조건부 Stat3 삭제 마우스 모델의 골격 표현형 분석

요약

이 프로토콜은 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 이해하는 정식 방법을 설명합니다. 이 방법은 형질 형형과 일부 표준 기술을 사용하여 골격 표현형을 분석합니다.

초록

트랜스제닉 마우스 모델은 골세포 분화 및 활동을 제어하는 중요한 유전자를 이해하고 골다공증의 메커니즘 및 제약 치료를 연구하는 데 강력합니다. 카테핀 K (Ctsk)-Cre 마우스는 골세포의 기능적 연구에 널리 사용되어 왔다. 전사 3(STAT3)의 신호 변환기 및 활성화기는 뼈 항상성에서 관련이 있지만 생체 내의 골막세포에서의 역할은 제대로 정의되지 않습니다. STAT3가 골세포 분화 및 뼈 대사에 참여한다는 생체 내 증거를 제공하기 위해, 우리는 골세포별 Stat3 삭제 마우스모델(Stat3 ^fl/fl;; Ctsk-Cre)및 골격 표현형을 분석하였다. 마이크로 CT 스캐닝 및 3D 재구성은 조건부 녹아웃 마우스에서 골질량을 증가시묵화하였다. H&E 염색, 칼세인 및 알리자린 레드 더블 염색, 타르타르트 내성 산 인산인산(TRAP) 염색이 뼈 대사를 검출하기 위해 수행되었다. 요컨대, 이 프로토콜은 골격 표현형을 분석하고 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 연구하기 위해 몇 가지 표준 방법과 기술을 설명합니다.

서문

골격 뼈는 인체의 주요 하중 베어링 기관이며 걷기 및 운동 중 내부 및 외부 환경 모두에서 압력을 받고^{있다 1.} 평생 동안 뼈는 계속해서 자체 재생을 거치며, 이는 골세포와 골세포에 의해 균형을 이룹니다. 새로운 뼈를 형성하는 오래된 뼈와 골세포를 지우는 골세포의 과정은 골격 시스템^2의항상성 및 기계적 기능을 유지한다. 균형에 장애가 골다공증과 같은 뼈 대사 질환을 유발할 수 있습니다. 골다공증은 과도한 골세포 활성으로 인해 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 사회^2,3,4에상당한 경제적 손실을 초래합니다. 골다공증 치료에 사용할 수 있는 약물의 제한된 수와 부작용의 그들의 위험^4에따르면, 골다세포 형성 및 활동의 세부 사항을 공개 하는 것이 중요 하다.

단핵세포/대식세포 조혈 계보로부터 유래된 골세포는 다중 핵(2~50개의 핵을 가질 수 있음)을 가지며 큰(보통 직경 100 μm 이상)^2. 기전의 탐구와 골세포 질환에 대한 약물의 검열은 체외 골세포 문화를 통해 널리 개선되었지만, 복잡한 유기 반응은 표적 치료에 필수적불가결한 생체 내 증거를 만듭니다. 마우스와 인간 사이의 유전적 및 병리학적 유사성으로 인해, 유전자 조작 마우스 모델은 일반적으로 생체 내에서 인간 질환의 메커니즘 및 약제 학적 치료를 연구하는 데 사용된다^6. Cre-loxP 시스템은 마우스 유전자 편집을 위해 널리 사용되는 기술이며 연구자들이 조직/세포 별 방식으로 유전자 기능을 조사할 수 있게 해 주었다^5. 카테프신 K(CSTK)는 골콜라겐^8을저하시킬 수 있는 골세포에 의해 분비된 시스테인 프로테아제이다. CTSK가 성숙한 골세포에서 선택적으로 표현된다는 것은 잘 받아들여진다. 따라서, Ctsk-Cre 마우스는 골세포에 대한 기능적 연구를 위한 유용한 도구로 간주되고^6.

