Évaluation comportementale de la fonction visuelle via la réponse optomotrice et de la fonction cognitive via Y-Maze chez les rats diabétiques

Résumé

La dégénérescence neuronale dans les yeux et le cerveau à la suite du diabète peut être observée grâce à des tests comportementaux effectués sur des rongeurs. Le labyrinthe Y, une mesure de la cognition spatiale, et la réponse optomotrice, une mesure de la fonction visuelle, fournissent tous deux un aperçu des diagnostics et des traitements potentiels.

Résumé

La réponse optomotrice et le labyrinthe en Y sont des tests comportementaux utiles pour évaluer respectivement la fonction visuelle et cognitive. La réponse optomotrice est un outil précieux pour suivre les changements dans les seuils de fréquence spatiale (SF) et de sensibilité au contraste (CS) au fil du temps dans un certain nombre de modèles de maladies de la rétine, y compris la rétinopathie diabétique. De même, le labyrinthe Y peut être utilisé pour surveiller la cognition spatiale (mesurée par l’alternance spontanée) et le comportement exploratoire (mesuré par un certain nombre d’entrées) dans un certain nombre de modèles de maladies qui affectent le système nerveux central. Les avantages de la réponse optomotrice et du labyrinthe en Y comprennent la sensibilité, la vitesse des tests, l’utilisation de réponses innées (l’entraînement n’est pas nécessaire) et la capacité d’être effectué sur des animaux éveillés (non anesthésiés). Ici, des protocoles sont décrits à la fois pour la réponse optomotrice et le labyrinthe Y et des exemples de leur utilisation montrés dans des modèles de diabète de type I et de type II. Les méthodes comprennent la préparation des rongeurs et de l’équipement, la performance de la réponse optomotrice et du labyrinthe en Y, et l’analyse des données post-test.

Introduction

Plus de 463 millions de personnes vivent avec le diabète, ce qui en fait l’une des plus grandes épidémies ^mondiales1. L’une des complications graves qui découlent du diabète est la rétinopathie diabétique (DR), l’une des principales causes de cécité chez les adultes américains en âge de ^travailler2. Au cours des 30 prochaines années, le pourcentage de la population à risque de RD devrait doubler, il est donc crucial de trouver de nouvelles façons de diagnostiquer la RD à ses premiers stades afin de prévenir et d’atténuer le développement de la ^RD3. On pense traditionnellement que la RD est une maladie ^{vasculaire4,5,6}. Cependant, maintenant avec des preuves de dysfonctionnement neuronal et d’apoptose dans la rétine qui précèdent la pathologie vasculaire, la DR est définie comme ayant des composants neuronaux et vasculaires4,5,6,7,8,9. Une façon de diagnostiquer la RD serait d’examiner les anomalies neuronales de la rétine, un tissu qui peut être plus vulnérable au stress oxydatif et à la tension métabolique due au diabète que d’autres tissus ^neuronaux10.

Les déclins de la fonction cognitive et motrice se produisent également avec le diabète et sont souvent corrélés avec des changements rétiniens. Les personnes âgées atteintes de diabète de type II présentent des performances cognitives de base moins bonnes et présentent un déclin cognitif plus exacerbé que les participants ^témoins11. De plus, la rétine a été établie comme une extension du système nerveux central et des pathologies peuvent se manifester dans la ^rétine12. Cliniquement, la relation entre la rétine et le cerveau a été étudiée dans le contexte de la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies, mais n’est pas couramment explorée avec le diabète12,13,14,15,16. Les changements dans le cerveau et la rétine au cours de la progression du diabète peuvent être explorés à l’aide de modèles animaux, y compris le rat STZ (un modèle de diabète de type I dans lequel la toxine, la streptozotocine ou STZ, est utilisée pour endommager les cellules bêta pancréatiques) et le rat Goto-Kakizaki (un modèle polygénique du diabète de type II dans lequel les animaux développent une hyperglycémie spontanément vers l’âge de 3 semaines). Dans ce protocole, une description du labyrinthe Y et de la réponse optomotrice pour évaluer les changements cognitifs et visuels chez les rongeurs diabétiques, respectivement, est fournie. La réponse optomotrice (OMR) évalue la fréquence spatiale (similaire à l’acuité visuelle) et la sensibilité au contraste en surveillant les mouvements réflexifs caractéristiques de suivi de la tête pour évaluer les seuils visuels pour chaque ^œil17. La fréquence spatiale fait référence à l’épaisseur ou à la finesse des barres, et la sensibilité au contraste fait référence au contraste entre les barres et l’arrière-plan (Figure 1E). Pendant ce temps, le labyrinthe en Y teste la mémoire spatiale à court terme et la fonction exploratoire, observées à travers des alternances spontanées et des entrées à travers les bras du labyrinthe.

