הערכה התנהגותית של תפקוד חזותי באמצעות תגובת Optomotor ותפקוד קוגניטיבי באמצעות Y-Maze בחולדות סוכרתיות

Summary

ניוון עצבי הן בעיניים והן במוח כתוצאה מסוכרת ניתן לראות באמצעות בדיקות התנהגותיות שבוצעו על מכרסמים. מבוך ה-Y, מדד לקוגניציה מרחבית, ותגובת האופטומוטור, מדד לתפקוד חזותי, מספקים תובנה על אבחנות וטיפולים פוטנציאליים.

Abstract

תגובת האופטומוטור ומבוך ה- Y הם מבחנים התנהגותיים שימושיים להערכת תפקוד חזותי וקוגניטיבי, בהתאמה. תגובת האופטומוטור היא כלי רב ערך למעקב אחר שינויים בתדירות המרחבית (SF) ובסף הרגישות לניגודיות (CS) לאורך זמן במספר מודלים של מחלות רשתית, כולל רטינופתיה סוכרתית. באופן דומה, מבוך Y יכול לשמש לניטור קוגניציה מרחבית (כפי שנמדד על ידי חילופים ספונטניים) והתנהגות גישוש (כפי שנמדד על ידי מספר ערכים) במספר מודלים של מחלות המשפיעים על מערכת העצבים המרכזית. היתרונות של תגובת האופטומוטור ומבוך ה- Y כוללים רגישות, מהירות בדיקה, שימוש בתגובות מולדות (אין צורך באימון), והיכולת להתבצע על בעלי חיים ערים (שאינם מורדמים). כאן, פרוטוקולים מתוארים הן עבור התגובה optomotor ואת מבוך Y ודוגמאות של השימוש בהם המוצגים במודלים של סוג I וסוכרת מסוג II. השיטות כוללות הכנת מכרסמים וציוד, ביצוע תגובת האופטומוטור ומבוך ה- Y, וניתוח נתונים לאחר הבדיקה.

Introduction

מעל 463 מיליון אנשים חיים עם סוכרת, מה שהופך אותו לאחת ממגיפות המחלות העולמיות הגדולות ^ביותר1. אחד הסיבוכים החמורים הנובעים מסוכרת הוא רטינופתיה סוכרתית (DR), גורם מוביל לעיוורון עבור מבוגרים אמריקאים בגיל ^{העבודה2}. ב -30 השנים הבאות, אחוז האוכלוסייה בסיכון ל- DR צפוי להכפיל את עצמו, ולכן חיוני למצוא דרכים חדשות לאבחון DR בשלביו המוקדמים יותר כדי למנוע ולהפחית את התפתחות ^DR3. DR נחשב באופן קונבנציונלי להיות מחלת כלי ^דם4,5,6. עם זאת, עכשיו עם ראיות של תפקוד עצבי ואפופטוזיס ברשתית שמקדימה פתולוגיה וסקולרית, DR מוגדר יש מרכיבים עצביים וכלי דם4,5,6,6,7,8,9. דרך אחת לאבחן DR תהיה לבחון חריגות עצביות ברשתית, רקמה שעשויה להיות פגיעה יותר ללחץ חמצוני וזן מטבולי מסוכרת מאשר רקמה עצבית ^אחרת10.

