Análise do fenótipo esquelético de um modelo de rato de exclusão stat3 condicional

Resumo

Este protocolo descreve um método canônico para entender os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo. Este método utiliza um modelo de camundongo transgênico e algumas técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético.

Resumo

Modelos de camundongos transgênicos são poderosos para entender os genes críticos que controlam a diferenciação e atividade osteoclante, e para estudar mecanismos e tratamentos farmacêuticos da osteoporose. Os camundongos Cathepsin K (Ctsk)-Cre têm sido amplamente utilizados para estudos funcionais de osteoclatos. O transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) é relevante na homeostase óssea, mas seu papel nos osteoclas in vivo permanece mal definido. Para fornecer a evidência in vivo de que o STAT3 participa da diferenciação osteoclasta e do metabolismo ósseo, geramos um modelo de rato de exclusão Stat3 específico do osteoclasta(Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre) e analisou seu fenótipo esquelético. A varredura microcsi tomografia e a reconstrução 3D implicaram aumento da massa óssea nos camundongos eliminatórios condicionais. Foram realizadas colorações de H&E, re coloração dupla de calceína e alizarina vermelha e coloração de fosfattase de ácido resistente a tartaratos (TRAP) para detectar o metabolismo ósseo. Em suma, este protocolo descreve alguns métodos e técnicas canônicas para analisar o fenótipo esquelético e estudar os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo.

Introdução

O osso esquelético é o principal órgão portador de carga do corpo humano e está sob pressão do ambiente interno e externo durante a caminhada e o exercício¹. Ao longo de sua vida, os ossos passam continuamente pela auto-renovação, que é equilibrada por osteoblastos e osteoclartos. O processo de osteoclasstos limpando ossos velhos e osteoblastos formando novos ossos mantém a homeostase e a função mecânica do sistema esquelético². A perturbação no equilíbrio pode induzir doenças metabólicas ósseas, como a osteoporose. A osteoporose, causada pelo excesso de atividade osteoclástica, é globalmente prevalente e causa perdas econômicas substanciais para a sociedade^2,3,4. De acordo com o número limitado de medicamentos disponíveis para o tratamento da osteoporose e seu risco de efeitos adversos⁴, é importante desvendar os detalhes da formação e atividade do osteoclato.

Os osteoclatos derivados da linhagem hematopoiética monócito/macrófago têm múltiplos núcleos (podem ter de 2 a 50 núcleos) e são grandes (geralmente maiores que 100 μm de diâmetro)². Embora a exploração de mecanismos e a triagem de medicamentos para distúrbios osteoclásticos tenham sido amplamente melhoradas através da cultura osteoclasta in vitro, as complicadas reações orgânicas tornam a evidência in vivo indispensável para a terapia-alvo. Devido às semelhanças genéticas e fisiopacionológicas entre camundongos e humanos, modelos de camundongos geneticamente modificados são comumente utilizados para estudar os mecanismos e os tratamentos farmacêuticos da doença humana in vivo⁶. O sistema Cre-loxP é uma tecnologia amplamente utilizada para edição de genes de camundongos e permitiu que os pesquisadores investigassem funções genéticas de forma específica de tecido/célula⁵. Cathepsin K (CSTK) é uma protease de cisteína secretada por osteoclartos que pode degradar colágeno ósseo⁸. É bem aceito que o CTSK seja expresso seletivamente em osteoclastos maduros; portanto, os camundongos Ctsk-Cre são considerados uma ferramenta útil para estudos funcionais de osteoclatos e tem sido utilizado⁶.

