당뇨병 쥐의 Y-미로를 통한 광운동 반응 및 인지 기능을 통한 시각 기능의 행동 평가

요약

당뇨병의 결과로 눈과 두뇌 둘 다에 있는 신경 변성은 설치류에 행해진 행동 시험을 통해 관찰될 수 있습니다. Y-미로, 공간 인식의 측정, 및 광운동 반응, 시각 기능의 측정, 둘 다 잠재적인 진단 및 치료에 대 한 통찰력을 제공.

초록

광차 반응과 Y-미로는 각각 시각 및 인지 기능을 평가하는 데 유용한 행동 테스트입니다. 광두운동 반응은 당뇨 망막증을 포함한 다수의 망막 질환 모델에서 시간이 지남에 따라 공간 주파수(SF) 및 콘트라스트 감도(CS) 임계값의 변화를 추적하는 귀중한 도구입니다. 유사하게, Y-미로는 중추 신경계에 영향을 미치는 여러 질병 모델에서 공간 인식(자발적인 교대로 측정된 대로) 및 탐사 행동(여러 항목으로 측정된 대로)을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 광차 반응과 Y-미로의 장점은 감도, 테스트 속도, 타고난 응답의 사용 (훈련이 필요하지 않음), 깨어있는 (non-마취) 동물에서 수행 할 수있는 능력을 포함한다. 여기서, 프로토콜은 타입-I 및 타입 II 당뇨병의 모형에 도시된 그들의 사용의 optomotor 반응 그리고 Y-미로 및 예 둘 다에 기술됩니다. 방법에는 설치류 및 장비의 준비, 광전차 반응 및 Y-미로의 성능 및 테스트 후 데이터 분석이 포함됩니다.

서문

4억 6,300만 명 이상이 당뇨병환자로 살고 있어 세계 최대의 질병 전염병 ¹중 하나입니다. 당뇨병에서 발생하는 심각한 합병증 중 하나는 당뇨병 성 망막증 (DR), 노동 연령 미국 성인을위한 실명의 주요 원인². 향후 30년 동안 DR의 위험에 처한 인구의 비율은 두 배로 증가할 것으로 예상되므로 ^{DR 개발을 예방}하고 완화하기 위해 초기 단계에서 DR을 진단하는 새로운 방법을 찾는 것이 중요합니다3. DR은 전통적으로 혈관 질환으로 생각되었다^4,5,6. 그러나, 지금 혈관 병리학 앞에 망막에 있는 신경 기능 장애 및 세포멸증의 기록으로, DR는 신경 및 혈관 분대^4,5,6,7,8,9가 있기 위하여 정의됩니다. DR을 진단하는 한 가지 방법은 망막에 있는 신경 이상을 검토하는 것입니다, 다른 신경 조직 보다는 당뇨병에서 산화 긴장 및 신진 대사 긴장에 더 취약할 지도 모르다 조직¹⁰.

인지 기능 및 운동 기능의 감소는 또한 당뇨병과 함께 발생하고 수시로 망막 변경과 상관됩니다. 타입 II 당뇨병을 가진 더 오래된 개별은 더 나쁜 기준선 인지 성과를 묘사하고 통제 참가자보다는 더 악화된 인지 쇠퇴를 보여줍니다¹¹. 추가적으로, 망막은 중앙 신경계의 연장으로 설치되고 병리는 망막¹²에서 명시할 수 있습니다. 임상적으로, 망막과 두뇌 사이 관계는 알츠하이머병과 그밖 질병의 맥락에서 공부되었습니다 그러나 당뇨병으로 일반적으로 탐구되지 않습니다12,13,14,15,16. 당뇨병의 진행 도중 두뇌및 망막에 있는 변경은 STZ 쥐 (독소, 연쇄상 조토신 또는 STZ가 췌장 베타 세포를 손상하기 위하여 이용되는 타입-I 당뇨병의 모형) 및 고토-Kakizaki 쥐 (동물이 고혈당증을 개발하는 타입 II 당뇨병의 polygenic 모형)를 포함하여 동물 모형을 사용하여 탐구될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 당뇨병 설치류에 있는 인식 및 시각 변경을 평가하기 위하여 Y-미로 및 광전사 반응에 대한 설명이 각각 제공됩니다, 제공됩니다. 광운동 반응(OMR)은 각 ^eye17의 시각적 임계값을 측정하기 위해 특징적인 반사식 헤드 트래킹 움직임을 모니터링하여 공간 주파수(시각 시력과 유사)와 콘트라스트 감도를 평가합니다. 공간 주파수는 막대의 두께 또는 미세성을 나타내며, 대비 감도는 막대와 배경 사이에 얼마나 많은 대비가 있는지를 나타냅니다(그림 1E). 한편, Y-미로는 미로의 팔을 통해 자발적인 교대와 항목을 통해 관찰되는 단기 공간 기억과 탐사 기능을 테스트합니다.