전사(STAT) 제품군의 신호 트랜스듀서 및 활성화기는 면역 및 암 진행 및 개발^7,8에서고전적으로 매우 유의하다. 7개의 STAT 중 STAT3는 뼈 항상성^9,10과가장 관련이 있는 것으로 보고됩니다. 여러 생체 내 연구는 골세포에서 STAT3의 특정 불활성화가 뼈 형성^9,10을감소시키는 것으로 보고되었다. 그럼에도 불구 하 고, osteoclast 형성및 생체 내 뼈 대사에 STAT3의 참여에 관한 확실한 증거는 여전히 제한. 최근에는 osteoclast-특정 Stat3 삭제 마우스모델(Stat3^fl/fl;)과함께 생체 내 증거를 제공했습니다. Ctsk-Cre, 이하 Stat3^Ctsk)라고불리는STAT3는 골세포 분화 및 뼈^{대사(11)에}참여한다. 본 연구에서는, 뼈 집상성에 대한 골세포별 STAT3 삭제의 영향을 연구하기 위해 Stat3^Ctsk 마우스의 뼈 질량, 뼈 조직화 및 뼈 분석및 이화작용의 변화를 분석하는 데 사용한 방법과 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 동물에 관한 모든 방법은 상하이 자오퉁 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1. 골세포 특정 Stat3 삭제 마우스의 사육

참고: Stat3^fl/fl 마우스는 상업적으로 수득하였다. Ctsk-Cre 마우스는 S. 카토 (도쿄 대학, 도쿄, 일본^12)에의해 제공되었다. 마우스는 표준화된 조건하에서 기관 동물 시설에서 특정 병원체가 없는 (SPF) 조건하에서 사육되고 유지되었다.

1. 같은 나이의 두 여성 마우스와 성적으로 성숙한 남성 마우스를 쌍. 18 일 후, 신생아에 대한 매일 검사를 확인하십시오. 임신 한 여성 마우스를 분리하고 필요한 경우 혼자 보관하십시오. 암컷 마우스가 페어링의 1 달 이내에 임신하지 않은 경우 다른 사육 케이지 중 남성 마우스를 변경합니다.
2. 크로스 Stat3^fl/fl 마우스 Ctsk-Cre 마우스 (F0). 지노티핑을 위해 꼬리를 자르고 남성 Stat3^{fl /+}유지; Ctsk-Cre 마우스는 성적으로 성숙할 때까지 생쥐이며, 이는 약 6주(F1)입니다. 다음 프라이머사용: Stat3 F-TTGACCTGTTCCTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA Stat3 R-CCCTAGATTAGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCCGTTCGTTCGTTC.
3. 십자가 6 주 된 남성 Stat3^fl/+; 여성 Stat3^fl/fl 마우스를 가진 Ctsk-Cre 마우스. 지노티핑을 위해 꼬리를 자르고 남성 Stat3 ^fl/fl을유지하십시오. Ctsk-Cre 마우스는 성적으로 성숙할 때까지 생쥐이며, 이는 약 6주(F2)입니다.
4. 크로스 6 주 된 남성 Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre 마우스 와 여성 Stat3^fl/fl 마우스 (F3). 지노티핑을 위해 꼬리를 자르고 오래된 번식 마우스를 시간에 젊은 쥐로 교체하십시오 (F3 +N).

2. 표본 수집

1. 8주 된 남성 Stat3^fl/fl 및 Stat3^Ctsk 쓰레기메이트 마우스6쌍을 이산화탄소 질식으로 분리하여 안락사시합니다.
   참고: CO₂ 유량은 분당 케이지 볼륨의 30%를 대체합니다(예: 45cm x 30cm x 30cm 케이지의 경우_CO2 유량은 40L/min)입니다.
2. 마우스를 척추 위치에 놓습니다. 손으로 양자 엉덩이 관절을 부드럽게 탈바릅니다. 안과 가위를 사용하여 경골에서 수직으로 피부를 잘라낸 다음 뒷다리에서 전체 피부를 해부합니다.
3. 뒷다리를 분리하기 위해 가위로 오른쪽 엉덩이 관절과 무릎 관절의 관절 인대를 잘라냅니다. 트로챈터와 비골의 접합을 잘라낸 다음 뒷다리를 4% 파라포름알데히드에 담가 두습니다. 3단계에서 오른쪽 뒷다리를 유지합니다. 적절하게 완전히 몰입하고 4 % 파라 포름 알데히드로 골수를 고정하기 위해 양쪽 끝에서 뼈를 잘라.
4. 왼쪽 엉덩이 관절과 무릎 관절의 관절 인대를 가위로 자르고 연조직을 부드럽게 제거하고 경골과 대퇴골을 조심스럽게 분리합니다. 75%의 에탄올에 경골과 대퇴골을 따로 담급다. 단계 4에 대한 페모라를 유지하고 단계 6경골. 트로챈터를 그대로 유지하십시오.