ירידות בתפקוד הקוגניטיבי והמוטורי מתרחשות גם עם סוכרת ולעתים קרובות מתואמות עם שינויים ברשתית. אנשים מבוגרים עם סוכרת מסוג II מתארים ביצועים קוגניטיביים בסיסיים גרועים יותר ומראים ירידה קוגניטיבית מחמירה יותר מאשר משתתפי ^בקרה11. בנוסף, הרשתית הוקמה כהרחבה של מערכת העצבים המרכזית ופתולוגיות יכולות להתבטא ^{ברשתית12}. מבחינה קלינית, הקשר בין רשתית למוח נחקר בהקשר של אלצהיימר ומחלות אחרות, אך לא נחקר בדרך כלל עם סוכרת12,13,13,14,15,16. שינויים במוח וברשתית במהלך התקדמות הסוכרת ניתן לחקור באמצעות מודלים של בעלי חיים, כולל חולדת STZ (מודל של סוכרת מסוג I שבו הרעלן, סטרפטוזוטוצין או STZ, משמש לפגיעה בתאי בטא בלבלב) ואת חולדת גוטו-Kakizaki (מודל פוליגני של סוכרת מסוג II שבו בעלי חיים לפתח היפרגליקמיה באופן ספונטני בסביבות 3 שבועות). בפרוטוקול זה, תיאור עבור מבוך Y ואת התגובה optomotor כדי להעריך שינויים קוגניטיביים וחזותיים מכרסמים סוכרתיים, בהתאמה, מסופק. תגובת האופטומוטור (OMR) מעריכה את התדירות המרחבית (בדומה לחדות הראייה) ואת הרגישות לניגודיות על ידי ניטור תנועות מעקב ראש רפלקסיביות אופייניות כדי לאמוד את הסף החזותי עבור כל ^עין17. התדירות המרחבית מתייחסת לעובי או לעדינות של הסורגים, ורגישות לניגודיות מתייחסת לכמה ניגודיות יש בין הסורגים לרקע (איור 1E). בינתיים, מבוך ה-Y בוחן זיכרון מרחבי לטווח קצר ותפקוד גישוש, שנצפו באמצעות חילופים וערכים ספונטניים דרך זרועות המבוך.

שתי הבדיקות יכולות להתבצע בבעלי חיים ערים ולא מורדמים ויש להם את היתרון של ניצול התגובות המולדות של בעלי החיים, כלומר הם אינם דורשים אימון. שניהם רגישים יחסית, בכך שניתן להשתמש בהם כדי לזהות ליקויים בשלב מוקדם בהתקדמות הסוכרת במכרסמים, ואמינים, בכך שהם מייצרים תוצאות התואמות לבדיקות חזותיות, רשתיות או התנהגותיות אחרות. בנוסף, שימוש ב- OMR ובמבוך ה- Y בשילוב עם בדיקות כגון אלקטרורטינוגרמה וסריקות טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית יכול לספק מידע על מועד התפתחותם של שינויים ברשתית, מבניים וקוגניטיביים ביחס זה לזה במודלים של מחלות. חקירות אלה יכולות להיות שימושיות בזיהוי ניוון עצבי המתרחשים עקב סוכרת. בסופו של דבר, זה יכול להוביל לשיטות אבחון חדשות המזהות ביעילות DR בשלבים מוקדמים של התקדמות.

מערכות OMR ו- Y-maze המשמשות לפיתוח פרוטוקול זה מתוארות בטבלת החומרים. מחקר קודם על OMR, על ידי Prusky et ^al.18, ואת מבוך Y, על ידי מוריס et ^al.19, שימש כנקודת המוצא לפתח פרוטוקול זה.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לענייני יוצאי צבא באטלנטה לטיפול ושימוש בבעלי חיים והותאמו למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסומי NIH^{, מהדורה} 8, עדכון 2011).

1. תגובת האופטומוטור (OMR)