두 테스트 모두 깨어 있는 비 마취 동물에서 수행 될 수 있으며 동물의 타고난 반응을 활용하는 이점이 있어 훈련이 필요하지 않습니다. 둘 다 상대적으로 민감하다는 점에서 설치류에서 당뇨병의 진행 초기에 적자를 감지하는 데 사용할 수 있으며, 다른 시각, 망막 또는 행동 테스트와 상관 관계가있는 결과를 생성한다는 점에서 신뢰할 수 있습니다. 또한, OMR 및 Y-미로를 전기 전세노그램 및 광학 일관성 단층 촬영 검사와 같은 테스트와 함께 사용하면 질병 모델에서 망막, 구조적 및 인지 변화가 서로 에 비해 발달할 때에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이 조사는 당뇨병 때문에 생기는 신경 변성 을 확인하는 에 유용할 수 있었습니다. 궁극적으로, 이것은 효과적으로 진행의 초기 단계에서 DR을 식별하는 새로운 진단 방법으로 이어질 수 있습니다.

이 프로토콜을 개발하는 데 사용되는 OMR 및 Y-미로 시스템은 재료 표에 설명되어 있습니다. OMR에 대한 이전 연구, Prusky 외.¹⁸에 의해, 그리고 Y-미로, 모리스 등 ^al.19에 의해, 이 프로토콜을 개발하는 출발점으로 사용되었다.

프로토콜

모든 절차는 애틀랜타 재향 군인 사무 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 국립 보건 원 가이드 (NIH 간행물, 8 ^판 , 업데이트 2011)에 부합했습니다.

1. 광차 반응 (OMR)