3. 파라핀 섹션 준비

1. 오른쪽 뒷다리를 4°C에서 48h로 수정합니다.
2. 데칼시피: 1x PBS로 시편을 10분 3회 부드럽게 세척합니다. 15% EDTA(ddH₂O의 800mL에서 150g EDTA, 10x PBS의 100mL)로 시편을 3~4주 동안 초음파 탈량제로 하여 뼈가 구부러질 수 있다. 매일 신선한 탈균 액으로 대체하십시오.
3. 1x PBS로 시편을 3배 부드럽게 씻은 다음 하룻밤 사이에 4°C에서 75% 에탄올에 담가 두십시오.
4. 탈수: 둘째 날에는 각각 1시간 씩 95% 에탄올, 100% 에탄올, 자일렌으로 시편을 순차적으로 담급니다.
5. 표본을 1/2 자일렌 1/2 파라핀에 30분 동안 담가 두어 두드셔도 됩니다. 하룻밤 사이에 65°C에서 파라핀에 표본을 담그면 됩니다.
6. 포함: 포함에 적합한 포함 탱크를 선택합니다. 경골을 균일하게 아래에 놓습니다. 대퇴골과 경골을 90° 각도로 놓습니다. 파라핀이 완전히 냉각되고 고화된 후 포함 탱크에서 제거합니다. 표본을 번호로 하룻밤 동안 -20 °C에 저장합니다.
7. 마이크로토메를 사용하여 5 μm 두께의 부분을 지속적으로 절단합니다. 20-40 섹션을 잘라. 37°C 물에 섹션을 확산하고 현미경 슬라이드에 부착하고 하룻밤 사이에 42 °C에서 구우십시오.

4. 마이크로 CT 스캐닝 및 분석

1. 마이크로 CT 스캐너로 왼쪽 페모라를 스캔합니다. 해상도: 10 μm; 전압 : 70 kV; 전류: 114 μA; 플리터: 0.5mm 알; 회전 단계: 0.5°.
2. 제조업체의 지시에 따라 스캐너의 지원 소프트웨어를 사용하여 피질 뼈와 좌골 뼈의 3D 이미지를 재구성합니다. ROI는 말단 성장 플레이트에 가깝고 페모라 의 중간에 피질 뼈의 총 1mm 폭에 있습니다.
3. 정량적 미세 아키텍처 매개 변수를 계산: 뼈 미네랄 밀도 (BMD), 뼈 볼륨 분획 (BV/TV), 궤적 두께 (Tb.Th.), 궤적 수 (Tb.N.), 궤적 분리 (Tb.Sp.), 및 피질 뼈 두께 (Ct.Th.).

5. 트랩 염색

1. 파라핀 섹션을 65°C에서 30분간 굽습니다.
2. 데왁스: 10분 동안 자일렌에 섹션을 담그세요. 신선한 자일렌으로 이 단계를 3배 수행합니다.
3. 재수화: 100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, ddH₂O로 섹션에 순차적으로 몰입하여 각각 5분 동안 두 번 담가 두 번.
4. 제조업체의 지시에 따라 TRAP 염색 키트를 사용하여 염색 용액을 준비하고 37°C로 따뜻하게 합니다.
   참고: TRAP 염색 솔루션은 모든 분석 전에 즉시 신선하게 준비해야 합니다.
5. 각 샘플에 50-100 μL 염색 용액을 추가하고 20-30 분 동안 37 ° C 습한 챔버에 배양하십시오. 붉은 다핵 골세포가 보일 때까지 5 분마다 가벼운 현미경으로 골의 염색 상태를 확인하십시오. ddH₂O로 반응을 종료합니다.
6. 30 s용 헤마톡시린 용액의 카운터스테인. 1% 암모니아 용액에 1분간 침수하여 안정적인 청색을 연출합니다. 천천히 흐르는 수돗물로 헹구는 다.
7. 중성 발삼을 사용하여 커버립으로 섹션을 마운트하고 밤새 건조하십시오.
8. 현미경으로 관심 있는 3-5 필드를 캡처합니다. 이미지 J에 의해 궤적 둘레를 분석: L1로'직선'도구를 사용하여 스케일 바(Ls)의 길이를 측정한 다음,'분할된 선'도구를 L2, 물리적 길이(Lp)로 사용하여 적혈구 둘레의 길이를 측정합니다. 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성 세포의 수를 계산합니다.

