JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה קנונית להבנת הגנים הקריטיים השולטים בפעילות אוסטאוקלסט ב- vivo. שיטה זו משתמשת במודל עכבר מהונדס וכמה טכניקות קנוניות כדי לנתח פנוטיפ השלד.

Abstract

מודלים מהונדסים של עכברים חזקים להבנת הגנים הקריטיים השולטים בהבחנה ובפעילות של אוסטאוקלסט, וללימוד מנגנונים וטיפולים תרופתיים באוסטיאופורוזיס. קטפסין K (Ctsk)-Cre עכברים כבר בשימוש נרחב עבור מחקרים פונקציונליים של osteoclasts. מתמר האות והפעיל של שעתוק 3 (STAT3) רלוונטי הומאוסטזיס העצם, אבל תפקידו osteoclasts ב vivo נשאר מוגדר היטב. כדי לספק את הראיות in vivo כי STAT3 משתתף בידול osteoclast ומטבוליזם העצם, יצרנו מודל עכבר מחיקה Stat3 ספציפי לאוסטאוקלסט (Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre) וניתח את פנוטיפ השלד שלו. סריקת מיקרו-CT ושחזור תלת-ממדי מרמזים על מסת עצם מוגברת בעכברי הנוקאאוט המותנים. כתמי H&E, כתמים כפולים בצבעי קלצין ואליזרין אדומים, וכתמי חומצה עמידים בפני טרטרט (TRAP) בוצעו לגילוי חילוף החומרים של העצם. בקיצור, פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות וטכניקות קנוניות כדי לנתח פנוטיפ השלד וללמוד את הגנים הקריטיים השולטים בפעילות אוסטאוקלסט ב vivo.

Introduction

עצם השלד היא האיבר נושא העומס העיקרי של גוף האדם והיא נמצאת תחת לחץ הן מהסביבה הפנימית והן מהסביבה החיצונית במהלך הליכה ופעילות גופנית1. לאורך כל חייו, העצמות עוברות ללא הרף התחדשות עצמית, המאוזנת על ידי אוסטובלסטים ואוסטיאוקלסטים. התהליך של osteoclasts ניקוי עצמות ישנות osteoblasts להרכיב עצם חדשה שומרת על הומאוסטזיס ותפקוד מכני של מערכת השלד2. הפרעה באיזון עלולה לגרום למחלות מטבוליות בעצמות, כגון אוסטאופורוזיס. אוסטאופורוזיס, אשר נגרמת על ידי פעילות אוסטאוקלסטית עודף, נפוץ ברחבי העולם וגורם הפסדים כלכליים משמעותיים לחברה2,3,4. על פי המספר המוגבל של תרופות זמינות לטיפול אוסטאופורוזיס ואת הסיכון שלהם תופעות לוואי4, חשוב לחשוף את הפרטים של היווצרות אוסטאוקלסט ופעילות.

Osteoclasts נגזר שושלת המונוציטים / מקרופאג hematopoietic יש גרעינים מרובים (אולי יש 2 עד 50 גרעינים) והם גדולים (בדרך כלל גדול מ 100 מיקרומטר קוטר)2. למרות חקר המנגנונים ואת ההקרנה של תרופות להפרעות אוסטאוקלסטיות שופרו באופן נרחב באמצעות תרבות אוסטאוקלסט במבחנה, התגובות האורגניות המורכבות הופכות ראיות vivo הכרחי לטיפול ממוקד. בשל קווי דמיון גנטיים ופתופיזיולוגיים בין עכברים לבני אדם, מודלים של עכברים מהונדסיםגנטיתמשמשים בדרך כלל לחקר המנגנונים והטיפולים התרופותיים של מחלות אנושיות ב vivo 6 . מערכת Cre-loxP היא טכנולוגיה בשימוש נרחב לעריכת גנים של עכבר ואיפשרה לחוקרים לחקור תפקודי גנים באופן ספציפי לרקמות /תאים 5. קטפסין K (CSTK) הוא פרוטאז ציסטאין המופרש על ידי אוסטאוקלסטים שיכולים להשפיל קולגןעצם 8. מקובל כי CTSK מתבטא באופן סלקטיבי אוסטאוקלסטים בוגרים; לכן, עכברי Ctsk-Cre נחשבים לכלי שימושי למחקרים פונקציונליים של אוסטאוקלסטים ושימשו6.