1. הגדרת מנגנון OMR (פרטים על מנגנונים ותוכנה בטבלת החומרים)
   1. בחרו את הפלטפורמה בגודל המתאים למכרסם: עכבר, חולדה או חולדה גדולה/לקויה (איור 1A).
   2. פתח את תוכנת OMR, שאמורה להיפתח לחלון עם מספר כרטיסיות של אפשרויות והזנת וידאו חיה של החלק הפנימי של התוף הווירטואלי OMR/OMR (איור 1B). הגדלה או הקטנה של התצוגה באמצעות מצלמת הווידאו לפי הצורך, כך שהפלטפורמה וסביבתה יהיו גלויות.
   3. שימו לב לסמלים לאורך הצד השמאלי של התמונה החיה (איור 1C). לחץ על סמל הכוכבית ועל סמל הפסים המסתובבים כך שגם הכוכבית הירוקה וגם הפסים הירוקים המסתובבים ייעלמו מההזנה החיה.
   4. לחץ על סמל המצפן כך שיופיעו עיגול ירוק ושני קווים בניצב. מתח את העיגול הירוק כך שהוא יתיישר בצורה מושלמת עם העיגול השחור על הפלטפורמה, אשר יבטיח כי OMR מיושר באופן מושלם.
   5. לחץ על סמל המצפן כי אין צורך לראות את המעגל במהלך הבדיקה. לחץ על סמל הכוכבית הירוקה ועל סמל הפסים המסתובבים הירוקים כדי לגרום להם להופיע שוב. שים לב כי הפסים הירוקים מסתובבים באותו כיוון כמו הפסים בתוף, ומאפשרים לחוקר לדעת את כיוון הפסים.
   6. לחץ על הכרטיסיה בדיקה . תחת בדיקה, לחץ על הכרטיסייה פסיכופיזיקה . תחת סף, בחר תדירות למדידת תדירות מרחבית.
      הערה: תוכנת OMR משתמשת בפרדיגמת גרם מדרגות כדי לחשב באופן אוטומטי תדירות מרחבית (SF). הניגודיות תישמר ב-100%.
   7. תחת בדיקה, לחץ על הכרטיסיה הגדרות קבועות מראש . בחר את הגדרות ברירת המחדל עבור ^Mouse18 או ^Rat20.
   8. תחת בדיקה, לחץ על הכרטיסיה ריקון . סמן את התיבה ריק בעת מעקב , שתהה את הפסים/תמחק את מסכי המחשב בתוף בכל פעם שהעכבר ילחץ באמצעות לחצן העכבר הימני.
   9. לחץ על הכרטיסיה תוצאות , שם יוצגו תוצאות הבדיקה.
2. הערכת תדירות מרחבית
   1. הניחו את המכרסם על הפלטפורמה המעגלית במרכז תא המציאות המדומה הכולל ארבעה צגי מחשב המציגים סורגים אנכיים של גלי סינוס המקיפים את התא במהירות של 12°/s (איור 1D).
   2. שים לב שמצלמת הווידאו הממוקמת בחלק העליון של התא מקרינה את התנהגותו של המכרסם בשידור חי על צג המחשב.
   3. חפש את נוכחות או היעדר פעולות רפלקסיביות על ידי ראשו של המכרסם כמו הסורגים לנוע בכיוון השעון או נגד כיוון השעון. ודא שסרגלים מאוירים גלויים בתוכנית – אלה יציגו את כיוון התנועה הסורגת.
      1. שים לב שראשו של המכרסם ינוע באותו כיוון כמו הסורגים. חכה עד שיהיה מרדף חלק, לא התפרצויות בלתי יציבות של תנועת ראש, כדי לספור את זה כמעקב.
      2. לחץ על כן או לא לפי הצורך. שים לב ש-SF יתחיל ב-0.042 cyc/deg ויתאים את עצמו עם כל כן ולא כדי להיות קל יותר או קשה יותר (איור 1E). לחץ על איפוס אם יש לאפס את הבדיקה עקב לחיצה מקרית או שגויה של כן ולא.
