Evaluación conductual de la función visual a través de la respuesta optomotora y la función cognitiva a través de Y-Maze en ratas diabéticas

Resumen

La degeneración neuronal tanto en los ojos como en el cerebro como resultado de la diabetes se puede observar a través de pruebas de comportamiento realizadas en roedores. El laberinto en Y, una medida de la cognición espacial, y la respuesta optomotora, una medida de la función visual, proporcionan información sobre posibles diagnósticos y tratamientos.

Resumen

La respuesta optomotora y el laberinto en Y son pruebas de comportamiento útiles para evaluar la función visual y cognitiva, respectivamente. La respuesta optomotora es una herramienta valiosa para rastrear los cambios en los umbrales de frecuencia espacial (SF) y sensibilidad al contraste (CS) a lo largo del tiempo en varios modelos de enfermedad de la retina, incluida la retinopatía diabética. Del mismo modo, el laberinto en Y se puede utilizar para monitorear la cognición espacial (medida por alternancia espontánea) y el comportamiento exploratorio (medido por una serie de entradas) en una serie de modelos de enfermedades que afectan el sistema nervioso central. Las ventajas de la respuesta optomotora y el laberinto en Y incluyen sensibilidad, velocidad de las pruebas, el uso de respuestas innatas (no se necesita entrenamiento) y la capacidad de realizarse en animales despiertos (no anestesiados). Aquí, se describen protocolos tanto para la respuesta optomotora como para el laberinto en Y y ejemplos de su uso que se muestran en modelos de diabetes tipo I y tipo II. Los métodos incluyen la preparación de roedores y equipos, el rendimiento de la respuesta optomotora y el laberinto en Y, y el análisis de datos posterior a la prueba.

Introducción

Más de 463 millones de personas viven con diabetes, lo que la convierte en una de las mayores epidemias mundiales de ^{enfermedades1}. Una de las complicaciones graves que surgen de la diabetes es la retinopatía diabética (RD), una de las principales causas de ceguera en los adultos estadounidenses en edad de ^trabajar2. En los próximos 30 años, se prevé que el porcentaje de la población en riesgo de RD se duplique, por lo que es crucial encontrar nuevas formas de diagnosticar la RD en sus primeras etapas para prevenir y mitigar el desarrollo de la ^DR3. Convencionalmente se ha pensado que la RD es una enfermedad ^{vascular4,5,6}. Sin embargo, ahora con evidencia de disfunción neuronal y apoptosis en la retina que precede a la patología vascular, la RD se define como tener componentes neuronales y vasculares4,5,6,7,8,9. Una forma de diagnosticar la RD sería examinar las anomalías neuronales en la retina, un tejido que puede ser más vulnerable al estrés oxidativo y la tensión metabólica de la diabetes que otros tejidos ^neurales10.

Las disminuciones en la función cognitiva y motora también ocurren con la diabetes y a menudo se correlacionan con cambios en la retina. Las personas mayores con diabetes tipo II presentan un peor rendimiento cognitivo basal y muestran un deterioro cognitivo más exacerbado que los participantes de ^control11. Adicionalmente, la retina se ha establecido como una extensión del sistema nervioso central y las patologías pueden manifestarse en la ^retina12. Clínicamente, la relación entre la retina y el cerebro se ha estudiado en el contexto del Alzheimer y otras enfermedades, pero no se explora comúnmente con la diabetes12,13,14,15,16. Los cambios en el cerebro y la retina durante la progresión de la diabetes se pueden explorar utilizando modelos animales, incluida la rata STZ (un modelo de diabetes tipo I en el que la toxina, estreptozotocina o STZ, se usa para dañar las células beta pancreáticas) y la rata Goto-Kakizaki (un modelo poligénico de diabetes tipo II en el que los animales desarrollan hiperglucemia espontáneamente alrededor de las 3 semanas de edad). En este protocolo, se proporciona una descripción del laberinto en Y y la respuesta optomotora para evaluar los cambios cognitivos y visuales en roedores diabéticos, respectivamente. La respuesta optomotora (OMR) evalúa la frecuencia espacial (similar a la agudeza visual) y la sensibilidad al contraste mediante el monitoreo de los movimientos característicos de seguimiento reflexivo de la cabeza para medir los umbrales visuales de cada ^ojo17. La frecuencia espacial se refiere al grosor o finura de las barras, y la sensibilidad al contraste se refiere a la cantidad de contraste que hay entre las barras y el fondo (Figura 1E). Mientras tanto, el laberinto en Y prueba la memoria espacial a corto plazo y la función exploratoria, observada a través de alternancias espontáneas y entradas a través de los brazos del laberinto.

