Skelett-Phänotyp-Analyse eines bedingten Stat3-Löschmausmodells

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine kanonische Methode, um die kritischen Gene zu verstehen, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern. Diese Methode verwendet ein transgenes Mausmodell und einige kanonische Techniken, um Skelett-Phänotyp zu analysieren.

Zusammenfassung

Transgene Mausmodelle sind mächtig für das Verständnis der kritischen Gene, die osteoklastische Differenzierung und Aktivität steuern, und für das Studium von Mechanismen und pharmazeutischen Behandlungen von Osteoporose. Cathepsin K (Ctsk)-Cre Mäuse wurden weit verbreitet für funktionelle Studien von Osteoklasten verwendet. Der Signalgeber und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) ist bei der Knochenhomöostase relevant, aber seine Rolle bei Osteoklasten in vivo bleibt schlecht definiert. Um den in vivo-Beweis dafür zu liefern, dass STAT3 an der Osteoklastdifferenzierung und dem Knochenstoffwechsel beteiligt ist, haben wir ein osteoklastspezifisches Stat3-Löschmausmodell (Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre) und analysierte seinen Skelett-Phänotyp. Mikro-CT-Scanning und 3D-Rekonstruktion implizierten eine erhöhte Knochenmasse in den bedingten Knockout-Mäusen. H&E-Färbung, Calcein und Alizarin rote Doppelfärbung, und tartrate-resistente Säurephosphatase (TRAP) Färbung wurden durchgeführt, um Knochenstoffwechsel zu erkennen. Kurz gesagt, beschreibt dieses Protokoll einige kanonische Methoden und Techniken zur Analyse des Skelettphäpnotyps und zur Untersuchung der kritischen Gene, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern.

Einleitung

Skelettknochen ist das Haupttragende Organ des menschlichen Körpers und steht unter Druck sowohl der inneren als auch der äußeren Umgebung während des Gehens und der Übung¹. Das ganze Leben über gehen die Knochen kontinuierlich durch Selbsterneuerung, die durch Osteoblasten und Osteoklasten ausgeglichen wird. Der Prozess der Osteoklasten, die alte Knochen und Osteoblasten, die neue Knochen bilden, beseitigt, behält die Homöostase und mechanische Funktion des Skelettsystems². Störungen im Gleichgewicht können Knochenstoffwechselerkrankungen wie Osteoporose auslösen. Osteoporose, die durch übermäßige osteoklastische Aktivität verursacht wird, ist weltweit verbreitet und verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste für die Gesellschaft^2,3,4. Nach der begrenzten Anzahl von Medikamenten für osteoporose Behandlung und ihr Risiko von Nebenwirkungen⁴, Ist es wichtig, die Details der Osteoklastbildung und Aktivität zu enthüllen.

Osteoklasten, die aus der hämatopoetischen Abstammung monozyt/makrophage abgeleitet sind, haben mehrere Kerne (können 2 bis 50 Kerne haben) und sind groß (in der Regel größer als 100 m im Durchmesser)². Obwohl die Erforschung von Mechanismen und das Screening von Medikamenten auf osteoklastische Störungen durch in vitro Osteoklastkultur weitgehend verbessert wurden, machen die komplizierten organischen Reaktionen in vivo Beweise für die zielgerichtete Therapie unverzichtbar. Aufgrund genetischer und pathophysiologischer Ähnlichkeiten zwischen Mäusen und Menschen werden gentechnisch veränderte Mausmodelle häufig zur Untersuchung der Mechanismen und der pharmazeutischen Behandlung menschlicher Krankheiten in vivo⁶verwendet. Das Cre-loxP-System ist eine weit verbreitete Technologie zur Mausgenbearbeitung und hat es Forschern ermöglicht, Genfunktionen gewebe-/zellspezifisch zu untersuchen⁵. Cathepsin K (CSTK) ist eine Cystein-Protease, die von Osteoklasten abgesondert wird, die Knochenkollagen^abbauenkönnen 8 . Es ist allgemein anerkannt, dass CTSK selektiv in reifen Osteoklasten exprimiert wird; Daher gelten Ctsk-Cre-Mäuse als nützliches Werkzeug für funktionelle Studien von Osteoklasten und wurden⁶verwendet.