מתמר האות והפעיל של משפחת שעתוק (STAT) הוא קלאסי ומשמעותי מאוד בהתקדמות חסינות וסרטן ופיתוח7,8. בין שבעה STATs, STAT3 הוא דיווח להיות הרלוונטי ביותר הומאוסטזיסעצם 9,10. מספר מחקרים vivo דיווחו כי השבתה ספציפית של STAT3 ב osteoblasts מקטין היווצרותהעצם 9,10. עם זאת, ראיות מוצקות לגבי ההשתתפות של STAT3 היווצרות osteoclast ומטבוליזם העצם vivo עדיין מוגבל. לאחרונה, סיפקנו ראיות vivo עם מודל עכבר מחיקה Stat3 ספציפי אוסטאוקלסט (Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, להלן נקרא Stat3Ctsk) כי STAT3 משתתף בידול osteoclast ומטבוליזםהעצם 11. במחקר הנוכחי, אנו מתארים את השיטות והפרוטוקולים שבהם השתמשנו כדי לנתח את השינויים במסת העצם, היסטומורפולוגיה של העצמות, אנבוליזם בעצמות וקטבוליזם של עכברי Stat3Ctsk כדי לחקור את ההשפעה של מחיקת STAT3 ספציפית לאוסטאוקלסט על הומאוסטזיס של העצם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות הנוגעות לבעלי החיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי Jiaotong.

1. הרבייה של עכברי מחיקה ספציפיים Stat3 osteoclast

הערה: עכברי Stat3fl / fl הושגו מסחרית. עכברי Ctsk-Cre סופקו על ידי ס. קאטו (אוניברסיטת טוקיו, טוקיו, יפן12). העכברים גודלו ונשמרו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF) במתקן המוסדי לבעלי חיים בתנאים סטנדרטיים.

  1. זוג עכבר זכר בוגר מינית עם שני עכברים נקבה באותו גיל. לאחר 18 ימים, יש לבדוק אם יש תינוקות בבדיקות יומיות. להפריד את העכברים הנשי בהריון ולשמור אותו לבד במידת הצורך. החלף עכברים זכרים בין כלובי רבייה שונים אם העכברים הנשיים לא היו בהריון בתוך חודש מהזיווג.
  2. לחצות עכברי Stat3fl / fl לעכברים Ctsk-Cre (F0). חותכים את הזנבות עבור genotyping ולשמור על Stat3זכרfl /+; עכברי Ctsk-Cre עד שהם בוגרים מינית, וזה בערך 6 שבועות של גיל (F1). השתמש בפריימריז הבאים: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCTTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTCGTTC.
  3. לחצות 6 שבועות זכר Stat3fl /+; עכברי Ctsk-Cre עם עכברי Stat3fl /fl נקבה. חותכים את הזנבות עבור genotyping ולשמור על Stat3 זכר fl / fl; עכברי Ctsk-Cre עד שהם בוגרים מינית, וזה בערך 6 שבועות של גיל (F2).
  4. לחצות 6 שבועות זכר Stat3 fl / fl; עכברי Ctsk-Cre עם עכברי Stat3fl/fl נקבה (F3). חותכים את הזנבות עבור genotyping ולהחליף את העכברים הרבייה הישן עם עכברים צעירים בזמן (F3 +N).

