Analisi del fenotipo scheletrico di un modello di mouse di eliminazione Stat3 condizionale

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo canonico per comprendere i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo. Questo metodo utilizza un modello di topo transgenico e alcune tecniche canoniche per analizzare il fenotipo scheletrico.

Abstract

I modelli di topo transgenico sono potenti per comprendere i geni critici che controllano la differenziazione e l'attività dell'osteoclasta e per studiare i meccanismi e i trattamenti farmaceutici dell'osteoporosi. I topi Cathepsin K (Ctsk)-Cre sono stati ampiamente utilizzati per studi funzionali sugli osteoclasti. Il trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) è rilevante nell'omeostasi ossea, ma il suo ruolo negli osteoclasti in vivo rimane scarsamente definito. Per fornire la prova in vivo che STAT3 partecipa alla differenziazione dell'osteoclasta e al metabolismo osseo, abbiamo generato un modello di topo di cancellazione Stat3 specifico dell'osteoclasta(Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre) e analizzato il suo fenotipo scheletrico. La scansione micro-CT e la ricostruzione 3D implicavano un aumento della massa ossea nei topi knockout condizionali. Colorazione H&E, colorazione doppia rossa di calceina e alizarina e colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) sono state eseguite per rilevare il metabolismo osseo. In breve, questo protocollo descrive alcuni metodi e tecniche canoniche per analizzare il fenotipo scheletrico e studiare i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo.

Introduzione

L'osso scheletrico è il principale organo portante del corpo umano ed è sotto pressione sia dall'ambiente interno che da quello esterno durante la camminata e l'esercizio^{fisico 1}. Per tutta la vita, le ossa passano continuamente attraverso l'autori rinnovamento, che è bilanciato da osteoblasti e osteoclasti. Il processo di sgombero di osteoclasti che cancellano vecchie ossa e osteoblasti formando nuovo osso mantiene l'omeostasi e la funzione meccanica del sistema^{scheletrico 2}. Il disturbo dell'equilibrio può indurre malattie metaboliche ossee, come l'osteoporosi. L'osteoporosi, causata dall'eccesso di attività osteoclastica, è prevalente a livello globale e causa notevoli perdite economiche^{alla società 2,3,4}. In base al numero limitato di farmaci disponibili per il trattamento dell'osteoporosi e al loro rischio di effetti^{avversi 4}, è importante svelare i dettagli della formazione e dell'attività dell'osteoclasta.

Gli osteoclasti derivati dal lignaggio ematopoietico monocito/macrofago hanno nuclei multipli (possono avere da 2 a 50 nuclei) e sono grandi (di solito superiori a 100 μm di diametro)². Sebbene l'esplorazione dei meccanismi e lo screening dei farmaci per i disturbi osteoclastici siano stati ampiamente migliorati attraverso la coltura osteoclasta in vitro, le complicate reazioni organiche rendono le prove in vivo indispensabili per la terapia mirata. A causa delle somiglianze genetiche e fisiopatofiche tra topi e esseri umani, i modelli di topi geneticamente modificati sono comunemente utilizzati per studiare i meccanismi e i trattamenti farmaceutici delle malattie umane in vivo⁶. Il sistema Cre-loxP è una tecnologia ampiamente utilizzata per l'editing genico del topo e ha permesso ai ricercatori di indagare le funzioni geniche in modo specifico per tessuti /^{cellule 5}. La catepsina K (CSTK) è una proteasi cisteina secreta dagli osteoclasti che può degradare il collagene osseo⁸. È ben accettato che il CTSK sia espresso selettivamente negli osteoclasti maturi; pertanto, i topi Ctsk-Cre sono considerati uno strumento utile per studi funzionali sugli osteoclasti ed è stato utilizzato⁶.

