Скелетный фенотип анализ условной модели удаления Stat3 мыши

Резюме

Этот протокол описывает канонический метод для понимания критических генов, контролирующих активность остеокласта in vivo. Этот метод использует трансгенную модель мыши и некоторые канонические методы для анализа скелетного фенотипа.

Аннотация

Трансгенные модели мыши являются мощными для понимания критических генов, контролирующих дифференциацию и активность остеокласта, а также для изучения механизмов и фармацевтических методов лечения остеопороза. Катепсин K (Ctsk)-Cre мышей были широко использованы для функциональных исследований остеокластов. Препонент сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) актуален в гомеостазе костей, но его роль в остеокластах in vivo остается плохо определенной. Чтобы обеспечить in vivo доказательства того, что STAT3 участвует в дифференциации остеокласта и метаболизма костей, мы создали остеокласт конкретных Stat3 удаления мыши модели (Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre) и проанализировал его скелетный фенотип. Микро-КТ сканирование и 3D реконструкция подразумевает увеличение костной массы у условного нокаут мышей. Для обнаружения метаболизма костей были выполнены окрашивание, кальциин и ализарин красного двойного окрашивания, а также тартратостойкий кислотный фосфатаза (TRAP). Короче говоря, этот протокол описывает некоторые канонические методы и методы для анализа скелетного фенотипа и изучения критических генов, контролирующих активность остеокласта in vivo.

Введение

Скелетная кость является основным несущим органом человеческого тела и находится под давлением как внутренней, так и внешней среды во время ходьбы и физических^{упражнений 1.} На протяжении всей своей жизни, кости постоянно проходят через самообувека, которая уравновешивается остеобластов и остеокластов. Процесс очистки остеокластов старых костей и остеобластов, образующих новую кость, поддерживает гомеостаз и механическую функцию скелетной^{системы 2.} Нарушение баланса может вызвать заболевания костного обмена веществ, такие как остеопороз. Остеопороз, вызванный избыточной остеокластической активностью, широко распространен во всем мире и наносит существенные^{экономические потери обществу 2,3,4.} В соответствии с ограниченным числом препаратов, доступных для лечения^{остеопороза и их риск побочных эффектов 4}, важно раскрыть детали формирования остеокласта и деятельности.

Остеокласты, полученные из моноцитов / макрофаг гематопоэтической линии имеют несколько ядер (может иметь от 2 до 50 ядер) и большие (обычно больше, чем 100 мкм в диаметре)². Хотя изучение механизмов и скрининг препаратов на остеокластические расстройства были широко улучшены с помощью культуры остеокласта in vitro, сложные органические реакции делают in vivo необходимым доказательством для целенаправленной терапии. Из-за генетического и патофизиологического сходства между мышами и людьми, генетически модифицированные модели мыши обычно используются для изучения механизмов и фармацевтических методов лечения заболеваний человека in vivo⁶. Система Cre-loxP является широко используемой технологией для редактирования генов мыши и позволила исследователям исследовать генные функции в тканевой/клеточной манере^5. Катепсин K (CSTK) является протеазы цистеина выделяется остеокластов, которые могут ухудшить костного коллагена⁸. Хорошо известно, что CTSK избирательно выражается в зрелых остеокластов; таким образом, Ctsk-Cre мышей считаются полезным инструментом для функциональных исследований остеокластов и был использован⁶.

Сигнал превудактор и активатор транскрипции (STAT) семьи является классическим и весьма значительным в иммунитете и прогрессии^{рака и развития 7,8}. Среди семи STATs, STAT3, как сообщается, наиболее актуальным для кости гомеостаза^9,10. Несколько исследований in vivo сообщили, что специфическая инактивация STAT3 при остеобластах уменьшает^{формирование костей 9,10.} Тем не менее, веские данные об участии STAT3 в формировании остеокласта и метаболизме костей в виво по-прежнему ограничены. Недавно мы предоставили доказательства in vivo с остеокластом конкретных Stat3 удаления мыши модели (Stat3^fl/fl; Ctsk-Cre, далее называется Stat3^Ctsk), что STAT3 участвует в дифференциации остеокласта и метаболизма костей¹¹. В настоящем исследовании мы описываем методы и протоколы, которые мы использовали для анализа изменений в костной массе, костной гистоморфологии, костной анаболии и катаболизма мышей Stat3^Ctsk для изучения влияния остеокласт-специфического удаления STAT3 на гомеостаз костей.

протокол

Все методы, касающиеся животных, описанных здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Школы медицины Шанхайского университета Цзяотонг.

1. Разведение остеокластных специфических мышей удаления Stat3

ПРИМЕЧАНИЕ: Stat3^{fl/fl мыши были} получены коммерчески. Мыши Ctsk-Cre были предоставлены С. Като (Токиоский университет, Токио, Япония¹²). Мышей разводили и поддерживали в особых условиях, свободных от патогенов (SPF) в институциональном животноводм учреждении в стандартизированных условиях.