2. אוסף דגימות

  1. המתת חסד שישה זוגות של 8 שבועות זכר Stat3fl / fl ו Stat3Ctsk המלטה עכברים בנפרד עם חנק פחמן דו חמצני.
    הערה: קצב הזרימה CO2 מזיז 30% מנפח הכלוב לדקה (למשל, עבור 45 ס"מ x 30 ס"מ x 30 ס"מ כלוב קצב הזרימה CO2 הוא 40 L / min).
  2. מניחים את העכברים בתנוחת על-חושית. פרקו את מפרקי הירך הדו-צדדיים בעדינות ביד. השתמש במספריים עיניים כדי לחתוך את העור אנכית מן השוקה הדיסטלית ולאחר מכן לנתח את העור כולו מן האיבר האחורי.
  3. חותכים את הרצועה המפרקית של מפרק הירך הימנית ומפרק הברך עם מספריים כדי להפריד את האיבר האחורי. חותכים את הטרוצ'נטר ואת צומת השוקית ולאחר מכן לטבול את האיבר האחורי ב 4% paraformaldehyde. שמור על הגפיים האחוריות הנכונות לשלב 3. כראוי לחתוך את העצם בשני הקצוות כדי לטבול באופן מלא ולתקן את מח העצם עם 4% paraformaldehyde.
  4. חותכים את הרצועה המפרקית של מפרק הירך השמאלי ומפרק הברך עם מספריים, להסיר בעדינות את הרקמה הרכה, ולהפריד בזהירות את השוקה ואת עצם הירך. לטבול את השוקה ואת עצם הירך בנפרד 75% אתנול. שמור את femora לשלב 4 ו tibiae לשלב 6. ודא לשמור על הטרוצ'נטר שלם.

3. הכנת סעיף פרפין

  1. לתקן את האיבר האחורי הימני ב 4% paraformaldehyde ב 4 °C (69 °F) עבור 48 שעות.
  2. Decalcify: לשטוף בעדינות את הדגימות עם 1x PBS במשך 10 דקות 3 פעמים. Decalcify את הדגימות ב 15% EDTA (150 גרם EDTA ב 800 מ"ל של ddH2O ו 100 מ"ל של 10x PBS) עם decalcifier קולי במשך 3 עד 4 שבועות עד העצמות ניתן לכופף. החלף בנוזל מדבק טרי כל יומיים.
  3. יש לשטוף בעדינות את הדגימות פי 3 עם 1x PBS ולאחר מכן לטבול אותן באתנול של 75% ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. התייבשות: ביום השני, לטבול ברצף דגימות 95% אתנול, 100% אתנול, ו xylene, כל אחד עבור 1 שעה פעמיים.
  5. לטבול דגימות 1/2 xylene 1/2 פרפין במשך 30 דקות. לטבול את הדגימות בפרפין ב 65 מעלות צלזיוס לילה.
  6. הטבעה: בחר מיכל הטבעה מתאים להטבעה. מניחים את השוקה באופן אחיד מתחת. מניחים את עצם הירך ואת השוקה בזווית של 90°. לאחר הפרפין יש מקורר לחלוטין והתמצק, להסיר אותו ממיכל ההטבעה. מספר הדגימות ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס לילה.
  7. חותכים 5 מיקרומטר עבה קטעים ברציפות באמצעות microtome. חותכים 20-40 חלקים. מורחים את החלקים על 37 מעלות צלזיוס מים, לדבוק בהם שקופיות מיקרוסקופ, ואופים ב 42 מעלות צלזיוס לילה.

4. סריקה וניתוח מיקרו-CT

  1. סרוק את הפמורה השמאלית באמצעות סורק מיקרו-סי-טי. רזולוציה: 10 מיקרומטר; מתח: 70 kV; זרם: 114 μA; פליטר: 0.5 מ"מ אל; שלב הסיבוב: 0.5°.
  2. שחזרו תמונות תלת-ממדיות של עצם קליפת המוח ועצם הטרבקולרית באמצעות התוכנה התומכת של הסורק בהתאם להוראת היצרן. ROIs נמצאים ברוחב כולל של 1 מ"מ של עצם trabecular קרוב לצלחת הצמיחה דיסטלית ובסך הכל 1 מ"מ רחב קטע של עצם קליפת המוח באמצע femora.
  3. חשב את הפרמטרים המיקרו-ארכיטקטוניים הכמותיים: צפיפות מינרלים בעצמות (BMD), שבר נפח העצם (BV/TV), עובי טרבקולרי (Tb.Th),מספר טרבקולרי (Tb.N.), הפרדה טראבקולרית (Tb.Sp) ועובי עצם קליפת המוח (Ct.Th).

