Avaliação Comportamental da Função Visual via Resposta Optomotor e Função Cognitiva via Y-Maze em Ratos Diabéticos

Resumo

A degeneração neural nos olhos e no cérebro como resultado do diabetes pode ser observada através de testes comportamentais realizados em roedores. O labirinto Y, uma medida de cognição espacial, e a resposta optomotor, uma medida da função visual, ambos fornecem insights sobre potenciais diagnósticos e tratamentos.

Resumo

A resposta optomotor e o labirinto Y são testes comportamentais úteis para avaliar a função visual e cognitiva, respectivamente. A resposta optomotor é uma ferramenta valiosa para rastrear mudanças nos limiares de frequência espacial (SF) e sensibilidade ao contraste (CS) ao longo do tempo em vários modelos de doenças da retina, incluindo retinopatia diabética. Da mesma forma, o labirinto Y pode ser usado para monitorar a cognição espacial (medida pela alternância espontânea) e o comportamento exploratório (medido por uma série de entradas) em uma série de modelos de doenças que afetam o sistema nervoso central. As vantagens da resposta optomotor e do labirinto Y incluem sensibilidade, velocidade de teste, uso de respostas inatas (treinamento não é necessário), e a capacidade de ser realizado em animais acordados (não anestesiados). Aqui, os protocolos são descritos tanto para a resposta optomotor quanto para o labirinto Y e exemplos de seu uso mostrados em modelos de diabetes tipo I e Tipo II. Os métodos incluem preparação de roedores e equipamentos, desempenho da resposta optomotor e o labirinto Y, e análise de dados pós-teste.

Introdução

Mais de 463 milhões de pessoas vivem com diabetes, tornando-se uma das maiores epidemias globais de ^doenças1. Uma das complicações graves decorrentes do diabetes é a retinopatia diabética (DR), uma das principais causas de cegueira para adultos americanos em idade de ^trabalho2. Nos próximos 30 anos, projeta-se que o percentual da população em risco de DR dobre, por isso é crucial encontrar novas formas de diagnosticar a DR em seus estágios iniciais para prevenir e mitigar o desenvolvimento da ^DR3. A DR tem sido convencionalmente considerada uma doença ^{vascular4,5,6}. No entanto, agora com evidência de disfunção neuronal e apoptose na retina que precede a patologia vascular, a DR é definida como ter componentes neuronais e vasculares4,5,6,7,8,9. Uma maneira de diagnosticar a DR seria examinar anormalidades neurais na retina, um tecido que pode ser mais vulnerável ao estresse oxidativo e à tensão metabólica do diabetes do que outros tecidos ^neurais10.

Declínios na função cognitiva e motora também ocorrem com diabetes e são frequentemente correlacionados com alterações na retina. Indivíduos mais velhos com diabetes tipo II retratam pior desempenho cognitivo básico e apresentam declínio cognitivo mais exacerbado do que os participantes de ^controle11. Além disso, a retina foi estabelecida como uma extensão do sistema nervoso central e patologias podem se manifestar na ^retina12. Clinicamente, a relação entre retina e cérebro tem sido estudada no contexto do Alzheimer e outras doenças, mas não é comumente explorada com diabetes12,13,14,15,16. Alterações no cérebro e na retina durante a progressão do diabetes podem ser exploradas usando modelos animais, incluindo o rato STZ (um modelo de diabetes tipo I no qual a toxina, estreptozotocina ou STZ, é usada para danificar células beta pancreáticas) e o rato Goto-Kakizaki (um modelo poligênico de diabetes tipo II no qual os animais desenvolvem hiperglicemia espontaneamente por volta das 3 semanas de idade). Neste protocolo, é fornecida uma descrição para o labirinto Y e a resposta optomotor para avaliar alterações cognitivas e visuais em roedores diabéticos, respectivamente. A resposta optomotor (OMR) avalia a frequência espacial (semelhante à acuidade visual) e a sensibilidade ao contraste, monitorando movimentos característicos de rastreamento reflexivo da cabeça para medir limiares visuais para cada ^olho17. A frequência espacial refere-se à espessura ou fineza das barras, e a sensibilidade ao contraste refere-se à quantidade de contraste entre as barras e o fundo (Figura 1E). Enquanto isso, o labirinto Y testa a memória espacial de curto prazo e a função exploratória, observada através de alternâncias espontâneas e entradas através dos braços do labirinto.