1. Соедините сексуально зрелого самца мыши с двумя самками мышей того же возраста. После 18 дней, проверить ежедневные проверки для новорожденных. Отделять беременных самок мышей и держать его в покое, если это необходимо. Изменение мышей мужского пола среди различных клеток размножения, если самки мышей не были беременны в течение 1 месяца после спаривания.
2. Пересеким мышей Stat3^fl/fl на мышах Ctsk-Cre (F0). Клип хвосты для генотипирования и держать мужчин Stat3^{fl /}; Ctsk-Cre мышей, пока они не сексуально зрелые, который составляет около 6 недель (F1). Используйте следующие грунтовки: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTTGTTCTC.
3. Крест 6-недельный мужчина Stat3^fl/; Ctsk-Cre мышей с самками Stat3^{fl/fl мышей.} Клип хвосты для генотипирования и сохранить мужской Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre мышей, пока они не сексуально зрелые, что составляет около 6 недель (F2).
4. Крест 6-недельный мужчина Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre мышей с самками Stat3^fl/fl мышей (F3). Обрезать хвосты для генотипирования и заменить старые мышей разведения с молодыми мышами во времени (F3'N).

2. Коллекция specimen

1. Euthanize шесть пар 8-недельный мужчина Stat3^fl/fl и Stat3^Ctsk littermate мышей отдельно с углекислым газом удушья.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока CO₂ вытесняет 30% объема клетки в минуту (например, для 45 см х 30 см х 30 см клетки скорость потока CO₂ составляет 40 л/мин).
2. Поместите мышей в положение лежа. Аккуратно вывихите двусторонние тазобедренные суставы вручную. Используйте офтальмологические ножницы, чтобы отрезать кожу вертикально от дистальной голени, а затем вскрыть всю кожу от задней конечности.
3. Отрежьте суставную связку правого тазобедренного сустава и коленного сустава ножницами, чтобы отделить заднюю конечность. Вырезать trochanter и соединение малоберцовой кости, а затем погрузить заднюю конечность в 4% параформальдегида. Держите правые задние конечности для шага 3. Соответствующим образом вырезать кости на обоих концах, чтобы полностью погрузиться и исправить костного мозга с 4% параформальдегида.
4. Разрежьте ножницами суставную связку левого тазобедренного сустава и коленного сустава, аккуратно удалите мягкую ткань и тщательно отделите голени и бедренную кость. Погрузите голени и бедренной кости отдельно в 75% этанола. Держите бедренную кость для шага 4 и tibiae для шага 6. Убедитесь, что трочантер нетронутыми.

3. Подготовка раздела Парафин

1. Зафиксировать правую заднюю конечность в 4% параформальдегид при 4 КК для 48 ч.
2. Decalcify: Аккуратно мыть образцы с 1x PBS в течение 10 мин 3 раза. Декалькордировать образцы в 15% EDTA (150 г ЭДТА в 800 мл ddH₂O и 100 мл 10x PBS) с ультразвуковым десятичным усилителем в течение 3 до 4 недель, пока кости могут быть согнуты. Заменить свежей наклейкой жидкости через день.
3. Аккуратно мыть образцы 3x с 1x PBS, а затем погрузить их в 75% этанола при 4 градусов по Цельсию на ночь.
4. Обезвоживание: На второй день, последовательно погрузить образцы в 95% этанола, 100% этанола и ксилена, каждый в течение 1 ч в два раза.
5. Погрузите образцы в 1/2 ксилена 1/2 парафина в течение 30 мин. Погрузите образцы в парафин при 65 градусов по Цельсию за ночь.
6. Встраивание: Выберите подходящий встраивающий бак для встраивания. Поместите голени равномерно под. Поместите бедренную кость и голени под углом 90 градусов. После того, как парафин полностью остынет и затвердеет, удалите его из встраиваемого бака. Номер образцов и хранить их на -20 градусов по Цельсию на ночь.
7. Вырезать 5 мкм толщиной разделов непрерывно с помощью микротома. Вырезать 20-40 разделов. Распределите секции на 37 градусов по Цельсию воды, придерживаться их микроскоп слайды, и выпекать при температуре 42 градусов по Цельсию на ночь.

4. Микро-КТ сканирование и анализ

1. Сканирование левой бедренной кости с помощью микро-КТ сканера. Разрешение: 10 мкм; Напряжение: 70 кВ; Ток: 114 ЗА; Fliter: 0,5 мм Al; Шаг вращения: 0,5 градуса.
2. Реконструкция 3D-изображений корковой кости и трабекулярной кости с помощью поддерживающего программного обеспечения сканера по указанию производителя. ROIs находятся в общей ширине 1 мм трабекулярной кости близко к дистальной пластины роста и в общей сложности 1 мм широкий раздел корковой кости в середине бедренной кости.
3. Рассчитайте количественные параметры микроархитектуры: минеральная плотность костной ткани (BMD), фракция объема костной ткани (BV/TV), трабекулярная толщина (Tb.Th.), трабекулярное число (Tb.N.), трабекулярное разделение (Tb.Sp.) и толщина коры кости (Ct.Th.).