1. OMR 장치 설정(재료 표의 장치 및 소프트웨어에 대한 세부 정보)
   1. 설치류에 적합한 크기의 플랫폼을 선택하십시오: 마우스, 쥐 또는 크고 손상된 쥐(그림 1A).
   2. 옵션의 여러 탭과 OMR / 가상 드럼의 내부의 라이브 비디오 피드와 창에 열려야 OMR 소프트웨어를 엽니 다 (그림 1B). 플랫폼과 주변 환경이 보이면 필요에 따라 비디오 카메라를 확대 하거나 축소합니다.
   3. 라이브 이미지의 왼쪽을 따라 아이콘을 기록합니다(그림 1C). 별표 아이콘과 회전 줄무늬 아이콘을 클릭하여 녹색 별표와 녹색 회전 줄무늬가 라이브 피드에서 사라지않도록 합니다.
   4. 녹색 원과 두 개의 수직 선이 표시되도록 나침반 아이콘 을 클릭합니다. 녹색 원을 스트레칭하여 플랫폼의 검은 색 원과 완벽하게 정렬되어 OMR이 완벽하게 정렬되도록 합니다.
   5. 테스트 중에 원을 볼 필요가 없으므로 나침반 아이콘 을 클릭합니다. 녹색 별표 아이콘 과 녹색 회전 줄무늬 아이콘을 클릭하여 다시 나타납니다. 녹색 줄무늬가 드럼의 줄무늬와 같은 방향으로 회전하여 연구원이 줄무늬의 방향을 알 수 있습니다.
   6. 테스트 탭을 클릭합니다. 테스트 에서 심리 물리학 탭을 클릭합니다. 임계값 아래에서 주파수를 선택하여 공간 주파수를 측정합니다.
      참고: OMR 소프트웨어는 계단 패러다임을 사용하여 SF(공간 주파수)를 자동으로 계산합니다. 대비는 100%로 유지됩니다.
   7. 테스트 에서 사전 설정 탭을 클릭합니다. ^Mouse18 또는 ^Rat20의 기본 설정을 선택합니다.
   8. 테스트 에서 블랭킹 탭을 클릭합니다. 마우스가 마우스를 마우스오른쪽 단추로 클릭할 때마다 드럼의 컴퓨터 화면에서 줄무늬를 일시 중지/블랭크하는 추적 상자의 공백을 확인합니다.
   9. 테스트 결과가 표시되는 결과 탭을 클릭합니다.
2. 공간 주파수 평가
   1. 12°/s의 속도로 챔버를 돌고 있는 수직 사인파 격자를 보여주는 4개의 컴퓨터 모니터로 구성된 가상 현실 챔버의 중앙에 설치류를 배치합니다(도 1D).
   2. 챔버 상단에 위치한 비디오 카메라가 설치류의 동작을 컴퓨터 모니터에 실시간으로 투사합니다.
   3. 격자가 시계 방향 또는 반시계 방향으로 이동함에 따라 설치류의 머리에 의한 반사 작용의 존재 또는 부재를 찾습니다. 프로그램에 그림막대가 표시되는지 확인합니다.
      1. 설치류의 머리가 격자와 같은 방향으로 이동하는 것을 지켜보십시오. 헤드 모션의 불규칙한 파열이 아닌 매끄러운 추격이 있을 때까지 기다렸다가 추적으로 계산하십시오.
      2. 적절하게 예 또는 아니오를 클릭합니다. SF는 0.042 cyc/deg로 시작하여 각 예 및 아니오로 조정하여 더 쉽거나 더 어려워집니다(그림 1E). 예및 아니오의 우발적이거나 잘못된 클릭으로 테스트를 재설정해야 하는 경우 리셋을 클릭합니다.
   4. 설치류를 테스트할 때 설치류의 머리 위에 별표를 배치해야 합니다.
      참고: 이것은 두 가지 효과가 있습니다: 1) 올바른 공간 주파수를 유지합니다. 예를 들어, 별표가 어깨 사이에 위치하는 경우 공간 주파수가 낮아지고 막대를 쉽게 볼 수 있으므로 거짓으로 높은 점수를 받게 됩니다. 2) 머리 움직임이 약간 있는 설치류의 경우 별표는 머리가 실제로 움직이는지 여부를 쉽게 측정할 수 있게 합니다.
   5. 설치류의 공간 주파수에 도달하면 시스템이 "완료"라고 말하는 것을 지켜보십시오. 예 및 아니오 단추를 더 이상 클릭할 수 없습니다.
   6. 왼쪽 눈, 오른쪽 눈 및 결합된 눈의 공간 주파수를 표시하는 결과 탭을 클릭합니다.
      참고: 때로는 결과가 뒤집히기 위해 소프트웨어가 설정되기도 합니다, 즉, 오른쪽 눈은 왼쪽 눈으로 보고되고 왼쪽 눈은 오른쪽 눈으로 보고됩니다. 이것은 녹내장 모형에 있는 단 1개의 눈 병변이 있던 설치류를 평가할 때 발견되었습니다.
3. 대비 감도 평가
   참고: 콘트라스트 감도 테스트는 공간 주파수 테스트 후 설치류가 피로로 보이는 경우 같은 날 또는 다른 날에 공간 주파수 측정 단계 직후 또는 자체적으로 수행할 수 있습니다(대비 감도만 테스트하는 경우 1-2단계를 따르십시오).
   1. 테스트 탭을 클릭한 다음 심리 물리학 탭에서 클릭합니다. 임계값 아래에서 대비(단일)를 선택하여 대비 민감도를 측정합니다.
   2. 또한 계단 패러다임을 사용하여 콘트라스트 감도(CS) 곡선의 피크에서 SF 상수로 격자를 시작합니다. 이렇게 하려면 자극 탭을 클릭한 다음 Gratings 탭에서 클릭합니다. 공간 주파수 상자에서, 쥐에 대 한 0.064 유형 및 0.103 마우스에 대 한.
   3. 100%에서 콘트라스트를 시작하고 공간 주파수 테스트 중에 볼 수 있는 것과 동일한 반사식 헤드 움직임을 찾습니다. 설치류가 자극에 응하여 반사헤드 움직임을 더 이상 하지 않을 때까지 테스트가 진행됨에 따라 대비가 저하됩니다(그림 1E).
   4. 설치류가 더 이상 시각적 자극에 응답하지 않고 대비 감도 임계값에 도달하면 "완료"와 예 및 아니오 버튼을 더 이상 클릭할 수 없습니다. 왼쪽 눈, 오른쪽 눈 및 결합된 눈의 대비 감도가 나열되는 결과 탭을 클릭합니다.
4. 테스트 후 분석 수행
   1. 두 눈이 비슷한 적자를 가질 것으로 예상되는 당뇨병 망막증 연구의 경우 분석을 위해 합산 점수 (오른쪽 눈과 왼쪽 눈의 평균)를 사용합니다. 눈에 차동 손상을 일으키는 모델(예: 폭발 부상 또는 녹내장)의 경우 왼쪽 및 오른쪽 눈 데이터를 분리하십시오.
   2. 공간 주파수의 경우 원시 점수( 결과 탭의 데이터)를 사용하여 이러한 점수를 그룹별로 함께 분석하고 평균합니다(예: 당뇨병, 제어 등).
   3. 대비 감도의 경우 원시 값을 사용하여 미켈슨 대비로 보고된 콘트라스트 감도를 화면 의 휘도의 이전 측정값과 계산합니다.