5. מכתים מלכודת

  1. אופים את חלקי הפרפין ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  2. Dewax: לטבול את החלקים xylene במשך 10 דקות. בצע שלב זה 3x עם קסילן טרי.
  3. Rehydrate: לטבול את החלקים ברצף 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול, ו ddH2O, כל אחד במשך 5 דקות פעמיים.
  4. הכינו את פתרון הכתמים באמצעות ערכת הכתמים TRAP בהתאם להוראות היצרן וחמים עד 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: פתרון מכתים TRAP צריך להיות מוכן טרי מיד לפני כל בדיקה.
  5. הוסף 50-100 μL כתם פתרון לכל מדגם דגירה בתא לח 37 °C (37 °F) במשך 20-30 דקות. בדוק את מצב הכתמים של osteoclasts תחת מיקרוסקופ אור כל 5 דקות עד osteoclasts multinucleated אדום ניתן לראות. סיים את התגובה עם DDH2O.
  6. כתם נגדי בתמיסת המטוקסילין למשך 30 שניות. צור צבע כחול יציב על-ידי טבילה בתמיסת אמוניה של 1% למשך דקה. יש לשטוף במי ברז זורמים באיטיות.
  7. הר את החלקים עם coverslips באמצעות balsam ניטרלי ויבש לילה.
  8. לכוד 3-5 תחומי עניין באמצעות מיקרוסקופ. נתח את ההיקף trabecular על ידי תמונה J: למדוד את אורך סרגל קנה המידה (Ls) באמצעות הכלי 'קו ישר' כמו L1, ולאחר מכן למדוד את אורך ההיקף trabecular באמצעות הכלי 'קו מקוטע' כמו L2, האורך הפיזי (Lp)= Ls * L2 / L1). ספור את מספר התאים החיוביים TRAP עם יותר משלושה גרעינים.

