Analyse du phénotype squelettique d’un modèle murin de suppression conditionnelle de Stat3

Résumé

Ce protocole décrit une méthode canonique pour comprendre les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo. Cette méthode utilise un modèle murin transgénique et certaines techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique.

Résumé

Les modèles murins transgéniques sont puissants pour comprendre les gènes critiques contrôlant la différenciation et l’activité de l’ostéoclaste, et pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques de l’ostéoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Crémeurs ont été largement utilisés pour les études fonctionnelles des ostéoclastes. Le transducteur de signal et activateur de transcription 3 (STAT3) est pertinent dans l’homéostasie osseuse, mais son rôle dans les ostéoclastes in vivo reste mal défini. Pour fournir la preuve in vivo que STAT3 participe à la différenciation des ostéoclastes et au métabolisme osseux, nous avons généré un modèle murin de délétion Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3 ^fl/fl; Ctsk-Cre) et analysé son phénotype squelettique. Le balayage de Micro-CT et la reconstruction 3D ont impliqué la masse accrue d’os chez les souris knockout conditionnelles. La souillure de H&E, la double souillure rouge de calcein et d’alizarin, et la souillure acide tartrate-résistante de la phosphatase (PIÈGE) ont été exécutées pour détecter le métabolisme d’os. En bref, ce protocole décrit quelques méthodes et techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.

Introduction

L’os squelettique est le principal organe porteur du corps humain et est sous la pression de l’environnement interne et externe pendant la marche et l’exercice¹. Tout au long de la vie, les os passent continuellement par l’auto-renouvellement, qui est équilibré par les ostéoblastes et les ostéoclastes. Le processus d’élimination des ostéoclastes des os anciens et de la formation de nouveaux os par les ostéoblastes maintient l’homéostasie et la fonction mécanique du système squelettique². Une perturbation de l’équilibre peut induire des maladies métaboliques osseuses, telles que l’ostéoporose. L’ostéoporose, qui est causée par une activité ostéoclastique excessive, est répandue à l’échelle mondiale et entraîne des pertes économiques substantielles pour la société^2,3,4. Selon le nombre limité de médicaments disponibles pour le traitement de l’ostéoporose et leur risque d’effets indésirables⁴, il est important de dévoiler les détails de la formation et de l’activité de l’ostéoclaste.

Les ostéoclastes dérivés de la lignée hématopoïétique monocyte/macrophage ont des noyaux multiples (peuvent avoir de 2 à 50 noyaux) et sont grands (généralement supérieurs à 100 μm de diamètre)^2. Bien que l’exploration des mécanismes et le criblage des drogues pour des désordres osteoclastic aient été largement améliorés par l’intermédiaire de la culture osteoclast in vitro, les réactions organiques compliquées rendent l’évidence in vivo indispensable pour la thérapie visée. En raison des similitudes génétiques et physiopathologiques entre les souris et les humains, les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques des maladies humaines in vivo⁶. Le système Cre-loxP est une technologie largement utilisée pour l’édition de gènes de souris et a permis aux chercheurs d’étudier les fonctions des gènes d’une manière spécifique aux tissus/cellules⁵. La cathepsine K (CSTK) est une cystéine protéase sécrétée par des ostéoclastes qui peuvent dégrader le collagène osseux^8. Il est bien accepté que CTSK soit sélectivement exprimé dans les osteoclasts mûrs ; par conséquent, les souris Ctsk-Cre sont considérées comme un outil utile pour les études fonctionnelles des ostéoclastes et ont été utilisées⁶.