Il trasduttore di segnale e attivatore della famiglia di trascrizione (STAT) è classico e altamente significativo nella progressione e nello sviluppo dell'immunità e^{del cancro 7,8}. Tra sette STATISTICHE, STAT3 è segnalato per essere il più rilevante per l'omeostasi ossea^9,10. Diversi studi in vivo hanno riportato che l'inattivazione specifica di STAT3 negli osteoblasti diminuisce la formazione^{ossea 9,10}. Tuttavia, le prove solide riguardanti la partecipazione di STAT3 alla formazione di osteoclasti e al metabolismo osseo in vivo sono ancora limitate. Recentemente, abbiamo fornito prove in vivo con un modello di topo di cancellazione Stat3 specifico per osteoclasta(Stat3^fl/fl; Ctsk-Cre, di seguito chiamato Stat3^Ctsk) che STAT3 partecipa alla differenziazione osteoclasta e al metabolismo^{osseo 11}. Nel presente studio, descriviamo i metodi e i protocolli che abbiamo usato per analizzare i cambiamenti nella massa ossea, istomorfologia ossea e anabolismo osseo e catabolismo dei topi Stat3^Ctsk al fine di studiare l'influenza della cancellazione STAT3 specifica dell'osteoclasta sull'omeostasi ossea.

Protocollo

Tutti i metodi relativi agli animali qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Shanghai Jiaotong University School of Medicine.

1. Allevamento di topi di cancellazione Stat3 specifici dell'osteoclasta

NOTA: I topi Stat3^fl/fl sono stati ottenuti commercialmente. I topi Ctsk-Cre sono stati forniti da S. Kato (Università di Tokyo, Tokyo, Giappone¹²). I topi sono stati allevati e mantenuti in specifiche condizioni esenti da agenti patogeni (SPF) nell'impianto istituzionale di origine animale in condizioni standardizzate.

1. Abbina un topo maschio sessualmente maturo a due topi femmine della stessa età. Dopo 18 giorni, controlla i controlli giornalieri per i neonati. Separare i topi femmine gravidi e tenerlo solo se necessario. Cambia topi maschi tra diverse gabbie di riproduzione se i topi femmine non erano incinte entro 1 mese dall'accoppiamento.
2. Incrocia i^{topi fl/fl} Stat3 con i topi Ctsk-Cre (F0). Agganciare le code per la genotipizzazione e mantenere il maschio Stat3^fl/+; Topi Ctsk-Cre fino a quando non sono sessualmente maturi, che ha circa 6 settimane di età (F1). Utilizzare i seguenti primer: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
3. Croce maschio di 6 settimane Stat3^fl/+; Topi Ctsk-Cre con topi Stat3^{fl/fl femminili.} Ritagliare le code per il genotipizzazione e mantenere il maschio Stat3 ^fl/fl; Topi Ctsk-Cre fino a quando non sono sessualmente maturi, che ha circa 6 settimane di età (F2).
4. Attraversa stat3 ^fl/fl maschio di 6 settimane; Topi Ctsk-Cre con topi Stat3^fl/fl femminili (F3). Ritagliare le code per il genotipizzazione e sostituire i vecchi topi riproduttori con topi più giovani nel tempo (F3 +N).

2. Raccolta campioni

1. Eutanasia sei paia di topi maschi Stat3^{fl/fl e} Stat3^Ctsk di 8 settimane separatamente con asfissia di anidride carbonica.
   NOTA: La portata di CO₂ sposta il 30% del volume della gabbia al minuto (ad esempio, per 45 cm x 30 cm x 30 cm di gabbia la portata di CO₂ è di 40 L/min).
2. Posizionare i topi in posizione supina. Dislocare delicatamente a mano le articolazioni bilaterali dell'anca. Utilizzare forbici oftalmiche per tagliare la pelle verticalmente dalla tibia distatale e quindi sezionare l'intera pelle dall'arto posteriore.
3. Tagliare il legamento articolare dell'articolazione destra dell'anca e dell'articolazione del ginocchio con le forbici per separare l'arto posteriore. Tagliare il trochanter e la giunzione della fibula e quindi immergere l'arto posteriore in paraformaldeide al 4%. Tenere gli arti posteriori giusti per il passaggio 3. Tagliare in modo appropriato l'osso ad entrambe le estremità per immergere completamente e fissare il midollo osseo con paraformaldeide al 4%.
4. Tagliare il legamento articolare dell'articolazione sinistra dell'anca e dell'articolazione del ginocchio con le forbici, rimuovere delicatamente il tessuto molle e separare accuratamente la tibia e il femore. Immergere la tibia e il femore separatamente nel 75% di etanolo. Mantenere la femora per il passaggio 4 e tibiae per il passaggio 6. Assicurarsi di mantenere intatto il trochanter.