Les deux tests peuvent être effectués chez des animaux éveillés et non anesthésiés et ont l’avantage de capitaliser sur les réponses innées des animaux, ce qui signifie qu’ils ne nécessitent pas de formation. Les deux sont relativement sensibles, en ce sens qu’ils peuvent être utilisés pour détecter les déficits au début de la progression du diabète chez les rongeurs, et fiables, en ce sens qu’ils produisent des résultats en corrélation avec d’autres tests visuels, rétiniens ou comportementaux. De plus, l’utilisation de l’OMR et du labyrinthe Y en conjonction avec des tests tels que l’électrorétinogramme et la tomographie par cohérence optique peut fournir des informations sur le moment où des changements rétiniens, structurels et cognitifs se développent les uns par rapport aux autres dans les modèles de maladie. Ces recherches pourraient être utiles pour identifier les dégénérescences neuronales dues au diabète. En fin de compte, cela pourrait conduire à de nouvelles méthodes de diagnostic qui identifient efficacement la RD dans les premiers stades de la progression.

Les systèmes OMR et Y-maze utilisés pour développer ce protocole sont décrits dans la Table des matériaux. Des recherches antérieures sur l’OMR, par Prusky et ^al.18, et le labyrinthe Y, par Maurice et ^al.19, ont été utilisées comme point de départ pour développer ce protocole.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par l’Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee et conformes au guide des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications, ^8e édition, mise à jour 2011).