   4. כאשר המכרסם נבדק, הקפד לשמור על הכוכבית ממוקמת מעל ראשו של המכרסם.
      הערה: יש לכך שתי השפעות: 1) הוא שומר על התדירות המרחבית הנכונה. אם הכוכבית ממוקמת בין הכתפיים, לדוגמה, התדירות המרחבית תהיה נמוכה יותר והסורגים יהיו קלים יותר לצפייה, וכתוצאה מכך ציון גבוה באופן כוזב. 2) עבור מכרסמים עם תנועות ראש קלות, הכוכבית מקלה על המדידה אם הראש באמת זז.
   5. שים לב למערכת לומר "בוצע" כאשר התדר המרחבי של המכרסם הוא הגיע. שים לב שהלחצנים כן ולא יהיו ניתנים עוד ללחיצה.
   6. לחץ על הכרטיסייה תוצאות , אשר יציג את התדירות המרחבית עבור העין השמאלית, עין ימין, ועיניים משולבות.
      הערה: לפעמים התוכנה מוגדרת כך שהתוצאות הפוכות, כלומר, העין הימנית מדווחת כעין שמאל והעין השמאלית מדווחת כעין ימין. זה התגלה בעת הערכת מכרסמים כי היה רק עין אחת נגע במודל גלאוקומה.
3. הערכת רגישות לניגודיות
   הערה: ניתן לבצע בדיקות רגישות לניגודיות מיד לאחר שלב מדידת התדר המרחבי או בכוחות עצמו באותו יום או ביום אחר אם המכרסם נראה עייף לאחר בדיקת תדירות מרחבית (בצע את שלבים 1-2.2 אם רק בודקים את רגישות הניגודיות).
   1. לחץ על הכרטיסיה בדיקה ולאחר מכן בכרטיסייה פסיכופיזיקה . תחת סף, בחר חדות (בודדת) כדי למדוד רגישות לחדות.
   2. גם באמצעות פרדיגמת גרם מדרגות, התחל סורגים עם קבוע SF בשיא עקומת הרגישות לניגודיות (CS). לשם כך, לחץ על הכרטיסיה גירוי ולאחר מכן על הכרטיסייה סורגים . בתיבה תדר מרחבי , הקלד 0.064 לחולדות ו - 0.103 עבור עכברים.
   3. התחל את הניגודיות ב 100% ולחפש את אותן תנועות ראש רפלקסיביות כפי שניתן לראות במהלך בדיקות תדר מרחבי. שים לב שהניגודיות תפחת ככל שהבדיקה תתקדם עד שלמכרסם לא יהיו עוד תנועות ראש רפלקסיביות בתגובה לגירוי (איור 1E).
   4. שים לב שהמערכת אומרת "בוצע" ואת הכפתורים כן ולא כבר לא להיות ללחיצה ברגע המכרסם כבר לא מגיב לגירוי החזותי ואת סף הרגישות ניגודיות כבר הגיע. לחץ על הכרטיסיה תוצאות , שם תפורט הרגישות לניגודיות עבור העין השמאלית, עין ימין ועיניים משולבות.
4. ביצוע ניתוח לאחר בדיקה
   1. עבור מחקרי רטינופתיה סוכרתית, שבהם שתי העיניים צפויות להיות ליקויים דומים, השתמש בציון המשולב (ממוצע העיניים הימניות והשמאליות) לניתוח. עבור מודלים הגורמים נזק דיפרנציאלי לעיניים (כלומר, פגיעה בפיצוץ או גלאוקומה), שמור על הפרדת נתוני העין השמאלית והימנית.
   2. עבור תדירות מרחבית, השתמש בציונים גולמיים (הנתונים מהכרטיסיה תוצאות ) לניתוח וממוצע ציונים אלה יחד לפי קבוצה (כלומר, סוכרת, בקרה וכו ').
   3. בתיבה 'רגישות לניגודיות', השתמשו בערך הגולמי כדי לחשב את רגישות הניגודיות המדווחת על-ידי הניגודיות של מישלסון ממדידה קודמת של זוהר המסך.