6. 칼신과 알리자린 레드 더블 라벨링

1. 표본 제제: 0일째에 20 mg/kg 칼세인(1 mg/mL in 2% NaHCO₃ 솔루션)과 25 mg/kg 알리자린 레드 S(AL, 2 mg/mL in H₂O)를 4일째에 주입한다. 7일째에 마우스를 희생하십시오. 경골을 조심스럽게 분리하고 48 h에 대한 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다.
2. 탈수: 고정 후, 경골 3배를 PBS 1x로 부드럽게 씻으십시오. 표본을 95% 에탄올, 100% 에탄올, 자일렌으로 5분 동안 따로 담가.
3. 12시간 동안 아세톤에 표본을 담그고, 1/2 아세톤 1/2 수지에서 2시간 동안, 그리고 밤새 건조 오븐에 순수한 수지에 담가 두십시오.
   참고: 수지는 제조업체의 지침에 따라 시판되는 수지(예: 812 수지 포함)에 의해 제조되었습니다.
4. 포함: 퓨어 수지를 적합한 실리카 젤 포함 탱크에 넣고 거품을 피하기 위해 표본을 부드럽게 배치합니다. 48h에 대해 60°C에서 건조 오븐에서 수지를 중합한다.
5. 회전 마이크로토메로 시편을 5 μm 두께의 섹션으로 지속적으로 절단합니다. 나머지 샘플을 실온에서 건조제로 저장합니다.
6. 75%의 알코올을 한 방울로 핀셋으로 섹션을 준수하십시오. 중립 발삼을 사용하여 커버립으로 섹션을 마운트합니다. 형광 현미경으로 적색 및 녹색 형광 라벨을 캡처합니다.
7. 두 라벨링 라인(Ir.L.Wi), 단일 라벨이 부착된 반구 둘레(sL.Pm), 이중 라벨이 부착된 관두(dL.Pm) 및 총 반구 경계(Tb.Pm)사이의 너비를 측정합니다. 미네랄 정수 속도(MAR) 및 뼈 형성 속도(BFR/BS)를 계산합니다. MAR = Ir.L.Wi/간격 일. BFR/BS= (dL.Pm±SL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100%.

결과

본 프로토콜을 이용하여, osteoclast 특이적 Stat3 삭제 마우스는 골세포 분화에 STAT3 삭제의 영향을 연구하기 위해 생성되었다. Stat3^Ctsk 마우스와 그들의 야생형 (WT) 쓰레기는 유전자를 지운 후에 사육되고 유지되었습니다. 골수 대식세포는 골수 세포로 분리되고 배양되었고, Stat3^Ctsk 마우스에서 STAT3삭제가 입증되었다(도1).

토론

유전자 조작 마우스 모델은 일반적으로 인간 질환의 메커니즘 및 약제 학적 치료를 연구하는 데^{사용된다(13)}. Ctsk-Cre 마우스는 골세포^6의기능적 연구에 널리 사용되어 왔다. 본 연구는 골격 표현형을 분석하고 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 연구하는 방법의 프로토콜을 설명했다.

조직학적 분석은 뼈 대사를 감...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde solution	Sangon biotech Co., Ltd.	E672002
Acetone	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	80000360
Alizarin	Sigma-Aldrich	A5533
Ammonia solution	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA	Electron Microscopy Sciences	13710
DeCa RapidlyDecalcifier	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
EDTA	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 RESIN	Electron Microscopy Sciences	14900
fluorescence microscope	Olympus	IX73
Hematoxylin solution	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μCT 80
NaHCO3	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	10018918
Neutral balsam	Sangon biotech Co., Ltd.	E675007
NMA	Electron Microscopy Sciences	19000
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
rotary microtome	Leica	RM2265
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
xylene	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	1330-20-7