5. TRAP окрашивание

1. Выпекать парафиновые секции при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
2. Dewax: Погрузите секции в ксилен в течение 10 мин. Выполните этот шаг 3x со свежим ксиленом.
3. Регидратировать: Погрузите секции последовательно в 100% этанола, 95% этанола, 70% этанола, и ddH₂O, каждый в течение 5 мин в два раза.
4. Подготовьте окрашивающий раствор с помощью комплекта окрашивания TRAP, следуя инструкциям производителя, и подогрейте до 37 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: РЕШЕНИЕ ДЛЯ окрашивания TRAP должно быть свежеприготовлено непосредственно перед каждым анализом.
5. Добавьте к каждому образцу раствор для окрашивания 50–100 йл и инкубировать во влажной камере при 37 градусов по Цельсию в течение 20–30 минут. Проверьте состояние окрашивания остеокластов под световым микроскопом каждые 5 минут, пока не будут видны красные многоядерные остеокласты. Завершите реакцию ddH₂O.
6. Счетчик в гематоксилиновом растворе по 30 с. Создайте стабильный синий цвет путем погружения в 1% раствор аммиака в течение 1 мин. Промыть медленно проточной водопроводной водой.
7. Намонтировать секции с coverslips с использованием нейтрального бальзама и сухой ночь.
8. Захват 3-5 областей, представляющих интерес с помощью микроскопа. Проанализируйте трабекулярный периметр по изображению J: измерьте длину планки масштаба (Ls) спомощьюинструмента «прямая линия» как L1, затем измерьте длину трабекулярного периметра спомощьюинструмента «сегментированная линия» как L2, физической длины (Lp) » Ls'L2 /L1). Подсчитайте количество TRAP-положительных клеток с более чем тремя ядрами.

6. Кальцеин и ализарин красная двойная маркировка

1. Препарат: Интраперитонально вводят 20 мг/кг кальцеина (1 мг/мл в растворе NaHCO₃₎ на день 0, и 25 мг/кг ализарин красный S (AL, 2 мг/мл в H₂O) на 4-й день. Жертвоприношения мышей на 7-й день. Тщательно отмежеваться от голени и зафиксировать в 4% параформальдегид при 4 градусов по Цельсию на 48 ч.
2. Обезвоживание: После фиксации, аккуратно мыть голени 3x с 1x PBS. Последовательно погружайте образцы в 95% этанола, 100% этанола и ксилена в течение 5 мин два раза отдельно.
3. Погрузите образцы в ацетон на 12 ч, в 1/2 ацетона 1/2 смолы на 2 ч, а в чистую смолу в сушильной печи на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смола была подготовлена коммерчески доступной смолой (например, Embed 812 Resin) в соответствии с инструкциями производителя.
4. Вставлять: Добавить чистую смолу в подходящий кремнезем гель встраивания танка и место образцов мягко, чтобы избежать пузырьков. Полимеризируйте смолу в сушильной печи при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 48 ч.
5. Разрежьте образцы на 5 мкм толщиной секций непрерывно с вращающимся микротомом. Храните остальные образцы с desiccant при комнатной температуре.
6. Придерживайтесь разделов с пинцетом в капле 75% алкоголя. Намонтировать секции с крышками с использованием нейтрального бальзама. Захват красный и зеленый флуоресценции маркировки с флуоресценции микроскопа.
7. Измерьте ширину между двумя линиями маркировки (Ir.L.Wi), однотехтным трабекулярным периметром (sL.Pm), двух помеченным трабекулярным периметром (dL.Pm) и общим трабекулярным периметром (Tb.Pm). Рассчитайте скорость минерального аппозиции (MAR) и скорость формирования костей (BFR/BS). МАР и Ir.L.Wi/interval дней. BFR/BS( dL.Pm±sL.pm/2)

Результаты

Используя настоящий протокол, остеокласт конкретных Stat3 удаления мышей были созданы для изучения влияния удаления STAT3 на остеокласт дифференциации. Stat3^{Ctsk мышей} и их wildtype (WT) littermates были выведены и хранятся после генотипирования. Макрофаги костного мозга были изолиро...

Обсуждение

Генетически модифицированные модели мыши обычно используются для изучения механизма и фармацевтического лечения болезни человека¹³. Мышей Ctsk-Cre широко используются для функциональных исследований остеокластов^6. В настоящем исследовании описаны протоко...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde solution	Sangon biotech Co., Ltd.	E672002
Acetone	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	80000360
Alizarin	Sigma-Aldrich	A5533
Ammonia solution	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA	Electron Microscopy Sciences	13710
DeCa RapidlyDecalcifier	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
EDTA	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 RESIN	Electron Microscopy Sciences	14900
fluorescence microscope	Olympus	IX73
Hematoxylin solution	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μCT 80
NaHCO3	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	10018918
Neutral balsam	Sangon biotech Co., Ltd.	E675007
NMA	Electron Microscopy Sciences	19000
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
rotary microtome	Leica	RM2265
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
xylene	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	1330-20-7