Ambas pruebas se pueden realizar en animales despiertos y no anestesiados y tienen la ventaja de capitalizar las respuestas innatas de los animales, lo que significa que no requieren entrenamiento. Ambos son relativamente sensibles, ya que pueden usarse para detectar déficits temprano en la progresión de la diabetes en roedores, y confiables, ya que producen resultados que se correlacionan con otras pruebas visuales, retinianas o de comportamiento. Además, el uso de OMR y el laberinto en Y junto con pruebas como el electrorretinograma y las tomografías de coherencia óptica puede proporcionar información sobre cuándo se desarrollan cambios retinianos, estructurales y cognitivos en relación entre sí en modelos de enfermedad. Estas investigaciones podrían ser útiles para identificar las degeneraciones neuronales que ocurren debido a la diabetes. En última instancia, esto podría conducir a nuevos métodos de diagnóstico que identifiquen eficazmente la DR en las primeras etapas de la progresión.

Los sistemas OMR y Y-maze utilizados para desarrollar este protocolo se describen en la Tabla de Materiales. Investigaciones previas sobre el OMR, de Prusky et ^al.18, y el laberinto en Y, de Maurice et ^al.19, se utilizaron como punto de partida para desarrollar este protocolo.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Asuntos de Veteranos de Atlanta y se ajustaron a la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Publicaciones de los NIH, ^8ª edición, actualizada en 2011).