Der Signalgeber und Aktivator der Transkriptionsfamilie (STAT) ist klassisch und sehr signifikant in der Immunität und Krebsprogression und -entwicklung^7,8. Unter sieben STATs ist STAT3 als die relevanteste für die Knochenhomöostase^9,10. Mehrere In-vivo-Studien haben berichtet, dass die spezifische Inaktivierung von STAT3 bei Osteoblasten die Knochenbildung^{verringert 9,10}. Dennoch sind solide Beweise für die Beteiligung von STAT3 an der Osteoklastbildung und am Knochenstoffwechsel in vivo nach wie vor begrenzt. Kürzlich haben wir in vivo-Beweise mit einem osteoklastspezifischen Stat3-Löschmausmodell (Stat3^fl/fl; Ctsk-Cre, im Folgenden Stat3^Ctskgenannt,dass STAT3 an der Osteoklastdifferenzierung und dem Knochenstoffwechsel¹¹beteiligt ist. In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Methoden und Protokolle, mit denen wir die Veränderungen der Knochenmasse, der Knochenhistomorphologie und des Knochenanabolismus und katabolismus der Stat3^Ctsk-Mäuse analysiert haben, um den Einfluss der osteoklastspezifischen STAT3-Deletion auf die Knochenhomöostase zu untersuchen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden zu den hier beschriebenen Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Shanghai Jiaotong University School of Medicine genehmigt.

1. Züchtung von Osteoklast-spezifischen Stat3-Löschmäusen

HINWEIS: Stat3^fl/fl Mäuse wurden kommerziell gewonnen. Ctsk-Cre Mäuse wurden von S. Kato (Universität Tokio, Tokio, Japan¹²) zur Verfügung gestellt. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der institutionellen Tieranlage unter standardisierten Bedingungen gezüchtet und gepflegt.

1. Paarn Sie eine geschlechtsreife männliche Maus mit zwei gleichaltrigen weiblichen Mäusen. Nach 18 Tagen, überprüfen Sie täglich Kontrollen für Neugeborene. Trennen Sie die schwangeren weiblichen Mäuse und halten Sie sie bei Bedarf allein. Ändern Sie männliche Mäuse zwischen verschiedenen Zuchtkäfigen, wenn die weiblichen Mäuse nicht innerhalb von 1 Monat nach der Paarung schwanger waren.
2. Kreuz Stat3^fl/fl Mäuse zu Ctsk-Cre Mäusen (F0). Clip die Schwänze für genotypisieren und halten Sie die männlichen Stat3^{fl /+}; Ctsk-Cre Mäuse, bis sie geschlechtsreif sind, was etwa 6 Wochen alt ist (F1). Verwenden Sie die folgenden Primer: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
3. Kreuz 6-Wochen-alte männliche Stat3^{fl /+};; Ctsk-Cre-Mäuse mit weiblichen Stat3^fl/fl Mäusen. Clip die Schwänze für genotyping und halten Sie die männlichen Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre Mäuse, bis sie geschlechtsreif sind, was etwa 6 Wochen alt ist (F2).
4. Kreuz 6-Wochen-alte männliche Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre-Mäuse mit weiblichen Stat3^fl/fl Mäusen (F3). Schneiden Sie die Schwänze für die Genotypisierung ab und ersetzen Sie die alten Zuchtmäuse rechtzeitig durch jüngere Mäuse (F3+N).

2. Probensammlung

1. Euthanisieren Sie sechs Paare von 8 Wochen alten männlichen Stat3^fl/fl und Stat3^Ctsk Littermate Mäuse getrennt mit Kohlendioxid-Erstickung.
   HINWEIS: Der_{CO2-Durchfluss} verschiebt 30 % des Käfigvolumens pro Minute (z. B. für 45 cm x 30 cm x 30 cm Käfig beträgt der_{CO2-Durchfluss} 40 L/min).
2. Setzen Sie die Mäuse in eine Supine-Position. Dislozieren Sie die bilateralen Hüftgelenke sanft von Hand. Verwenden Sie eine augenheilbe, um die Haut vertikal von der distalen Tibia abzuschneiden und dann die gesamte Haut von der Hintergliedse zu sezieren.
3. Schneiden Sie das Gelenkband des rechten Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere ab, um die Hinterbeine zu trennen. Schneiden Sie den Trochanter und die Kreuzung der Fibel und tauchen Sie dann die hintere Gliedmaße in 4% Paraformaldehyd ein. Halten Sie die rechten Hinterbeine für Schritt 3. Schneiden Sie den Knochen an beiden Enden angemessen ab, um vollständig einzutauchen und das Knochenmark mit 4% Paraformaldehyd zu fixieren.
4. Schneiden Sie das Gelenkband des linken Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere, entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe und trennen Sie die Tibia und den Oberschenkelknochen vorsichtig. Tibia und Oberschenkelknochen getrennt in 75% Ethanol eintauchen. Halten Sie die Femora für Schritt 4 und Tibiafür Schritt 6. Achten Sie darauf, den Trochanter intakt zu halten.