3. Preparazione della sezione di paraffina

1. Fissare l'arto posteriore destro in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 48 ore.
2. Decalcificare: Lavare delicatamente i campioni con 1x PBS per 10 min 3 volte. Decalcificare i campioni in EDTA al 15% (150 g DI EDTA in 800 mL di ddH₂O e 100 mL di 10x PBS) con un decalcificatore ad ultrasuoni per 3-4 settimane fino a quando le ossa non possono essere piegate. Sostituire con liquido decalcificante fresco a giorni diversi.
3. Lavare delicatamente i campioni 3 volte con 1x PBS e poi immergerli in 75% di etanolo a 4 °C durante la notte.
4. Disidratazione: Il secondo giorno, immergere sequenzialmente i campioni in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene, ciascuno per 1 h due volte.
5. Immergere i campioni in paraffina 1/2 di xilene 1/2 per 30 minuti. Immergere gli esemplari in paraffina a 65 °C durante la notte.
6. Incorpora: selezionare un serbatoio di incorporamento adatto per l'incorporamento. Posizionare la tibia uniformemente sotto. Posizionare il femore e la tibia con un angolo di 90°. Dopo che la paraffina è stata completamente raffreddata e solidificata, rimuoverla dal serbatoio di incorporamento. Numera gli esemplari e conservali a -20 °C durante la notte.
7. Tagliare continuamente sezioni spesse 5 μm utilizzando il microtomo. Tagliare 20-40 sezioni. Stendere le sezioni su acqua a 37 °C, aderire agli scivoli al microscopio e cuocere a 42 °C durante la notte.

4. Scansione e analisi micro-CT

1. Scansiona la femora sinistra con uno scanner micro-CT. Risoluzione: 10 μm; Tensione: 70 kV; Corrente: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Fase di rotazione: 0,5°.
2. Ricostruire immagini 3D dell'osso corticale e dell'osso trabecolare utilizzando il software di supporto dello scanner seguendo le istruzioni del produttore. Le ROM sono in una larghezza totale di 1 mm di osso trabecolare vicino alla piastra di crescita distale e in una sezione totale larga 1 mm dell'osso corticale al centro della femora.
3. Calcolare i parametri quantitativi della microarchitettura: densità minerale ossea (BMD), frazione del volume osseo (BV/TV), spessore trabecolare (Tb.Th.), numero trabecolare (Tb.N.), separazione trabecolare (Tb.Sp.) e spessore osseo corticale (Ct.Th.).

5. Colorazione TRAP

1. Cuocere le sezioni di paraffina a 65 °C per 30 minuti.
2. Dewax: Immergere le sezioni in xilene per 10 min. Eseguire questo passaggio 3x con xilene fresco.
3. Reidrato: Immergere le sezioni in sequenza in 100% etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo e ddH₂O, ciascuno per 5 min due volte.
4. Preparare la soluzione di colorazione utilizzando il kit di colorazione TRAP seguendo le istruzioni del produttore e riscaldare a 37 °C.
   NOTA: La soluzione di colorazione TRAP deve essere preparata al momento immediatamente prima di ogni saggio.
5. Aggiungere soluzione di colorazione da 50-100 μL a ciascun campione e incubare in una camera umida a 37 °C per 20-30 minuti. Controllare lo stato di colorazione degli osteoclasti al microscopio leggero ogni 5 minuti fino a quando non si possono vedere osteoclasti multinucleati rossi. Terminare la reazione con ddH₂O.
6. Controsostenibile in soluzione di ematossilina per 30 s. Creare un colore blu stabile per immersione in soluzione di ammoniaca all'1% per 1 minuto. Risciacquare in acqua del rubinetto che scorre lentamente.
7. Montare le sezioni con copricapo utilizzando balsamo neutro e asciugare durante la notte.
8. Cattura 3-5 campi di interesse al microscopio. Analizzare il perimetro trabecolare per immagine J: misurare la lunghezza della barra di scala (Ls) usando lo strumento 'linearetta ' come L1, quindi misurare la lunghezza del perimetro trabecolare usando lo strumento 'linea segmentata' come L2, la lunghezza fisica (Lp)= Ls*L2 /L1). Contare il numero di cellule positive trap con più di tre nuclei.