O transdutor de sinal e ativador da família de transcrição (STAT) é clássico e altamente significativo em imunidade e progressão e desenvolvimento do câncer^7,8. Entre os sete STATs, o STAT3 é relatado como o mais relevante para a homeostase^{óssea 9,10}. Vários estudos in vivo relataram que a inativação específica do STAT3 nos osteoblastos diminui a formação^{óssea 9,10}. No entanto, as evidências sólidas sobre a participação do STAT3 na formação de osteoclatos e metabolismo ósseo in vivo ainda são limitadas. Recentemente, fornecemos evidências in vivo com um modelo de mouse de exclusão Stat3 específico do osteoclasta(Stat3^fl/fl; Ctsk-Cre, a partir de agora chamado Stat3^Ctsk) que o STAT3 participa da diferenciação osteoclasta e do metabolismo ósseo¹¹. No presente estudo, descrevemos os métodos e protocolos que utilizamos para analisar as alterações na massa óssea, histomorfologia óssea e anabolismo ósseo e catabolismo dos camundongos Stat3^Ctsk, a fim de estudar a influência da exclusão STAT3 específica do osteoclato na homeostase óssea.

Protocolo

Todos os métodos relacionados aos animais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Xangai Jiaotong.

1. Reprodução de camundongos de exclusão Stat3 específicos do assino

NOTA: Os ratos Stat3^fl/fl foram obtidos comercialmente. Os camundongos Ctsk-Cre foram fornecidos pela S. Kato (Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão¹²). Os camundongos foram criados e mantidos sob condições específicas sem patógenos (FPS) na instalação institucional de animais em condições padronizadas.

1. Emparelhe um rato macho sexualmente maduro com duas fêmeas da mesma idade. Após 18 dias, verifique diariamente os cheques para recém-nascidos. Separe os camundongos fêmeas grávidas e mantenha-o sozinho, se necessário. Mude os camundongos machos entre diferentes gaiolas de reprodução se os camundongos fêmeas não estivessem grávidas dentro de um mês do emparelhamento.
2. Cruze ratos^{fl/fl de} Stat3para ratos Ctsk-Cre (F0). Corte as caudas para genotipagem e mantenha o Stat3^{fl/+ ;}masculino Camundongos Ctsk-Cre até que estejam sexualmente maduros, que tem cerca de 6 semanas de idade (F1). Use os seguintes primers: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAAAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
3. Cruze 6 semanas de idade masculino Stat3^fl/+; Camundongos Ctsk-Cre com ratos Stat3^fl/fl femininos. Corte as caudas para genotipagem e mantenha o Stat3 ^fl/flmasculino; Camundongos Ctsk-Cre até que estejam sexualmente maduros, que tem cerca de 6 semanas de idade (F2).
4. Cruz 6-week-old masculino Stat3 ^fl/fl; Camundongos Ctsk-Cre com ratos Stat3^fl/fl fêmeas (F3). Corte as caudas para genotipagem e substitua os camundongos de criação antigos por camundongos mais jovens com o tempo (F3+N).

2. Coleta de espécimes

1. Eutanize seis pares de 8 semanas de idade Stat3^fl/fl e Stat3^Ctsk lixo-mate ratos separadamente com asfixia por dióxido de carbono.
   NOTA: A taxa de fluxo de CO₂ desloca 30% do volume da gaiola por minuto (por exemplo, para 45 cm x 30 cm x 30 cm de gaiola a taxa de fluxo de CO₂ é de 40 L/min).
2. Coloque os ratos em uma posição supina. Desloque as articulações bilaterais do quadril suavemente à mão. Use uma tesoura oftálmica para cortar a pele verticalmente da tíbia distal e, em seguida, dissecar toda a pele do membro traseiro.
3. Corte o ligamento articular da articulação do quadril direito e articulação do joelho com uma tesoura para separar o membro traseiro. Corte o trochanter e a junção da fíbula e, em seguida, mergulhe o membro traseiro em 4% de paraformaldeído. Mantenha os membros traseiros certos para o passo 3. Corte adequadamente o osso em ambas as extremidades para imergir completamente e fixar a medula óssea com 4% de paraformaldeído.
4. Corte o ligamento articular da articulação do quadril esquerdo e da articulação do joelho com uma tesoura, remova suavemente o tecido mole e separe cuidadosamente a tíbia e o fêmur. Mergulhe a tíbia e o fêmur separadamente em 75% de etanol. Mantenha a femora para a etapa 4 e tíbia para a etapa 6. Certifique-se de manter o trochanter intacto.