3. Paraffin-Sektionsvorbereitung

1. Fixieren Sie die rechte Hintergliedmaße in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 48 h.
2. Entkalkung: Waschen Sie die Proben mit 1x PBS 10 min 3 mal. Entkalkung der Proben in 15% EDTA (150 g EDTA in 800 ml ddH₂O und 100 ml 10x PBS) mit einem Ultraschallentkalkungsmittel für 3 bis 4 Wochen, bis die Knochen gebogen werden können. Ersetzen Sie es jeden zweiten Tag durch frische entkalkende Flüssigkeit.
3. Waschen Sie die Proben 3x mit 1x PBS vorsichtig und tauchen Sie sie dann über Nacht bei 4 °C in 75% Ethanol ein.
4. Dehydrieren: Am zweiten Tag tauchen Die Proben sequenziell in 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol, jeweils für 1 h zweimal.
5. Eintauchen von Proben in 1/2 Xylol 1/2 Paraffin für 30 min. Tauchen Sie die Proben über Nacht bei 65 °C in Paraffin ein.
6. Einbetten: Wählen Sie einen geeigneten Einbettungsbehälter zum Einbetten aus. Legen Sie die Tibia gleichmäßig darunter. Legen Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia in einem Winkel von 90°. Nachdem das Paraffin vollständig abgekühlt und verfestigt ist, entfernen Sie es aus dem Einbettbehälter. Nummerieren Sie die Proben und lagern Sie sie bei -20 °C über Nacht.
7. Schneiden Sie mit dem Mikrotome die 5 m dicken Abschnitte kontinuierlich ab. Schneiden Sie 20–40 Abschnitte. Die Abschnitte auf 37 °C Wasser verteilen, an Mikroskopschlitten kleben und über Nacht bei 42 °C backen.

4. Micro-CT-Scannen und -Analyse

1. Scannen Sie die linke Femora mit einem Mikro-CT-Scanner. Auflösung: 10 m; Spannung: 70 kV; Strom: 114 A; Fliter: 0,5 mm Al; Rotationsschritt: 0,5°.
2. Rekonstruieren Sie 3D-Bilder des kortikalen Knochens und des Trabeekularknochens mithilfe der unterstützenden Software des Scanners, die der Anweisung des Herstellers folgt. ROIs sind in einer Gesamtbreite von 1 mm Trabecularknochen in der Nähe der distalen Wachstumsplatte und in einem insgesamt 1 mm breiten Abschnitt des kortikalen Knochens in der Mitte der Femora.
3. Berechnen Sie die quantitativen Mikroarchitekturparameter: Knochenmineraldichte (BMD), Knochenvolumenfraktion (BV/TV), trabekuläre Dicke (Tb.Th.), Trabeekularzahl (Tb.N.), Trabeekulartrennung (Tb.Sp.) und kortikale Knochendicke (Ct.Th.).

5. TRAP Färbung

1. Die Paraffinabschnitte bei 65 °C 30 min backen.
2. Dewax: Tauchen Sie die Abschnitte in Xylol für 10 min ein. Führen Sie diesen Schritt 3x mit frischem Xylol aus.
3. Rehydratisieren: Tauchen Sie die Abschnitte sequenziell in 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und ddH₂O ein, jeweils für 5 min zweimal.
4. Bereiten Sie die Färbelösung mit dem TRAP-Färbeset nach den Anweisungen des Herstellers vor und erwärmen Sie sich auf 37 °C.
   HINWEIS: Trap-Färbungslösung sollte unmittelbar vor jedem Test frisch zubereitet werden.
5. Fügen Sie jeder Probe eine Färbelösung von 50 –100 °L hinzu und in einer 37 °C feuchten Kammer für 20–30 min. Überprüfen Sie alle 5 min den Färbestatus der Osteoklasten unter einem Lichtmikroskop, bis rote mehrkernige Osteoklasten zu sehen sind. Beenden Sie die Reaktion mit ddH₂O.
6. Gegenfleck in Hämatoxylinlösung für 30 s. Erstellen Sie eine stabile blaue Farbe durch Eintauchen in 1% Ammoniaklösung für 1 min. In langsam fließendem Leitungswasser abspülen.
7. Montieren Sie die Abschnitte mit Deckellipsen mit neutralem Balsam und trocknen Sie sie über Nacht.
8. Erfassen Sie 3–5 Interessenfelder mit einem Mikroskop. Analysieren Sie den trabekulären Umfang nach Bild J: Messen Sie die Länge des Maßstabsbalkens (Ls) mit dem Werkzeug 'gerade Linie' als L1, und messen Sie dann die Länge des trabekulären Umfangs mit dem Werkzeug 'Segmentlinie' als L2, die physikalische Länge (Lp)= Ls*L2 /L1). Zählen Sie die Anzahl der TRAP-positiven Zellen mit mehr als drei Kernen.