Ambos os testes podem ser realizados em animais acordados e não anestesiados e têm a vantagem de capitalizar as respostas inatas dos animais, o que significa que eles não necessitam de treinamento. Ambos são relativamente sensíveis, pois podem ser usados para detectar déficits no início da progressão do diabetes em roedores, e confiáveis, na forma de produzir resultados que se correlacionam com outros testes visuais, retinais ou comportamentais. Além disso, o uso do OMR e do labirinto Y em conjunto com testes como eletroretinograma e tomografia de coerência óptica pode fornecer informações sobre quando alterações retina, estrutural e cognitiva se desenvolvem em relação umas às outras em modelos de doenças. Essas investigações podem ser úteis na identificação de degenerações neurais que ocorrem devido ao diabetes. Em última análise, isso poderia levar a novos métodos de diagnóstico que efetivamente identificam a DR em estágios iniciais de progressão.

Os sistemas OMR e Y-maze usados para desenvolver este protocolo estão descritos na Tabela de Materiais. Pesquisas anteriores sobre o OMR, por Prusky et ^al.18, e o labirinto Y, de Maurice et ^al.19, foram usados como ponto de partida para desenvolver este protocolo.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais dos Veteranos de Atlanta e conformes com o guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório (NIH Publications, ^8ª edição, atualizada em 2011).

1. A resposta optomotor (RM)

1. Configurar o aparelho OMR (detalhes sobre aparelhos e software em Tabela de Materiais)
   1. Escolha a plataforma de tamanho apropriado para o roedor: mouse, rato ou rato grande/prejudicado (Figura 1A).
   2. Abra o software OMR, que deve abrir para uma janela com várias guias de opções e uma transmissão de vídeo ao vivo do interior do tambor OMR/virtual (Figura 1B). Aproxime-se ou desça com a câmera de vídeo conforme necessário para que a plataforma e seus arredores sejam visíveis.
   3. Observe os ícones ao longo do lado esquerdo da imagem ao vivo (Figura 1C). Clique no ícone de asterisco e no ícone de listras giratórias para que as listras verdes e as listras giratórias verdes desapareçam da alimentação ao vivo.
   4. Clique no ícone da bússola para que um círculo verde e duas linhas perpendiculares apareçam. Estique o círculo verde para que ele se alinhe perfeitamente com o círculo preto na plataforma, o que garantirá que o OMR esteja perfeitamente alinhado.
   5. Clique no ícone da bússola porque não é necessário ver o círculo durante o teste. Clique no ícone de asterisco verde e no ícone de listras giratórias verdes para fazê-los reaparecer. Note que as listras verdes giram na mesma direção que as listras do tambor, permitindo que o pesquisador conheça a direção das listras.
   6. Clique na guia Teste . Em Teste, clique na guia Psicofísica . Em Limiar, selecione Frequência para medir a frequência espacial.
      NOTA: O software OMR usa um paradigma de escada para calcular automaticamente a frequência espacial (SF). O contraste será mantido em 100%.
   7. Em Teste, clique na guia Predefinições . Selecione as configurações padrão para ^Mouse18 ou ^Rat20.
   8. Em Teste, clique na guia Em branco . Verifique a caixa Blank on Tracking , que pausará as listras/apagará as telas do computador no tambor sempre que o mouse estiver clicado com o botão direito do mouse.
   9. Clique na guia Resultados , que é onde os resultados do teste serão exibidos.
2. Avaliar a frequência espacial
   1. Coloque o roedor na plataforma circular no centro da câmara de realidade virtual composta por quatro monitores de computador que mostram grades verticais de ondas seno circulando a câmara a uma velocidade de 12°/s (Figura 1D).
   2. Observe que a câmera de vídeo posicionada na parte superior da câmara está projetando o comportamento do roedor ao vivo no monitor do computador.
   3. Procure a presença ou ausência de ações reflexivas pela cabeça do roedor enquanto as grades se movem no sentido horário ou anti-horário. Certifique-se de que as barras ilustradas estão visíveis no programa — elas mostrarão a direção do movimento de grade.
      1. Cuidado com a cabeça do roedor para se mover na mesma direção que as grades. Espere até que haja uma perseguição suave, não explosões erráticas de movimento da cabeça, para contá-lo como rastreamento.
      2. Clique em Sim ou Não conforme apropriado. Observe que o SF começará com 0,042 cyc/deg e ajustará a cada sim e não para se tornar mais fácil ou mais difícil (Figura 1E). Clique em Redefinir se o teste precisa ser reiniciado devido a cliques acidentais ou incorretos de sim e não.
   4. À medida que o roedor é testado, certifique-se de manter o asterisco posicionado sobre a cabeça do roedor.
      NOTA: Este tem dois efeitos: 1) Mantém a frequência espacial correta. Se o asterisco estiver posicionado entre os ombros, por exemplo, a frequência espacial será mais baixa e as barras serão mais fáceis de ver, resultando em uma pontuação falsamente alta. 2) Para roedores com leves movimentos da cabeça, o asterisco torna mais fácil avaliar se a cabeça está realmente se movendo.
   5. Observe o sistema para dizer "Feito" quando a frequência espacial do roedor é atingida. Observe que os botões Sim e Não não serão mais clicáveis.
   6. Clique na guia Resultados , que exibirá a frequência espacial para o olho esquerdo, olho direito e olhos combinados.
      NOTA: Às vezes o software é definido de tal forma que os resultados são invertidos, ou seja, o olho direito é relatado como o olho esquerdo e o olho esquerdo é relatado como o olho direito. Isso foi descoberto ao avaliar roedores que tinham apenas um olho lesado em um modelo de glaucoma.
3. Avalie a sensibilidade ao contraste
   NOTA: O teste de sensibilidade ao contraste pode ser realizado imediatamente após a etapa de medição da frequência espacial ou por conta própria no mesmo dia ou em um dia diferente se o roedor aparecer cansado após o teste de frequência espacial (siga os passos 1-2.2 se apenas testar a sensibilidade ao contraste).
   1. Clique na guia Teste e, em seguida, na guia Psicofísica . Em Limiar, selecione Contraste (único) para medir a sensibilidade ao contraste.
   2. Também usando um paradigma de escada, comece a ralar com a constante SF no pico da curva de Sensibilidade ao Contraste (CS). Para fazer isso, clique na guia Estímulo e , em seguida, na guia Grades . Na caixa de Frequência Espacial , tipo 0,064 para ratos e 0,103 para camundongos.
   3. Comece o contraste em 100% e procure os mesmos movimentos reflexivos da cabeça vistos durante os testes de frequência espacial. Observe que o contraste diminuirá à medida que o teste progride até que o roedor não tenha mais movimentos reflexivos da cabeça em resposta ao estímulo (Figura 1E).
   4. Observe que o sistema diga "Feito" e os botões Sim e Não não sejam mais clicáveis uma vez que o roedor não responda mais ao estímulo visual e o limiar de sensibilidade ao contraste tenha sido atingido. Clique na guia Resultados , onde a sensibilidade de contraste para o olho esquerdo, olho direito e olhos combinados será listada.
4. Realizar análises pós-teste
   1. Para estudos de retinopatia diabética, onde se espera que ambos os olhos tenham déficits semelhantes, use o escore combinado (média dos olhos direito e esquerdo) para análise. Para modelos que causam danos diferenciais aos olhos (ou seja, lesão por explosão ou glaucoma), mantenha os dados do olho esquerdo e direito separados.
   2. Para Frequência Espacial, utilize escores brutos (os dados da guia Resultados ) para análise e média desses escores juntos por grupo (ou seja, diabético, controle, etc.).
   3. Para sensibilidade de contraste, use o valor bruto para calcular a sensibilidade de contraste relatada pelo contraste michelson de uma medição anterior da luminância da tela.

2. O labirinto Y

1. Prepare roedores para testes
   1. Adapte os roedores ao quarto por 30 minutos antes do teste.
      NOTA: O pesquisador pode permanecer na sala com as luzes acesas, mas deve permanecer em silêncio durante este tempo.
   2. Limpe o labirinto Y com solução de higienização segura para os animais e limpe toda a solução de higienização com toalhas de papel. Certifique-se de que o labirinto está seco.
2. Conduza o labirinto Y
   1. Rotule o braço inicial do labirinto Y como B e os outros 2 braços como A e C (Figura 2A). Coloque um roedor no braço mais próximo do pesquisador (braço B) perto do centro do labirinto Y. Uma vez colocado o roedor, inicie o temporizador (detalhes sobre labirinto e temporizador em Tabela de Materiais).
      1. Permita que cada roedor explore o labirinto Y por 8 minutos. Faça gravações durante este tempo e observe quaisquer observações. Sente-se a vários metros do labirinto enquanto o mantém à vista e evite fazer qualquer barulho.
      2. Registo o local de partida como A, e cada vez que o roedor faz uma entrada em um novo braço, registe a nova localização do roedor (Figura 2B). Defina uma entrada como todos os quatro membros do roedor estar em um dos braços.
      3. Cuidado com os roedores para se esconderem e permanecerem parados em um braço do labirinto. Se o roedor permanecer no mesmo local por mais de 60 anos e não parecer mostrar comportamento exploratório, mova o roedor em direção ao centro do labirinto Y, e continue o julgamento.
   2. Após cada roedor, remova as fezes e limpe o labirinto com solução higienizadora.
      1. Certifique-se de que toda a solução de higienização seja limpa com toalhas de papel e o labirinto esteja completamente seco antes de colocar o próximo roedor no labirinto.
3. Calcular a alternância espontânea e o comportamento exploratório
   1. Calcule o comportamento exploratório como o número total de entradas feitas durante 8 min.
   2. Calcular a cognição espacial medida pela alternância espontânea:
      o número de alternâncias bem sucedidas/(o número total de entradas - 2)
      1. Defina uma alternância bem sucedida à medida que o roedor se move para três locais diferentes sequencialmente (Exemplo: ABC, CAB, BCA, etc.). Observe cada alternância bem sucedida (Figura 2B).
      2. Se os movimentos foram registrados como ACABCABABCABC, desconsidere os dois locais iniciais no cálculo da alternância espontânea (de tal forma que haja 11 movimentos no denominador). Conte o número de movimentos precisos (movimentos precisos = 8). Calcule a precisão percentual como: 8/(13 - 2) = 72,7%.

Resultados

O OMR é considerado bem sucedido se limiares de frequência espacial e sensibilidade ao contraste podem ser obtidos a partir de um roedor. Aqui, o uso da RM Para avaliar a frequência espacial é ilustrado no controle ingênuo ratos Brown-Noruega e Long-Evans, ambos jovens (3-6 meses) e envelhecidos (9-12 meses). Ratos da Noruega Marrom normalmente mostram uma frequência espacial mais alta do que os ratos de Long-Evans. Além disso, observou-se um efeito de envelhecimento na frequência espacial nos ratos de Long-Evans...

Discussão

O OMR e o labirinto Y permitem a avaliação não invasiva da função visual e déficits de função cognitiva em roedores ao longo do tempo. Neste protocolo, o OMR e o Labirinto Y foram demonstrados para rastrear déficits visuais e cognitivos em modelos de roedores de diabetes.

Passos críticos no protocolo

A OMR

Alguns pontos importantes a serem considerados ao realizar a OMR para avaliar a função visual são os par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		OMR apparatus & software
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze apparatus	San Diego Instruments	7001-043	Available specifically for rats