3. Preparação da seção de parafina

1. Fixar o membro traseiro direito em 4% de paraformaldeído a 4 °C por 48 h.
2. Decalcificar: Lave suavemente os espécimes com 1x PBS por 10 min 3 vezes. Decalcifice os espécimes em 15% EDTA (150 g EDTA em 800 mL de ddH₂O e 100 mL de 10x PBS) com um decalcificador ultrassônico por 3 a 4 semanas até que os ossos possam ser dobrados. Substitua por um fluido de decalcificante fresco a cada dois dias.
3. Lave suavemente as amostras 3x com 1x PBS e, em seguida, mergulhe-as em 75% de etanol a 4 °C durante a noite.
4. Desidratação: No segundo dia, imergir sequencialmente espécimes em 95% de etanol, 100% etanol e xileno, cada um por 1h duas vezes.
5. Mergulhe espécimes em 1/2 xileno 1/2 parafina por 30 min. Mergulhe os espécimes em parafina a 65 °C durante a noite.
6. Incorporar: Selecione um tanque de incorporação adequado para incorporar. Coloque a tíbia uniformemente por baixo. Coloque o fêmur e a tíbia em um ângulo de 90°. Depois que a parafina tiver esfriado e solidificado, remova-a do tanque de incorporação. Numerar os espécimes e armazená-los a -20 °C durante a noite.
7. Corte seções de 5 μm de espessura continuamente usando o microtoma. Corte de 20 a 40 seções. Espalhe as seções em água de 37 °C, adere-as aos slides do microscópio e asse a 42 °C durante a noite.

4. Micro-CT de digitalização e análise

1. Escaneie a femora esquerda com um scanner microcáludo. Resolução: 10 μm; Tensão: 70 kV; Corrente: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Passo de rotação: 0,5°.
2. Reconstrua imagens 3D do osso cortical e do osso trabecular usando o software de suporte do scanner seguindo as instruções do fabricante. Os ROIs têm uma largura total de 1 mm de osso trabecular próximo à placa de crescimento distal e em uma seção total de 1 mm de largura do osso cortical no meio da femora.
3. Calcular os parâmetros quantitativos de microarquitetura: densidade mineral óssea (DMO), fração de volume ósseo (VB/TV), espessura trabecular (Tb.Th.), número trabecular (Tb.N.), separação trabecular (Tb.Sp.) e espessura óssea cortical (Ct.Th.).

5. Coloração de armadilha

1. Asse as seções de parafina a 65 °C por 30 min.
2. Dewax: Mergulhe as seções em xileno por 10 minutos. Realize esta etapa 3x com xileno fresco.
3. Reidratar: Mergulhe as seções sequencialmente em 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol e ddH₂O, cada uma por 5 min duas vezes.
4. Prepare a solução de coloração usando o kit de coloração TRAP seguindo as instruções do fabricante e aqueça até 37 °C.
   NOTA: A solução de coloração TRAP deve ser preparada imediatamente antes de cada ensaio.
5. Adicione 50-100 μL de solução de coloração a cada amostra e incubar em uma câmara úmida de 37 °C por 20-30 min. Verifique o estado de coloração dos osteoclastos sob um microscópio de luz a cada 5 minutos até que os osteoclastos multinucleados vermelhos possam ser vistos. Termine a reação com ddH₂O.
6. Contra-mancha na solução de hematoxilina para 30 s. Crie uma cor azul estável por imersão em solução de amônia de 1% por 1 min. Enxágüe lentamente água da torneira.
7. Monte as seções com tampas usando bálsamo neutro e seque durante a noite.
8. Capture 3-5 campos de interesse por um microscópio. Analise o perímetro trabecular por Imagem J: meça o comprimento da barra de escala (Ls) usando a ferramenta 'linha reta' como L1, em seguida, meça o comprimento do perímetro trabecular usando a ferramenta 'linha segmentada' como L2, o comprimento físico (Lp)= Ls*L2 /L1). Conte o número de células TRAP-positivas com mais de três núcleos.