2. Y-미로

1. 테스트를 위한 설치류 준비
   1. 테스트 전에 설치류를 30분 동안 방에 조정합니다.
      참고 : 연구원은 조명이 켜져있는 방에 남아있을 수 있지만이 시간 동안 침묵해야합니다.
   2. Y-미로를 동물에게 안전한 살균 용액으로 청소하고 종이 타월로 모든 살균 용액을 닦아냅니다. 미로가 건조한지 확인합니다.
2. Y-미로 실시
   1. Y-미로의 초기 암을 B로, 다른 2개의 팔을 A와 C로 레이블을 지정합니다(그림 2A). Y-미로의 중심 근처에 연구원(팔 B)과 가장 가까운 팔에 설치류 1개를 놓습니다. 설치류가 배치되면 타이머( 재료 표의 미로 및 타이머에 대한 세부 정보)를 시작합니다.
      1. 각 설치류가 8분 동안 Y-미로를 탐험할 수 있도록 허용합니다. 이 시간 동안 녹음을 가지고 어떤 관찰을 기록합니다. 미로에서 몇 미터 떨어진 곳에 앉아 시야에 보관하고 소음을 피하십시오.
      2. 시작 위치를 A로 기록하고 설치류가 새 팔에 들어갈 때마다 설치류의 새 위치를 기록합니다(그림 2B). 설치류의 네 개의 팔다리가 모두 팔 중 하나에 있는 것으로 항목을 정의합니다.
      3. 설치류가 미로의 한 팔에 숨기고 고정된 상태로 유지되는 것을 지켜보십시오. 설치류가 60s 이상 같은 장소에 남아 있고 탐색적 행동을 보이지 않는 경우 설치류를 Y-미로의 중심으로 이동하고 재판을 계속합니다.
   2. 각 설치류 후, 어떤 배설물제거하고 살균 용액으로 미로를 청소합니다.
      1. 모든 살균 용액이 종이 타월로 닦아내고 미로에 다음 설치류를 놓기 전에 미로가 완전히 건조되었는지 확인하십시오.
3. 자발적인 교대 및 탐색 동작 계산
   1. 8분 동안 이루어진 총 항목 수로 탐색 동작을 계산합니다.
   2. 자발적인 교대로 측정된 공간 인식을 계산합니다.
      성공적인 교대체 수/(총 출품작 수 - 2)
      1. 설치류가 세 개의 서로 다른 위치로 순차적으로 이동함에 따라 성공적인 교대를 정의합니다(예: ABC, CAB, BCA 등). 각 성공적인 교대조(그림 2B)에 유의하십시오.
      2. 움직임이 ACABCABABCABC로 기록된 경우 자발적인 교대조를 계산할 때 두 개의 초기 시작 위치를 무시합니다(분모에 11개의 움직임이 있음). 정확한 움직임 의 수를 계산합니다 (정확한 움직임 = 8). 8/(13 - 2) = 72.7%로 백분율 정확도를 계산합니다.

결과

OMR은 설치류로부터 공간 주파수 및 대비 감도 임계값을 얻을 수 있는 경우 성공한 것으로 간주됩니다. 여기서, 공간 주파수를 평가하기 위하여 OMR의 사용은 순진한 통제 브라운 노르웨이와 긴 에반스 쥐, 둘 다 젊은 (3-6 달) 및 나이 (9-12 달)에 도시됩니다. 갈색-노르웨이 쥐는 일반적으로 긴 에반스 쥐 보다 더 높은 기준선 공간 주파수를 보여줍니다. 또한, 공간 주파수에 대한 노화 효과는 긴 에반?...

토론

OMR과 Y-미로는 시간이 지남에 따라 설치류의 시각 기능 및 인지 기능 적자에 대한 비침습적 평가를 허용합니다. 이 프로토콜에서 OMR과 Y-미로는 당뇨병의 설치류 모델에서 시각 및 인지 적자를 추적하는 것으로 입증되었습니다.

프로토콜의 중요한 단계

The OMR

시각 기능을 평가하기 위해 OMR을 수행할 때 고려해야 할 몇 가?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		OMR apparatus & software
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze apparatus	San Diego Instruments	7001-043	Available specifically for rats