6. Doppia etichettatura rossa calcein e alizarina

1. Preparazione del campione: Iniettare per via intraperitoneale 20 mg/kg di calceina (1 mg/mL in soluzione NaHCO_{3 al 2%)} il giorno 0 e 25 mg/kg di alizarina rossa S (AL, 2 mg/mL in H₂O) il giorno 4. Sacrifica i topi il giorno 7. Dissociare con cura le tibia e fissarlo in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 48 ore.
2. Disidratazione: Dopo la fissazione, lavare delicatamente la tibiae 3x con 1x PBS. Immergere sequenzialmente i campioni in etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene per 5 minuti due volte separatamente.
3. Immergere i campioni in acetone per 12 ore, in 1/2 acetone 1/2 resina per 2 ore e in resina pura in un forno di essiccazione durante la notte.
   NOTA: La resina è stata preparata con resina disponibile in commercio (ad esempio, Embed 812 Resin) secondo le istruzioni del produttore.
4. Incorporare: Aggiungere la resina pura in un serbatoio di incorporamento in gel di silice adatto e posizionare delicatamente i campioni per evitare bolle. Polimerizzare la resina in un forno di essiccazione a 60 °C per 48 ore.
5. Tagliare continuamente i provini in sezioni spesse 5 μm con un microtomo rotante. Conservare il resto dei campioni con essiccante a temperatura ambiente.
6. Aderire alle sezioni con pinzette in una goccia di alcol al 75%. Montare le sezioni con coprispasmi utilizzando balsamo neutro. Cattura l'etichettatura a fluorescenza rossa e verde con un microscopio a fluorescenza.
7. Misurare la larghezza tra due linee di etichettatura (Ir.L.Wi), perimetro trabecolare a etichetta singola (sL.Pm), perimetro trabecolare a doppia etichetta (dL.Pm) e perimetro trabecolare totale (Tb.Pm). Calcolare il tasso di apposizione minerale (MAR) e il tasso di formazione ossea (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/interval days. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.

Risultati

Utilizzando il presente protocollo, sono stati generati topi di cancellazione Stat3 specifici osteoclasti per studiare l'influenza della cancellazione di STAT3 sulla differenziazione dell'osteoclasta. I topi Stat3^Ctsk e i loro compagni di cucciolata di tipo selvatico (WT) sono stati allevati e tenuti dopo il genotipizzazione. I macrofagi del midollo osseo sono stati isolati e coltivati in osteoclasti e la cancellazione di STAT3 nei topi Stat3^Ctsk è stata...

Discussione

I modelli di topi geneticamente modificati sono comunemente utilizzati per studiare il meccanismo e il trattamento farmaceutico della malattia^{umana 13}. I topi Ctsk-Cre sono stati ampiamente utilizzati per studi funzionali di osteoclasti⁶. Il presente studio ha descritto i protocolli dei metodi per analizzare il fenotipo scheletrico e studiare i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo.

L'analisi istologica è il migli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde solution	Sangon biotech Co., Ltd.	E672002
Acetone	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	80000360
Alizarin	Sigma-Aldrich	A5533
Ammonia solution	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA	Electron Microscopy Sciences	13710
DeCa RapidlyDecalcifier	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
EDTA	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 RESIN	Electron Microscopy Sciences	14900
fluorescence microscope	Olympus	IX73
Hematoxylin solution	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μCT 80
NaHCO3	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	10018918
Neutral balsam	Sangon biotech Co., Ltd.	E675007
NMA	Electron Microscopy Sciences	19000
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
rotary microtome	Leica	RM2265
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
xylene	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	1330-20-7