6. Rotulagem dupla vermelha de Calcein e alizarin

1. Preparação da amostra: Injete intraperitonealmente 20 mg/kg de calceína (1 mg/mL em solução NaHCO₃₎ no dia 0, e 25 mg/kg alizarin vermelho S (AL, 2 mg/mL em H₂O) no dia 4. Sacrifício de ratos no 7º dia. Desassociar cuidadosamente a tíbia e fixar em 4% paraformaldeído a 4 °C por 48 h.
2. Desidratar: Após a fixação, lave suavemente a tíbia 3x com 1x PBS. Imersão sequencialmente as amostras em 95% de etanol, 100% etanol e xileno por 5 min duas vezes separadamente.
3. Mergulhe os espécimes em acetona por 12 h, em 1/2 resina acetona 1/2 por 2 h, e em resina pura em um forno de secagem durante a noite.
   NOTA: A resina foi preparada por resina comercialmente disponível (por exemplo, Embed 812 Resin) de acordo com as instruções do fabricante.
4. Incorporar: Adicione resina pura em um tanque adequado de incorporação de gel de sílica e coloque os espécimes suavemente para evitar bolhas. Polimerize a resina em forno de secagem a 60 °C por 48 h.
5. Corte os espécimes em seções de 5 μm de espessura continuamente com um microtome rotativo. Armazene o resto das amostras com dessecante à temperatura ambiente.
6. Adere às seções com pinças em uma queda de 75% de álcool. Monte as seções com tampas usando bálsamo neutro. Capture rotulagem de fluorescência vermelha e verde com um microscópio de fluorescência.
7. Meça a largura entre duas linhas de rotulagem (Ir.L.Wi), perímetro trabecular de etiqueta única (sL.Pm), perímetro trabecular de dupla rotulagem (dL.Pm) e perímetro trabecular total (Tb.Pm). Calcular a taxa de apposition mineral (MAR) e a taxa de formação óssea (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/dias de intervalo. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.

Resultados

Utilizando o protocolo atual, foram gerados camundongos de exclusão Stat3 específicos para estudar a influência da exclusão de STAT3 na diferenciação de osteoclatos. Os camundongos Stat3^Ctsk e seus ninhados wildtype (WT) foram criados e mantidos após a genotipagem. Macrófagos de medula óssea foram isolados e cultivados em osteoclatos, e a exclusão de STAT3 em camundongos Stat3^Ctsk foi demonstrada(Figura 1).

Discussão

Modelos de camundongos geneticamente modificados são comumente usados para estudar o mecanismo e o tratamento farmacêutico da doença humana¹³. Os camundongos Ctsk-Cre têm sido amplamente utilizados para estudos funcionais de osteoclatos⁶. O presente estudo descreveu os protocolos dos métodos para analisar o fenótipo esquelético e estudar os genes críticos que controlam a atividade osteoclasta in vivo.

A análise histológica é o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde solution	Sangon biotech Co., Ltd.	E672002
Acetone	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	80000360
Alizarin	Sigma-Aldrich	A5533
Ammonia solution	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA	Electron Microscopy Sciences	13710
DeCa RapidlyDecalcifier	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
EDTA	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 RESIN	Electron Microscopy Sciences	14900
fluorescence microscope	Olympus	IX73
Hematoxylin solution	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μCT 80
NaHCO3	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	10018918
Neutral balsam	Sangon biotech Co., Ltd.	E675007
NMA	Electron Microscopy Sciences	19000
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
rotary microtome	Leica	RM2265
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
xylene	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	1330-20-7