La famille des transducteurs de signaux et activateurs de transcription (STAT) est classique et très importante dans l’immunité et la progression et le développement du cancer^7,8. Parmi les sept STATs, STAT3 est signalé comme le plus pertinent pour l’homéostasie osseuse^9,10. Plusieurs études in vivo ont rapporté que l’inactivation spécifique de STAT3 dans les ostéoblastes diminue la formation osseuse^9,10. Néanmoins, les preuves solides concernant la participation de STAT3 à la formation d’ostéoclastes et au métabolisme osseux in vivo sont encore limitées. Récemment, nous avons fourni des preuves in vivo avec un modèle murin de suppression Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3^{fl/ fl}; Ctsk-Cre, ci-après appelé Stat3^Ctsk) que STAT3 participe à la différenciation ostéoclaste et au métabolisme osseux¹¹. Dans la présente étude, nous décrivons les méthodes et les protocoles que nous avions l’habitude d’analyser les changements de la masse d’os, de l’histomorphologie d’os, et de l’anabolisme et du catabolisme d’os des souris Stat3^Ctsk afin d’étudier l’influence de la suppression STAT3 osteoclast-spécifique sur l’homéostasie d’os.

Protocole

Toutes les méthodes relatives aux animaux décrits ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’École de médecine de l’Université Jiaotong de Shanghai.

1. Élevage de souris de délétion Stat3 spécifiques à l’ostéoclaste

REMARQUE: Les souris Stat3^fl/fl ont été obtenues commercialement. Les souris Ctsk-Cre ont été fournies par S. Kato (Université de Tokyo, Tokyo, Japon¹²). Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS) dans l’établissement pour animaux de l’établissement dans des conditions normalisées.

1. Associez une souris mâle sexuellement mature à deux souris femelles du même âge. Après 18 jours, vérifiez les contrôles quotidiens pour les nouveau-nés. Séparez les souris femelles gravides et gardez-les seules si nécessaire. Changer les souris mâles entre différentes cages de reproduction si les souris femelles n’étaient pas enceintes dans les 1 mois suivant l’appariement.
2. Croiser lessouris^{Stat3 fl/fl} aux souris Ctsk-Cre (F0). Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle Stat3^fl/+; Les souris Ctsk-Cre jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures, soit environ 6 semaines (F1). Utilisez les amorces suivantes : Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.
3. Cross mâle de 6 semaines Stat3^fl/+; Souris Ctsk-Cre avec des souris femelles Stat3^fl/fl. Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle Stat3 ^{fl /fl}; Les souris Ctsk-Cre jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures, soit environ 6 semaines (F2).
4. Cross mâle de 6 semaines Stat3 ^fl/fl; Souris Ctsk-Cre avec des souris stat3^{femelles fl/fl} (F3). Coupez les queues pour le génotypage et remplacez les vieilles souris reproductrices par des souris plus jeunes à temps (F3+N).

2. Prélèvement de spécimens

1. Euthanasier six paires de souris mâles Stat3^fl/fl et Stat3^Ctsk mâles de 8 semaines séparément avec asphyxie au dioxyde de carbone.
   NOTA : Le débit de CO₂ déplace 30 % du volume de la cage par minute (p. ex., pour une cage de 45 cm x 30 cm x 30 cm, le débit de CO₂ est de 40 L/min).
2. Placez les souris en décubitus dorsal. Disloquer doucement les articulations bilatérales de la hanche à la main. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper la peau verticalement du tibia distal, puis disséquer toute la peau du membre postérieur.
3. Couper le ligament articulaire de l’articulation droite de la hanche et de l’articulation du genou avec des ciseaux pour séparer le membre postérieur. Couper le trochanter et la jonction du péroné puis immerger le membre postérieur dans du paraformaldéhyde à 4%. Conservez les membres postérieurs droits pour l’étape 3. Couper de manière appropriée l’os aux deux extrémités pour immerger complètement et fixer la moelle osseuse avec du paraformaldéhyde à 4%.
4. Coupez le ligament articulaire de l’articulation de la hanche gauche et de l’articulation du genou avec des ciseaux, retirez doucement les tissus mous et séparez soigneusement le tibia et le fémur. Plongez le tibia et le fémur séparément dans de l’éthanol à 75%. Conservez les fémurs pour l’étape 4 et les tibias pour l’étape 6. Assurez-vous de garder le trochanter intact.

3. Préparation de la section de paraffine

1. Fixer le membre postérieur droit dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h.
2. Décalcifier: Lavez doucement les échantillons avec 1x PBS pendant 10 min 3 fois. Décalcifier les échantillons dans 15% d’EDTA (150 g d’EDTA dans 800 mL de_ddH2Oet 100 mL de PBS 10x) avec un décalcificateur ultrasonique pendant 3 à 4 semaines jusqu’à ce que les os puissent être pliés. Remplacer par du liquide décalcifiant frais tous les deux jours.
3. Lavez doucement les échantillons 3x avec 1x PBS, puis plongez-les dans de l’éthanol à 75% à 4 °C pendant la nuit.
4. Déshydratation: Le deuxième jour, immerger séquentiellement les échantillons dans de l’éthanol à 95%, de l’éthanol à 100% et du xylène, chacun pendant 1 h deux fois.
5. Immerger les spécimens dans 1/2 xylène 1/2 paraffine pendant 30 min. Plongez les spécimens dans de la paraffine à 65 °C pendant la nuit.
6. Embed: Sélectionnez un réservoir d’encastrement approprié pour l’encastrement. Placez le tibia uniformément en dessous. Placez le fémur et le tibia à un angle de 90°. Une fois que la paraffine a été complètement refroidie et solidifiée, retirez-la du réservoir d’encastrement. Numérotez les spécimens et conservez-les à -20 °C pendant la nuit.
7. Couper des sections de 5 μm d’épaisseur en continu à l’aide du microtome. Coupez 20 à 40 sections. Étalez les sections sur de l’eau à 37 °C, adhérez-les aux lames du microscope et faites cuire à 42 °C pendant la nuit.

4. Micro-CT balayage et analyse

1. Scannez les fémurs gauches avec un micro-scanner. Résolution: 10 μm; Tension: 70 kV; Courant : 114 μA; Fliter : 0,5 mm Al ; Étape de rotation : 0,5°.
2. Reconstruire des images 3D de l’os cortical et de l’os trabéculaire à l’aide du logiciel de support du scanner en suivant les instructions du fabricant. Les ROIs sont dans une largeur totale de 1 mm d’os trabéculaire près du plat distal de croissance et dans une section totale de 1 millimètre de large de l’os cortical au milieu des fémurs.
3. Calculer les paramètres quantitatifs de microarchitecture : densité minérale osseuse (DMO), fraction volumique osseuse (BV/TV), épaisseur trabéculaire (Tb.Th.), nombre trabéculaire (Tb.N.), séparation trabéculaire (Tb.Sp.) et épaisseur corticale osseuse (Ct.Th.).

5. Coloration TRAP

1. Cuire les sections de paraffine à 65 °C pendant 30 min.
2. Dewax: Plongez les sections dans le xylène pendant 10 min. Effectuez cette étape 3x avec du xylène frais.
3. Réhydrater : Immerger les sections séquentiellement dans de l’éthanol à 100 %, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 70 % et du ddH₂O, chacun pendant 5 min deux fois.
4. Préparer la solution de coloration à l’aide de la trousse de coloration TRAP en suivant les instructions du fabricant et réchauffer à 37 °C.
   REMARQUE: La solution de coloration TRAP doit être fraîchement préparée immédiatement avant chaque essai.
5. Ajouter une solution de coloration de 50 à 100 μL à chaque échantillon et incuber dans une chambre humide à 37 °C pendant 20 à 30 min. Vérifiez l’état de coloration des ostéoclastes au microscope optique toutes les 5 minutes jusqu’à ce que des ostéoclastes multinucléés rouges puissent être vus. Terminez la réactionavec ddH2 O.
6. Contre-tache dans une solution d’hématoxyline pendant 30 s. Créez une couleur bleue stable par immersion dans une solution d’ammoniac à 1% pendant 1 min. Rincer à l’eau du robinet qui coule lentement.
7. Montez les sections avec des lamaux à l’aide de baume neutre et séchez pendant la nuit.
8. Capturez 3 à 5 champs d’intérêt au microscope. Analyser le périmètre trabéculaire par l’image J: mesurer la longueur de la barre d’échelle (Ls) en utilisant l’outil 'ligne droite' comme L1, puis mesurer la longueur du périmètre trabéculaire en utilisant l’outil 'ligne segmentée' comme L2, la longueur physique (Lp)= Ls*L2 /L1). Comptez le nombre de cellules TRAP-positives avec plus de trois noyaux.

6. Double étiquetage de calcine et d’alizarine rouge

1. Préparation de l’échantillon : Injecter par voie intrapéritonéale 20 mg/kg de caltine (1 mg/mL dans une solution de NaHCO_{3 à 2} %) le jour 0, et 25 mg/kg d’alizarine rouge S (AL, 2 mg/mL dans_H2O)le jour 4. Sacrifier des souris le jour 7. Dissocier soigneusement les tibias et fixer dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h.
2. Déshydratation: Après fixation, lavez doucement les tibias 3x avec 1x PBS. Plongez séquentiellement les éprouvettes dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène pendant 5 min deux fois séparément.
3. Plongez les éprouvettes dans de l’acétone pendant 12 h, dans 1/2 d’acétone 1/2 résine pendant 2 h, et dans de la résine pure dans un four de séchage pendant la nuit.
   NOTA : La résine a été préparée à l’aide de résine disponible dans le commerce (p. ex. résine Embed 812) conformément aux instructions du fabricant.
4. Incorporer: Ajoutez de la résine pure dans un réservoir d’encastrement de gel de silice approprié et placez les échantillons doucement pour éviter les bulles. Polymériser la résine dans un étuve de séchage à 60 °C pendant 48 h.
5. Couper les éprouvettes en sections épaisses de 5 μm en continu à l’avec un microtome rotatif. Conservez le reste des échantillons avec du desséchant à température ambiante.
6. Adhérez aux sections avec une pince à épiler dans une goutte de 75% d’alcool. Montez les sections avec des lamaux à l’aide de baume neutre. Capturez le étiquetage de fluorescence rouge et vert avec un microscope à fluorescence.
7. Mesurez la largeur entre deux lignes d’étiquetage (Ir.L.Wi), le périmètre trabéculaire monétique (sL.Pm), le périmètre trabéculaire à double étiquette (dL.Pm) et le périmètre trabéculaire total (Tb.Pm). Calculer le taux d’apposition minérale (MAR) et le taux de formation osseuse (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/jours d’intervalle. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.

Résultats

Utilisant le protocole actuel, des souris spécifiques osteoclast de suppression Stat3 ont été produites pour étudier l’influence de la suppression STAT3 sur la différentiation osteoclast. Les souris Stat3^Ctsk et leurs compagnons de litière de type sauvage (WT) ont été élevés et gardés après le génotypage. Des macrophages de moelle osseuse ont été isolés et cultivés en osteoclasts, et la suppression STAT3 chez les souris Stat3^Ctsk a ét?...

Discussion

Les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier le mécanisme et le traitement pharmaceutique des maladies humaines¹³. Les souris Ctsk-Cre ont été largement utilisées pour les études fonctionnelles des ostéoclastes⁶. La présente étude a décrit les protocoles des méthodes pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde solution	Sangon biotech Co., Ltd.	E672002
Acetone	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	80000360
Alizarin	Sigma-Aldrich	A5533
Ammonia solution	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
DDSA	Electron Microscopy Sciences	13710
DeCa RapidlyDecalcifier	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	Electron Microscopy Sciences	13600
EDTA	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 RESIN	Electron Microscopy Sciences	14900
fluorescence microscope	Olympus	IX73
Hematoxylin solution	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μCT 80
NaHCO3	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	10018918
Neutral balsam	Sangon biotech Co., Ltd.	E675007
NMA	Electron Microscopy Sciences	19000
Paraffin	Sangon biotech Co., Ltd.	A601889
rotary microtome	Leica	RM2265
Stat3fl/fl mice	GemPharmatech Co., Ltd	D000527
TRAP staining kit	Sigma-Aldrich	387A
xylene	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	1330-20-7