2. מבוך ה-Y

1. הכן מכרסמים לבדיקה
   1. התאימו מכרסמים לחדר למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
      הערה: החוקר יכול להישאר בחדר עם האורות דולקים אבל צריך לשמור על שתיקה במהלך תקופה זו.
   2. נקו את מבוך ה-Y עם פתרון חיטוי בטוח לבעלי חיים ומחקו את כל פתרונות החיטוי עם מגבות נייר. ודא שהמבוך יבש.
2. ניהול מבוך ה-Y
   1. סמן את הזרוע הראשונית של מבוך ה-Y כ-B ואת שתי הזרועות האחרות כ-A ו-C (איור 2A). מניחים מכרסם אחד בזרוע הקרובה ביותר לחוקר (זרוע B) ליד מרכז מבוך ה- Y. לאחר שהמכרסם הוצב, הפעל את הטיימר (פרטים על מבוך וטיימר בטבלת החומרים).
      1. אפשר לכל מכרסם לחקור את מבוך Y במשך 8 דקות. קח הקלטות במהלך תקופה זו ושים לב לכל תצפיות. לשבת כמה מטרים מן המבוך תוך שמירה על זה באופק ולהימנע עושה רעש.
      2. תיעדו את מיקום ההתחלה כ-A, ובכל פעם שהמכרסם נכנס לזרוע חדשה, תיעדו את המיקום החדש של המכרסם (איור 2B). הגדר ערך כמו כל ארבעת הגפיים של המכרסם להיות באחת הזרועות.
      3. שים לב מכרסמים להסתתר ולהישאר נייח בזרוע אחת של המבוך. אם המכרסם נשאר באותה נקודה במשך יותר מ -60 שניות ולא נראה להראות התנהגות גישוש, להזיז את המכרסם לכיוון מרכז מבוך Y, ולהמשיך את המשפט.
   2. לאחר כל מכרסם, להסיר כל צואה ולנקות את המבוך עם פתרון חיטוי.
      1. ודא כי כל פתרון החיטוי נמחק עם מגבות נייר והמבוך יבש לחלוטין לפני הצבת המכרסם הבא במבוך.
3. חשב שינוי ספונטני והתנהגות גישוש
   1. חשב התנהגות גישוש כמספר הכולל של ערכים שבוצעו במהלך 8 דקות.
   2. חשב קוגניציה מרחבית כפי שנמדדה על ידי חילופים ספונטניים:
      מספר החילופים המוצלחים/(המספר הכולל של הערכים - 2)
      1. הגדר חילופים מוצלחים כאשר המכרסם עובר לשלושה מיקומים שונים ברצף (לדוגמה: ABC, CAB, BCA וכו '). שימו לב לכל שינוי מוצלח (איור 2B).
      2. אם התנועות נרשמו כ- ACABCABABCABC, התעלמו משני מיקומי ההתחלה הראשוניים בעת חישוב חילופים ספונטניים (כך שיש 11 תנועות במכנה). ספור את מספר התנועות המדויקות (תנועות מדויקות = 8). חשב את אחוזי הדיוק כ: 8/(13 - 2) = 72.7%.

תוצאות

ה- OMR נחשב מוצלח אם ניתן להשיג תדר מרחבי וסף רגישות לניגודיות מכרסם. כאן, השימוש ב- OMR להערכת התדירות המרחבית מומחש בשליטה נאיבית חולדות בראון-נורבגיה ולונג-אוונס, שניהם צעירים (3-6 חודשים) ומבוגרים (9-12 חודשים). חולדות חומות-נורבגיות בדרך כלל מראות תדר מרחבי בסיסי גבוה יותר מאשר חולדות לונג-אוו...

Discussion

ה- OMR ו- Y-maze מאפשרים הערכה לא פולשנית של תפקוד חזותי וגרעונות בתפקוד הקוגניטיבי במכרסמים לאורך זמן. בפרוטוקול זה, OMR ואת מבוך Y הודגמו כדי לעקוב אחר ליקויים חזותיים וקוגניטיביים במודלים מכרסמים של סוכרת.

שלבים קריטיים בפרוטוקול

The OMR

כמה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		OMR apparatus & software
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze apparatus	San Diego Instruments	7001-043	Available specifically for rats