1. La respuesta optomotora (OMR)

1. Configurar el aparato OMR (detalles sobre el aparato y el software en la Tabla de materiales)
   1. Elija la plataforma del tamaño adecuado para el roedor: ratón, rata o rata grande/deteriorada (Figura 1A).
   2. Abra el software OMR, que debería abrirse a una ventana con varias pestañas de opciones y una transmisión de video en vivo del interior del OMR / tambor virtual (Figura 1B). Acerque o aleje con la cámara de video según sea necesario para que la plataforma y sus alrededores sean visibles.
   3. Observe los iconos a lo largo del lado izquierdo de la imagen en vivo (Figura 1C). Haga clic en el icono del asterisco y en el icono de las rayas giratorias para que tanto el asterisco verde como las franjas giratorias verdes desaparezcan de la transmisión en vivo.
   4. Haga clic en el icono de la brújula para que aparezca un círculo verde y dos líneas perpendiculares. Estira el círculo verde para que se alinee perfectamente con el círculo negro de la plataforma, lo que asegurará que el OMR esté perfectamente alineado.
   5. Haga clic en el icono de la brújula porque no es necesario ver el círculo durante la prueba. Haga clic en el icono de asterisco verde y en el icono de rayas giratorias verdes para que vuelvan a aparecer. Tenga en cuenta que las rayas verdes giran en la misma dirección que las rayas en el tambor, lo que permite al investigador conocer la dirección de las rayas.
   6. Haga clic en la pestaña Pruebas . En Pruebas, haga clic en la pestaña Psicofísica . En Umbral, seleccione Frecuencia para medir la frecuencia espacial.
      NOTA: El software OMR utiliza un paradigma de escalera para calcular automáticamente la frecuencia espacial (SF). El contraste se mantendrá al 100%.
   7. En Pruebas, haga clic en la pestaña Ajustes preestablecidos . Seleccione la configuración predeterminada para ^Mouse18 o ^Rat20.
   8. En Pruebas, haga clic en la pestaña Blanking . Marque la casilla Espacio en blanco en el seguimiento , que pausará las rayas / dejará en blanco las pantallas de la computadora en el tambor cada vez que se haga clic con el botón derecho del mouse.
   9. Haga clic en la pestaña Resultados , que es donde se mostrarán los resultados de la prueba.
2. Evaluar la frecuencia espacial
   1. Coloque al roedor en la plataforma circular en el centro de la cámara de realidad virtual que comprende cuatro monitores de computadora que muestran rejillas verticales de onda sinusoidal que rodean la cámara a una velocidad de 12 ° / s (Figura 1D).
   2. Tenga en cuenta que la cámara de video colocada en la parte superior de la cámara está proyectando el comportamiento del roedor en vivo en el monitor de la computadora.
   3. Busque la presencia o ausencia de acciones reflexivas por parte de la cabeza del roedor a medida que las rejillas se mueven en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj. Asegúrese de que las barras ilustradas sean visibles en el programa, ya que mostrarán la dirección del movimiento de la rejilla.
      1. Esté atento a que la cabeza del roedor se mueva en la misma dirección que las rejillas. Espere hasta que haya una persecución suave, no ráfagas erráticas de movimiento de la cabeza, para contarlo como seguimiento.
      2. Haga clic en Sí o No según corresponda. Tenga en cuenta que SF comenzará con 0.042 cyc/deg y se ajustará con cada sí y no para que sea más fácil o más difícil (Figura 1E). Haga clic en Restablecer si la prueba debe restablecerse debido a un clic accidental o incorrecto de sí y no.
   4. A medida que se prueba el roedor, asegúrese de mantener el asterisco colocado sobre la cabeza del roedor.
      NOTA: Esto tiene dos efectos: 1) Mantiene la frecuencia espacial correcta. Si el asterisco se coloca entre los hombros, por ejemplo, la frecuencia espacial será menor y las barras serán más fáciles de ver, lo que resultará en una puntuación falsamente alta. 2) Para roedores con ligeros movimientos de cabeza, el asterisco hace que sea más fácil medir si la cabeza realmente se está moviendo.
   5. Esté atento a que el sistema diga "Hecho" cuando se alcanza la frecuencia espacial del roedor. Tenga en cuenta que los botones Sí y No ya no podrán hacer clic.
   6. Haga clic en la pestaña Resultados , que mostrará la frecuencia espacial para el ojo izquierdo, el ojo derecho y los ojos combinados.
      NOTA: A veces, el software se configura de tal manera que los resultados se invierten, es decir, el ojo derecho se informa como el ojo izquierdo y el ojo izquierdo se informa como el ojo derecho. Esto se descubrió al evaluar roedores que tenían solo una lesión ocular en un modelo de glaucoma.
3. Evaluar la sensibilidad al contraste
   NOTA: Las pruebas de sensibilidad al contraste se pueden realizar inmediatamente después del paso de medición de frecuencia espacial o por sí solas en el mismo día o un día diferente si el roedor parece fatigado después de la prueba de frecuencia espacial (siga los pasos 1-2.2 si solo prueba la sensibilidad al contraste).
   1. Haga clic en la pestaña Pruebas y luego en la pestaña Psicofísica . En Umbral, seleccione Contraste (único) para medir la sensibilidad al contraste.
   2. También utilizando un paradigma de escalera, comience las rejillas con la constante SF en el pico de la curva de sensibilidad al contraste (CS). Para hacer esto, haga clic en la pestaña Estímulo y luego en la pestaña Rejillas . En el cuadro Frecuencia espacial , escriba 0,064 para ratas y 0,103 para ratones.
   3. Comience el contraste al 100% y busque los mismos movimientos reflexivos de la cabeza que se ven durante las pruebas de frecuencia espacial. Tenga en cuenta que el contraste disminuirá a medida que avancen las pruebas hasta que el roedor ya no tenga movimientos reflexivos de la cabeza en respuesta al estímulo (Figura 1E).
   4. Esté atento a que el sistema diga "Listo" y los botones Sí y No ya no se puedan hacer clic una vez que el roedor ya no responda al estímulo visual y se haya alcanzado el umbral de sensibilidad al contraste. Haga clic en la pestaña Resultados , donde se mostrará la sensibilidad al contraste para el ojo izquierdo, el ojo derecho y los ojos combinados.
4. Realizar análisis posteriores a la prueba
   1. Para los estudios de retinopatía diabética, donde se espera que ambos ojos tengan déficits similares, use la puntuación combinada (promedio de los ojos derecho e izquierdo) para el análisis. Para los modelos que causan daño diferencial a los ojos (es decir, lesión por explosión o glaucoma), mantenga separados los datos del ojo izquierdo y derecho.
   2. Para la frecuencia espacial, use puntajes sin procesar (los datos de la pestaña Resultados ) para el análisis y promedie estos puntajes juntos por grupo (es decir, diabético, control, etc.).
   3. Para sensibilidad al contraste, utilice el valor bruto para calcular la sensibilidad al contraste informada por el contraste michelson a partir de una medición anterior de la luminancia de la pantalla.