6. תיוג כפול אדום של Calcein ואליזרין

  1. הכנת דגימה: תוך-פיוריטוני להזריק 20 מ"ג/ק"ג קלצין (1 מ"ג/ מ"ל ב 2% NaHCO3 פתרון) ביום 0, ו 25 מ"ג / קילוגרם אליזרין אדום S (AL, 2 מ"ג / מ"ל ב H2O) ביום 4. להקריב עכברים ביום 7. בזהירות לנתק את השוקה ולתקן 4% paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס עבור 48 שעות.
  2. להתייבש: לאחר קיבעון, לשטוף בעדינות את השוקי 3x עם 1x PBS. לטבול ברצף את הדגימות ב 95% אתנול, 100% אתנול, ו xylene במשך 5 דקות פעמיים בנפרד.
  3. לטבול את הדגימות באצטון במשך 12 שעות, ב 1/2 שרף אצטון 1/2 במשך 2 שעות, בשרף טהור בתנור ייבוש לילה.
    הערה: שרף הוכן על ידי שרף זמין מסחרית (למשל, הטבעה 812 שרף) על פי הוראות היצרן.
  4. הטבעה: מוסיפים שרף טהור למיכל הטמעת ג'ל סיליקה מתאים ומניחים את הדגימות בעדינות כדי למנוע בועות. מפולימרים את שף בתנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  5. חותכים את הדגימות לתוך 5 μm קטעים עבים ברציפות עם microtome סיבובי. אחסן את שאר הדגימות עם ייבוש בטמפרטורת החדר.
  6. לדבוק בסעיפים עם פינצטה בירידה של 75% אלכוהול. הר את החלקים עם כריכות באמצעות בלסם ניטרלי. לכוד תיוג פלואורסצנטי אדום וירוק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  7. מדוד את הרוחב בין שני קווי תיוג (Ir.L.Wi), היקף טראבקולרי בעל תווית אחת (sL.Pm), היקף טרבקולרי בעל תווית כפולה (dL.Pm) והיקף טרבקולרי כולל (Tb.Pm). חשב את קצב ההסתבכות המינרלית (MAR) ואת קצב היווצרות העצם (BFR/BS). MAR = ימי Ir.L.Wi/מרווח זמן. BFR/BS= (dL.Pm±SL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100%.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, עכברי מחיקה ספציפיים Stat3 osteoclast נוצרו כדי ללמוד את ההשפעה של מחיקת STAT3 על בידול osteoclast. עכברי Stat3Ctsk וחבריהם לפסולת (WT) גודלו ונשמרו לאחר גנוטיפינג. מקרופאגים של מח עצם בודדו ותורבתו לאוסטאוקלסטים, ומחיקת STAT3 בעכברי Stat3Ctsk הודגמה (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מודלים עכבר מהונדסים גנטית משמשים בדרך כלל לחקר המנגנון וטיפול תרופתי של מחלה אנושית13. עכברי Ctsk-Cre היו בשימוש נרחב למחקרים פונקציונליים של אוסטאוקלסטים6. המחקר הנוכחי תיאר את הפרוטוקולים של השיטות לנתח פנוטיפ שלד וללמוד את הגנים הקריטיים השולטים בפעילות או?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לפרופ' וייגו זו וס. קאטו על ריאגנטים ועכברים ולחברי מעבדת זו על דיונים מועילים. אנו מודים גם למעבדה עבור מרכז סטומטולוגיה ומחקר דיגיטלי עבור אנומליות Craniofacial של בית החולים העממי התשיעי של שנגחאי לקבלת סיוע. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC) [81570950,81870740,81800949], פסגת שנגחאי & רמת דיסציפלינות, קרן SHIPM-mu ממכון שנגחאי לרפואה מדויקת, בית החולים העממי התשיעי של שנגחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי ג'יאו טונג [JC201809], פרויקט התמריצים של צוות חדשנות ברמה גבוהה עבור בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי ג'יאו טונג קרן המחקר הבין-תחומית של בית החולים העממי התשיעי בשנגחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי JiaoTong [JYJC201902]. ואל.ג'יי הוא חוקר של כישרונות רפואיים מצטיינים לנוער, שנגחאי "כוכבים עולים של כישרון רפואי" תוכנית פיתוח נוער ופרויקט "חן שינג" מאוניברסיטת שנגחאי Jiaotong.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4% Paraformaldehyde solutionSangon biotech Co., Ltd.E672002
AcetoneShanghai Experimental Reagent Co., Ltd.80000360
AlizarinSigma-AldrichA5533
Ammonia solutionShanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
CalceinSigma-AldrichC0875
Ctsk-Cre micea gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSAElectron Microscopy Sciences13710
DeCa RapidlyDecalcifierPro-CureDX1100
DMP-30Electron Microscopy Sciences13600
EDTAShanghai Experimental Reagent Co., Ltd.60-00-4
EMBED 812 RESINElectron Microscopy Sciences14900
fluorescence microscopeOlympusIX73
Hematoxylin solutionBeyotime BiotechanologyC0107
Micro-CTScanco Medical AGμCT 80
NaHCO3Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.10018918
Neutral balsamSangon biotech Co., Ltd.E675007
NMAElectron Microscopy Sciences19000
ParaffinSangon biotech Co., Ltd.A601889
rotary microtomeLeicaRM2265
Stat3fl/fl miceGemPharmatech Co., LtdD000527
TRAP staining kitSigma-Aldrich387A
xyleneShanghai Experimental Reagent Co., Ltd.1330-20-7

References

  1. Zaidi, M. Skeletal remodeling in health and disease. Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).
  2. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  3. Cummings, S. R., Melton, L. J. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).
  4. Black, D. M., Rosen, C. J. Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis. New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).
  5. Kos, C. H. Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models. Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).
  6. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  7. Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).
  8. Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions. Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).
  9. Itoh, S., et al. A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation. Bone. 39 (3), 505-512 (2006).
  10. Zhou, H., et al. Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species. Bone. 49 (3), 404-411 (2011).
  11. Yang, Y., et al. STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription. Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).
  12. Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130 (5), 811-823 (2007).
  13. Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).
  14. Minkin, C. Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).
  15. Vaaraniemi, J., et al. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).
  16. Ljusberg, J., et al. Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).
  17. Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).
  18. Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations. American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).
  19. Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).
  20. Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity. American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).
  21. Solberg, L. B., et al. Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats. Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).
  22. Tambutté, E., et al. Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification. Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).
  23. Han, Y., et al. Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).
  24. Dai, Q., et al. mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression. Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).
  25. Sun, J., et al. Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts. Bone Research. 6, 14(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161STAT3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved