Diyabetik Sıçanlarda Y-Labirenti Yoluyla Optomotor Yanıtı ve Bilişsel İşlev Yoluyla Görsel İşlevin Davranışsal Değerlendirmesi

Özet

Diyabet sonucu hem gözlerde hem de beyinde nöral dejenerasyon kemirgenler üzerinde yapılan davranışsal testlerle gözlemlenebilir. Mekansal bilişin bir ölçüsü olan Y labirenti ve görsel fonksiyonun bir ölçüsü olan optomotor yanıtı, hem potansiyel teşhisler hem de tedaviler hakkında fikir sağlar.

Özet

Optomotor yanıtı ve Y labirenti, sırasıyla görsel ve bilişsel işlevi değerlendirmek için yararlı davranışsal testlerdir. Optomotor yanıtı, diyabetik retinopati de dahil olmak üzere bir dizi retina hastalığı modelinde zaman içinde mekansal frekans (SF) ve kontrast duyarlılığı (CS) eşiklerindeki değişiklikleri izlemek için değerli bir araçtır. Benzer şekilde, Y labirenti, merkezi sinir sistemini etkileyen bir dizi hastalık modelinde mekansal bilişi (spontan değişimle ölçüldüğü gibi) ve keşif davranışını (bir dizi girişle ölçüldüğü gibi) izlemek için kullanılabilir. Optomotor yanıtının ve Y labirentinin avantajları arasında hassasiyet, test hızı, doğuştan gelen yanıtların kullanımı (eğitime gerek yoktur) ve uyanık (uyuşturulmamış) hayvanlar üzerinde gerçekleştirilme yeteneği bulunur. Burada, hem optomotor yanıtı hem de Y labirenti ve Tip I ve Tip II diyabet modellerinde gösterilen kullanım örnekleri için protokoller açıklanmaktadır. Yöntemler arasında kemirgenlerin ve ekipmanların hazırlanması, optomotor yanıtının ve Y labirentinin performansı ve test sonrası veri analizi yer alır.

Giriş

463 milyondan fazla insan diyabetle yaşıyor ve bu da onu en büyük küresel hastalık salgınlarından biri haline ^getiriyor1. Diyabetten kaynaklanan ciddi komplikasyonlardan biri, çalışma çağındaki Amerikalı yetişkinler için körlüğün önde gelen bir nedeni olan diyabetik retinopatidir ^(DR). Önümüzdeki 30 yıl içinde, DR için risk altındaki nüfusun yüzdesinin iki katına katlanarak tahmin edildiği, bu nedenle DR gelişimini önlemek ve azaltmak için daha önceki aşamalarında DR tanısının yeni yollarını bulmak çok ^önemlidir3. DR'nin geleneksel olarak vasküler bir hastalık olduğu düşünülmektedir4,5,6. Bununla birlikte, şimdi vasküler patolojiden önce retinada nöronal disfonksiyon ve apoptoz kanıtı ile DR nöronal ve vasküler bileşenlere sahip olarak tanımlanmıştır4,5,6,7,8,9. DR tanısının bir yolu, diğer sinir dokusuna göre diyabetten oksidatif strese ve metabolik zorlanmaya karşı daha savunmasız olabilecek bir doku olan retinadaki sinirsel anormallikleri incelemek ^olacaktır10.

Bilişsel ve motor fonksiyondaki düşüşler diyabetle de ortaya çıkar ve genellikle retina değişiklikleri ile ilişkilidir. Tip II diyabetli yaşlı bireyler daha kötü temel bilişsel performans gösterir ve kontrol katılımcılarından daha şiddetli bilişsel düşüş ^gösterir11. Ek olarak, retina merkezi sinir sisteminin bir uzantısı olarak kurulmuştur ve patolojiler retinada kendini ^{gösterebilir12}. Klinik olarak, retina ve beyin arasındaki ilişki Alzheimer ve diğer hastalıklar bağlamında incelenmiştir, ancak diyabet ile yaygın olarak araştırılmamıştır12,13,14,15,16. Diyabetin ilerlemesi sırasında beyin ve retinadaki değişiklikler, STZ sıçanı (toksin, streptozotosin veya STZ'nin pankreas beta hücrelerine zarar vermek için kullanıldığı Tip I diyabet modeli) ve Goto-Kakizaki sıçanı (hayvanların yaklaşık 3 haftalıkken kendiliğinden hiperglisemi geliştirdiği Tip II diyabetin polijenik bir modeli) dahil olmak üzere hayvan modelleri kullanılarak araştırılabilir. Bu protokolde, sırasıyla diyabetik kemirgenlerdeki bilişsel ve görsel değişiklikleri değerlendirmek için Y labirenti ve optomotor yanıtı için bir açıklama sağlanmıştır. Optomotor yanıtı (OMR), her göz için görsel eşikleri ölçmek için karakteristik refleksif kafa izleme hareketlerini izleyerek mekansal frekansı (görme keskinliğine benzer) ve kontrast hassasiyetini ^{değerlendirir17}. Uzamsal frekans çubukların kalınlığını veya inceliğini, kontrast duyarlılığı ise çubuklar ile arka plan arasında ne kadar kontrast olduğunu ifade eder (Şekil 1E). Bu arada, Y-labirenti, labirentin kollarından spontan değişimler ve girişler yoluyla gözlemlenen kısa süreli mekansal hafızayı ve keşif fonksiyonunu test eder.

Her iki test de uyanık, uyuşturulmamış hayvanlarda yapılabilir ve hayvanların doğuştan gelen tepkilerinden yararlanma avantajına sahiptir, yani eğitim gerektirmezler. Her ikisi de kemirgenlerde diyabetin ilerlemesinin başlarında açıkları tespit etmek için kullanılabileceği için nispeten hassastır ve diğer görsel, retinal veya davranışsal testlerle ilişkili sonuçlar ürettikleri için güvenilirdir. Ek olarak, OMR ve Y labirentinin elektroretinogram ve optik tutarlılık tomografi taramaları gibi testlerle birlikte kullanılması, hastalık modellerinde retinal, yapısal ve bilişsel değişikliklerin ne zaman geliştiği hakkında bilgi sağlayabilir. Bu araştırmalar diyabete bağlı olarak ortaya çıkan nöral dejenerasyonların tanımlanmasında yararlı olabilir. Sonuç olarak, bu, ilerlemenin erken aşamalarında DR'yi etkili bir şekilde tanımlayan yeni tanı yöntemlerine yol açabilir.

Bu protokolü geliştirmek için kullanılan OMR ve Y labirent sistemleri Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. OMR ile ilgili önceki araştırmalar, Prusky ve ^ark.18 ve Maurice ve ^ark.19 tarafından Y labirenti, bu protokolü geliştirmek için başlangıç noktası olarak kullanılmıştır.

Protokol

Tüm prosedürler Atlanta Veterans Affairs Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzuna uygundu (NIH Yayınları, 8^. baskı, güncellendi 2011).

1. Optomotor yanıtı (OMR)

1. OMR cihazının kurulumu (Malzeme Tablosundaki cihaz ve yazılımla ilgili ayrıntılar)
   1. Kemirgen için uygun boyutta bir platform seçin: fare, sıçan veya büyük / bozulmuş sıçan (Şekil 1A).
   2. Birkaç seçenek sekmesi ve OMR / sanal tamburun içinin canlı video akışına sahip bir pencereye açılması gereken OMR yazılımını açın (Şekil 1B). Platformun ve çevresinin görünür olması için gerektiğinde video kamerayla yakınlaştırın veya uzaklaştırın.
   3. Canlı görüntünün sol tarafındaki simgelere dikkat edin (Şekil 1C). Yıldız işareti simgesine ve dönen çizgiler simgesine tıklayın, böylece hem yeşil yıldız işareti hem de yeşil dönen çizgiler canlı yayından kaybolur.
   4. Pusula simgesine tıklayın, böylece yeşil bir daire ve iki dik çizgi görünür. Yeşil daireyi, platformdaki siyah daireyle mükemmel bir şekilde hizalanacak şekilde uzatın, bu da OMR'nin mükemmel bir şekilde hizalanmış olmasını sağlayacaktır.
   5. Test sırasında daireyi görmek gerekli olmadığından pusula simgesine tıklayın. Bunları yeniden ortaya çıkarmak için yeşil yıldız simgesine ve yeşil dönen çizgiler simgesine tıklayın. Yeşil çizgilerin tamburdaki çizgiler ile aynı yönde döndüğünü ve araştırmacının çizgilerin yönünü bilmesini sağladığını unutmayın.
   6. Test sekmesine tıklayın. Test altında Psikofizik sekmesine tıklayın. Eşik altında, uzamsal frekansı ölçmek için Sıklık'ı seçin.
      NOT: OMR yazılımı, uzamsal frekansı (SF) otomatik olarak hesaplamak için bir merdiven paradigması kullanır. Kontrast %100'de korunacaktır.
   7. Test altında Hazır Ayarlar sekmesine tıklayın. ^Mouse18 veya ^Rat20 için varsayılan ayarları seçin.
   8. Sınama'nın altında Boş sekmesine tıklayın. Fare sağ tıklatıldığında tamburdaki bilgisayar ekranlarını duraklatır/boş olan İzlemede Boş kutusunu işaretleyin.
   9. Test sonuçlarının görüntüleneceği Sonuçlar sekmesine tıklayın.
2. Uzamsal sıklığı değerlendir
   1. Kemirgenleri, odanın etrafında 12°/s hızında dönen dikey sinüs dalga ızgaralarını gösteren dört bilgisayar monitöründen oluşan sanal gerçeklik odasının ortasındaki dairesel platforma yerleştirin (Şekil 1D).
   2. Odanın üst kısmına yerleştirilmiş video kameranın kemirgenlerin davranışını canlı olarak bilgisayar monitörüne yansıttığına dikkat edin.
   3. ızgaralar saat yönünde veya saat yönünün tersine hareket ederken kemirgen başı tarafından refleksif eylemlerin varlığını veya yokluğunu arayın. Programda resimli çubukların görünür olduğundan emin olun;
      1. Kemirgen başının ızgaralarla aynı yönde hareket etmesini izleyin. İzleme olarak saymak için dengesiz kafa hareketi patlamaları değil, sorunsuz bir takip olana kadar bekleyin.
      2. Uygun şekilde Evet veya Hayır'ı tıklatın. SF'nin 0.042 cyc/deg ile başlayacağını ve daha kolay veya daha zor hale gelmek için her evet ve hayır ile ayarlanacağını unutmayın (Şekil 1E). Evet ve hayır'ın yanlışlıkla veya yanlış tıklatılması nedeniyle testin sıfırlanması gerekiyorsa Sıfırla'ya tıklayın.
   4. Kemirgen test edilirken, yıldız işaretini kemirgen başının üzerine yer tuttuğunuzdan emin olun.
      NOT: Bunun iki etkisi vardır: 1) Doğru uzamsal frekansı korur. Yıldız işareti omuzlar arasında konumlandırılırsa, örneğin, uzamsal frekans daha düşük olacaktır ve çubukların görülmesi daha kolay olacaktır, bu da yanlış yüksek bir puana neden olacaktır. 2) Hafif kafa hareketlerine sahip kemirgenler için yıldız işareti, başın gerçekten hareket edip etmediğini ölçmeyi kolaylaştırır.
   5. Kemirgenlerin uzamsal frekansa ulaşıldığında sistemin "Bitti" demeye dikkat edin. Evet ve Hayır düğmelerinin artık tıklatılamayacağını unutmayın.
   6. Sol göz, sağ göz ve birleşik gözler için uzamsal frekansı görüntüleyecek Sonuçlar sekmesine tıklayın.
      NOT: Bazen yazılım, sonuçların çevrilmiş olarak ayarlanır, yani sağ göz sol göz, sol göz ise sağ göz olarak bildirililir. Bu, glokom modelinde sadece bir gözü lezyonlu kemirgenleri değerlendirirken keşfedildi.
3. Karşıtlık duyarlılığını değerlendirin
   NOT: Kontrast Duyarlılığı testi, mekansal frekans ölçüm adımından hemen sonra veya kemirgen mekansal frekans testinden sonra yorgun görünüyorsa aynı gün veya farklı bir günde kendi başına yapılabilir (sadece kontrast duyarlılığını test ediyorsanız 1-2.2 adımlarını izleyin).
   1. Test sekmesine ve ardından Psikofizik sekmesine tıklayın. Eşik altında, karşıtlık duyarlılığını ölçmek için Karşıtlık 'ı (tek) seçin.
   2. Ayrıca bir merdiven paradigması kullanarak, Kontrast Duyarlılığı (CS) eğrisinin zirvesinde SF sabiti ile ızgaralara başlayın. Bunu yapmak için , Uyarıcı sekmesine ve ardından Rendeler sekmesine tıklayın. Mekansal Frekans kutusuna sıçanlar için 0.064 ve fareler için 0.103 yazın.
   3. Kontrastı %100'den başlatın ve mekansal frekans testi sırasında görülen refleksif kafa hareketlerini arayın. Kemirgen uyarana yanıt olarak refleksif kafa hareketlerine sahip olmayana kadar test ilerledikçe kontrastın azalacağını unutmayın (Şekil 1E).
   4. Kemirgen artık görsel uyarana yanıt vermedikten ve kontrast hassasiyeti eşiğine ulaşıldıktan sonra sistemin "Bitti" ve Evet ve Hayır düğmelerinin artık tıklanamayacağını izleyin. Sol göz, sağ göz ve birleşik gözler için kontrast hassasiyetinin listelendiği Sonuçlar sekmesine tıklayın.
4. Test sonrası analiz gerçekleştirme
   1. Her iki gözün de benzer açıklara sahip olmasının beklendiği diyabetik retinopati çalışmaları için analiz için kombine skoru (sağ ve sol göz ortalaması) kullanın. Gözlere diferansiyel hasara neden olan modeller için (yani patlama yaralanması veya glokom), sol ve sağ göz verilerini ayrı tutun.
   2. Uzamsal Sıklık için, analiz için ham puanları ( Sonuçlar sekmesindeki veriler) kullanın ve bu puanları gruba göre (örneğin, diyabetik, kontrol vb.) ortalama olarak kullanın.
   3. Kontrast Duyarlılığı için, ekranın parlaklığının önceki ölçümünden Michelson kontrastı tarafından bildirilen kontrast hassasiyetini hesaplamak için ham değeri kullanın.

2. Y labirenti

1. Kemirgenleri test için hazırlayın
   1. Kemirgenleri test etmeden önce 30 dakika boyunca odaya uyarla.
      NOT: Araştırmacı ışıklar açık odada kalabilir, ancak bu süre zarfında sessiz kalmalıdır.
   2. Y labirentini hayvanlar için güvenli sanitasyon çözeltisi ile temizleyin ve tüm sanitasyon solüsyonlarını kağıt havlularla silin. Labirentin kuru olduğundan emin olun.
2. Y labirentini yürütün
   1. Y labirentinin ilk kolunu B, diğer 2 kolunu A ve C olarak etiketle (Şekil 2A). Y labirentinin merkezine yakın araştırmacıya (kol B) en yakın kola bir kemirgen yerleştirin. Kemirgen yerleştirildikten sonra, zamanlayıcıyı başlatın ( Malzeme Tablosunda labirent ve zamanlayıcı ile ilgili ayrıntılar).
      1. Her kemirgen 8 dakika boyunca Y labirentini keşfetmesine izin verin. Bu süre zarfında kayıtları alın ve gözlemleri not edin. Görünürde tutarken labirentten birkaç metre uzağa oturun ve gürültü yapmaktan kaçının.
      2. Başlangıç konumunu A olarak kaydedin ve kemirgen her yeni kola giriş yaptığında, kemirgenlerin yeni konumunu kaydedin (Şekil 2B). Bir girişi kemirgenlerin dört uzvu olarak tanımlayın.
      3. Kemirgenlerin labirentin bir kolunda saklanmasını ve sabit kalmasını izleyin. Kemirgen 60 s'den fazla aynı noktada kalırsa ve keşif davranışı göstermiyorsa, kemirgenleri Y labirentinin merkezine doğru hareket ettirin ve denemeye devam edin.
   2. Her kemirgenden sonra, dışkıyı çıkarın ve labirenti sterilize edici çözelti ile temizleyin.
      1. Bir sonraki kemirgen labirente yerleştirmeden önce tüm sanitasyon çözeltisinin kağıt havlularla silinip silinmesini ve labirentin tamamen kuru olduğundan emin olun.
3. Spontan değişim ve keşif davranışını hesaplama
   1. Keşif davranışını 8 dakika boyunca yapılan toplam giriş sayısı olarak hesaplayın.
   2. Spontan değişimle ölçülen mekansal bilişi hesaplayın:
      başarılı değişim sayısı/(toplam giriş sayısı - 2)
      1. Kemirgen sırayla üç farklı konuma taşınırken başarılı bir değişim tanımlayın (Örnek: ABC, CAB, BCA, vb.). Her başarılı değişime dikkat edin (Şekil 2B).
      2. Hareketler ACABCABABCABC olarak kaydedilmişse, spontan değişimi hesaplarken ilk iki başlangıç yerini göz ardı edin (paydada 11 hareket olacak şekilde). Doğru hareketlerin sayısını sayın (doğru hareketler = 8). Yüzde doğruluğunu şu şekilde hesaplayın: 8/(13 - 2) = %72,7.

Sonuçlar

Bir kemirgenden uzamsal frekans ve kontrast duyarlılık eşikleri elde edilebilirse OMR başarılı olarak kabul edilir. Burada, mekansal sıklığı değerlendirmek için OMR kullanımı, hem genç (3-6 ay) hem de yaşlı (9-12 ay) kahverengi-Norveç ve Long-Evans sıçanlarında naif kontrolde gösterilmiştir. Kahverengi-Norveç sıçanları tipik olarak Long-Evans sıçanlarından daha yüksek bir taban çizgisi mekansal frekans gösterir. Ayrıca Long-Evans sıçanlarında mekansal sıklık üzerinde yaşlanma etki...

Tartışmalar

OMR ve Y labirenti, zaman içinde kemirgenlerde görsel fonksiyon ve bilişsel işlev açıklarının invaziv olmayan değerlendirilmesine izin verir. Bu protokolde, OMR ve Y labirentinin kemirgen diyabet modellerinde görme ve bilişsel açıkları izlediği gösterilmiştir.

Protokolde kritik adımlar

The OMR

Görsel işlevi değerlendirmek için OMR'yi gerçekleştirirken dikkate alınması gereken bazı önemli noktal...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		OMR apparatus & software
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze apparatus	San Diego Instruments	7001-043	Available specifically for rats