2. El laberinto en Y

1. Preparar roedores para las pruebas
   1. Adapte los roedores a la habitación durante 30 minutos antes de la prueba.
      NOTA: El investigador puede permanecer en la habitación con las luces encendidas, pero debe permanecer en silencio durante este tiempo.
   2. Limpie el laberinto en Y con una solución desinfectante segura para los animales y limpie toda la solución desinfectante con toallas de papel. Asegúrese de que el laberinto esté seco.
2. Conduce el laberinto en Y
   1. Etiquete el brazo inicial del laberinto en Y como B y los otros 2 brazos como A y C (Figura 2A). Coloque un roedor en el brazo más cercano al investigador (brazo B) cerca del centro del laberinto en Y. Una vez que se haya colocado el roedor, inicie el temporizador (detalles sobre el laberinto y el temporizador en la Tabla de materiales).
      1. Permita que cada roedor explore el laberinto en Y durante 8 minutos. Tome grabaciones durante este tiempo y anote cualquier observación. Siéntese a varios pies de distancia del laberinto mientras lo mantiene a la vista y evite hacer ruido.
      2. Registre la ubicación inicial como A, y cada vez que el roedor haga una entrada en un nuevo brazo, registre la nueva ubicación del roedor (Figura 2B). Defina una entrada como las cuatro extremidades del roedor que están en uno de los brazos.
      3. Esté atento a que los roedores se escondan y permanezcan estacionarios en un brazo del laberinto. Si el roedor permanece en el mismo lugar durante más de 60 s y no parece mostrar un comportamiento exploratorio, mueva al roedor hacia el centro del laberinto en Y y continúe la prueba.
   2. Después de cada roedor, retire las heces y limpie el laberinto con una solución desinfectante.
      1. Asegúrese de que toda la solución desinfectante se limpie con toallas de papel y que el laberinto esté completamente seco antes de colocar al siguiente roedor en el laberinto.
3. Calcular la alternancia espontánea y el comportamiento exploratorio
   1. Calcular el comportamiento exploratorio como el número total de entradas realizadas durante 8 min.
   2. Calcular la cognición espacial medida por alternancia espontánea:
      el número de alternancias exitosas/(el número total de entradas - 2)
      1. Defina una alternancia exitosa a medida que el roedor se mueve en tres ubicaciones diferentes secuencialmente (Ejemplo: ABC, CAB, BCA, etc.). Anote cada alternancia exitosa (Figura 2B).
      2. Si los movimientos se registraron como ACABCABABCABC, no tenga en cuenta las dos ubicaciones iniciales de partida al calcular la alternancia espontánea (de modo que haya 11 movimientos en el denominador). Cuente el número de movimientos precisos (movimientos precisos = 8). Calcule el porcentaje de precisión como: 8/(13 - 2) = 72.7%.

Resultados

El OMR se considera exitoso si se pueden obtener umbrales de sensibilidad de frecuencia espacial y contraste de un roedor. Aquí, el uso del OMR para evaluar la frecuencia espacial se ilustra en ratas Brown-Norway y Long-Evans de control ingenuo, tanto jóvenes (3-6 meses) como envejecidas (9-12 meses). Las ratas brown-noruegas suelen mostrar una frecuencia espacial basal más alta que las ratas Long-Evans. Además, se observó un efecto de envejecimiento sobre la frecuencia espacial en las ratas Long-Evans (

Discusión

El OMR y el laberinto en Y permiten la evaluación no invasiva de la función visual y los déficits de la función cognitiva en roedores a lo largo del tiempo. En este protocolo, se demostró que el OMR y el laberinto en Y rastrean los déficits visuales y cognitivos en modelos de roedores de diabetes.

Pasos críticos en el protocolo

La OMR

Algunos puntos importantes a considerar al realizar el OMR para evaluar la funci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		OMR apparatus & software
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze apparatus	San Diego Instruments	7001-043	Available specifically for rats