho entre dos líneas de etiquetado (Ir.L.Wi), perímetro trabecular de etiqueta simple (sL.Pm), perímetro trabecular de doble etiqueta (dL.Pm) y perímetro trabecular total (Tb.Pm). Calcular la tasa de aposición mineral (MAR) y la tasa de formación ósea (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/días de intervalo. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.

Resultados

Usando el actual protocolo, los ratones específicos osteoclast de la canceladura Stat3 fueron generados para estudiar la influencia de la canceladura STAT3 en la diferenciación osteoclasta. Los ratones Stat3^Ctsk y sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) fueron criados y mantenidos después del genotipado. Los macrófagos de médula ósea se aislaron y cultivaron en osteoclastos, y se demostró la deleción de STAT3en ratones Stat3^Ctsk

Discusión

Los modelos de ratón genéticamente modificados se utilizan comúnmente para estudiar el mecanismo y el tratamiento farmacéutico de las enfermedades humanas¹³. Los ratones Ctsk-Cre han sido ampliamente utilizados para estudios funcionales de osteoclastos⁶. El actual estudio describió los protocolos de los métodos para analizar fenotipo esquelético y para estudiar los genes críticos que controlaban actividad osteoclasta in vivo.

El ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde solution	Sangon biotech Co., Ltd.	E672002
Acetone	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	80000360
Alizarin	Sigma-Aldrich	A5533
Ammonia solution	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA	Electron Microscopy Sciences	13710
DeCa RapidlyDecalcifier	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
EDTA	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 RESIN	Electron Microscopy Sciences	14900
fluorescence microscope	Olympus	IX73
Hematoxylin solution	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μCT 80
NaHCO3	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	10018918
Neutral balsam	Sangon biotech Co., Ltd.	E675007
NMA	Electron Microscopy Sciences	19000
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
rotary microtome	Leica	RM2265
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
xylene	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	1330-20-7