6. Calcein und Alizarin rot Doppelbeschriftung

1. Probenzubereitung: Intraperitoneal injizieren 20 mg/kg Calcein (1 mg/ml in 2% NaHCO₃ Lösung) am Tag 0 und 25 mg/kg Alizarin rot S (AL, 2 mg/ml in H₂O) am 4. Tag. Opfern Sie Mäuse an Tag 7. Die Tibia emittieren vorsichtig und fixieren Sie 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 48 h.
2. Dehydrieren: Nach der Fixierung die Tibiae 3x vorsichtig mit 1x PBS waschen. Die Proben sukzessive in 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol für 5 min zweimal getrennt eintauchen.
3. Die Proben in Aceton für 12 h, in 1/2 Aceton 1/2 Harz für 2 h und in ReinemHarz in einem Trockenofen über Nacht eintauchen.
   HINWEIS: Das Harz wurde aus handelsüblichem Harz (z. B. Embed 812 Resin) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.
4. Einbetten: Fügen Sie reines Harz in einen geeigneten Kieselgel-Einbettungstank ein und legen Sie die Proben vorsichtig auf, um Blasen zu vermeiden. Polymerisieren Sie das Harz in einem Trockenofen bei 60 °C für 48 h.
5. Schneiden Sie die Proben mit einem rotierenden Mikrotom kontinuierlich in 5 m dicke Abschnitte. Den Rest der Proben mit Desiccant bei Raumtemperatur aufbewahren.
6. Halten Sie die Abschnitte mit Pinzette in einem Tropfen von 75% Alkohol. Montieren Sie die Abschnitte mit Abdeckungen mit neutralem Balsam. Erfassen Sie die rote und grüne Fluoreszenzbeschriftung mit einem Fluoreszenzmikroskop.
7. Messen Sie die Breite zwischen zwei Beschriftungslinien (Ir.L.Wi), einbeschrifteten trabekulären Umfang (sL.Pm), doppelbeschrifteten trabekulären Umfang (dL.Pm) und dem gesamten trabekulären Umfang (Tb.Pm). Berechnen Sie die Mineralappositionsrate (MAR) und die Knochenbildungsrate (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/Intervalltage. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.

Ergebnisse

Mit Hilfe des vorliegenden Protokolls wurden osteoklastspezifische Stat3-Deletionsmäuse generiert, um den Einfluss der STAT3-Deletion auf die Osteoklastdifferenzierung zu untersuchen. Stat3^Ctsk Mäuse und ihre Wildtyp (WT) Littermates wurden gezüchtet und nach Genotypisierung gehalten. Knochenmarkmakrophagen wurden isoliert und zu Osteoklasten kultiviert, und stat3-Deletion bei Stat3^Ctsk-Mäusen wurde nachgewiesen (Abbildung 1

Diskussion

Genetisch entwickelte Mausmodelle werden häufig für die Untersuchung des Mechanismus und der pharmazeutischen Behandlung menschlicher Krankheiten verwendet¹³. Ctsk-Cre Mäuse wurden weit verbreitet für funktionelle Studien von Osteoklasten⁶verwendet. Die vorliegende Studie beschrieb die Protokolle der Methoden zur Analyse des Skelettphänotyps und zur Untersuchung der kritischen Gene, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern.

Hist...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde solution	Sangon biotech Co., Ltd.	E672002
Acetone	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	80000360
Alizarin	Sigma-Aldrich	A5533
Ammonia solution	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA	Electron Microscopy Sciences	13710
DeCa RapidlyDecalcifier	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
EDTA	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 RESIN	Electron Microscopy Sciences	14900
fluorescence microscope	Olympus	IX73
Hematoxylin solution	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μCT 80
NaHCO3	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	10018918
Neutral balsam	Sangon biotech Co., Ltd.	E675007
NMA	Electron Microscopy Sciences	19000
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
rotary microtome	Leica	RM2265
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
xylene	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	1330-20-7