1. La réponse optomotrice (OMR)

1. Configurer l’appareil OMR (détails sur l’appareil et le logiciel dans la table des matériaux)
   1. Choisissez la plate-forme de taille appropriée pour le rongeur : souris, rat ou rat grand ou grand rat (Figure 1A).
   2. Ouvrez le logiciel OMR, qui devrait s’ouvrir sur une fenêtre avec plusieurs onglets d’options et un flux vidéo en direct de l’intérieur de l’OMR / tambour virtuel (Figure 1B). Effectuez un zoom avant ou arrière avec la caméra vidéo selon les besoins afin que la plate-forme et son environnement soient visibles.
   3. Notez les icônes le long du côté gauche de l’image en direct (Figure 1C). Cliquez sur l’icône d’astérisque et l’icône de bandes rotatives afin que l’astérisque vert et les bandes tournantes vertes disparaissent du flux en direct.
   4. Cliquez sur l’icône de la boussole pour qu’un cercle vert et deux lignes perpendiculaires apparaissent. Étirez le cercle vert pour qu’il s’aligne parfaitement avec le cercle noir sur la plate-forme, ce qui garantira que l’OMR est parfaitement aligné.
   5. Cliquez sur l’icône de la boussole car il n’est pas nécessaire de voir le cercle pendant le test. Cliquez sur l’icône d’astérisque vert et l’icône de bandes tournantes vertes pour les faire réapparaître. Notez que les bandes vertes tournent dans la même direction que les rayures dans le tambour, ce qui permet au chercheur de connaître la direction des rayures.
   6. Cliquez sur l’onglet Test . Sous Tests, cliquez sur l’onglet Psychophysique . Sous Seuil, sélectionnez Fréquence pour mesurer la fréquence spatiale.
      REMARQUE: Le logiciel OMR utilise un paradigme d’escalier pour calculer automatiquement la fréquence spatiale (SF). Le contraste sera maintenu à 100%.
   7. Sous Test, cliquez sur l’onglet Préréglages . Sélectionnez les paramètres par défaut pour ^Mouse18 ou ^Rat20.
   8. Sous Test, cliquez sur l’onglet Occultation . Cochez la case Vide lors du suivi , qui mettra en pause les rayures / videra les écrans d’ordinateur dans le tambour chaque fois que la souris est cliquée avec le bouton droit de la souris.
   9. Cliquez sur l’onglet Résultats , où les résultats du test seront affichés.
2. Évaluer la fréquence spatiale
   1. Placez le rongeur sur la plate-forme circulaire au centre de la chambre de réalité virtuelle comprenant quatre écrans d’ordinateur montrant des caillebotis sinusoïdaux verticaux entourant la chambre à une vitesse de 12 ° / s (Figure 1D).
   2. Notez que la caméra vidéo positionnée en haut de la chambre projette le comportement du rongeur en direct sur l’écran de l’ordinateur.
   3. Recherchez la présence ou l’absence d’actions réflexives par la tête du rongeur lorsque les caillebotis se déplacent dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Assurez-vous que les barres illustrées sont visibles dans le programme, elles montreront la direction du mouvement du caillebotis.
      1. Surveillez la tête du rongeur pour qu’elle se déplace dans la même direction que les caillebotis. Attendez qu’il y ait une poursuite en douceur, pas des rafales erratiques de mouvement de la tête, pour le compter comme un suivi.
      2. Cliquez sur Oui ou Non selon le cas. Notez que SF commencera avec 0,042 cyc/deg et s’ajustera avec chaque oui et non pour devenir plus facile ou plus difficile (Figure 1E). Cliquez sur Réinitialiser si le test doit être réinitialisé en raison d’un clic accidentel ou incorrect sur oui et non.
   4. Pendant que le rongeur est testé, assurez-vous de garder l’astérisque positionné sur la tête du rongeur.
      REMARQUE: Cela a deux effets: 1) Il maintient la fréquence spatiale correcte. Si l’astérisque est positionné entre les épaules, par exemple, la fréquence spatiale sera plus basse et les barres seront plus faciles à voir, ce qui entraînera un score faussement élevé. 2) Pour les rongeurs avec de légers mouvements de la tête, l’astérisque permet de mesurer plus facilement si la tête bouge réellement.
   5. Surveillez le système pour dire « Terminé » lorsque la fréquence spatiale du rongeur est atteinte. Notez que les boutons Oui et Non ne seront plus cliquables.
   6. Cliquez sur l’onglet Résultats , qui affichera la fréquence spatiale pour l’œil gauche, l’œil droit et les yeux combinés.
      REMARQUE: Parfois, le logiciel est configuré de telle sorte que les résultats sont inversés, c’est-à-dire que l’œil droit est signalé comme l’œil gauche et l’œil gauche est signalé comme l’œil droit. Cela a été découvert lors de l’évaluation de rongeurs qui n’avaient qu’un seul œil blessé dans un modèle de glaucome.
3. Évaluer la sensibilité au contraste
   REMARQUE: Les tests de sensibilité au contraste peuvent être effectués immédiatement après l’étape de mesure de la fréquence spatiale ou seuls le même jour ou un jour différent si le rongeur semble fatigué après un test de fréquence spatiale (suivez les étapes 1 à 2.2 si vous ne testez que la sensibilité au contraste).
   1. Cliquez sur l’onglet Tests , puis sur l’onglet Psychophysique . Sous Seuil, sélectionnez Contraste (unique) pour mesurer la sensibilité au contraste.
   2. En utilisant également un paradigme d’escalier, commencez les caillebotis avec une constante SF au sommet de la courbe de sensibilité au contraste (CS). Pour ce faire, cliquez sur l’onglet Stimulus puis sur l’onglet Caillebotis . Dans la zone Fréquence spatiale , tapez 0,064 pour les rats et 0,103 pour les souris.
   3. Commencez le contraste à 100% et recherchez les mêmes mouvements réflexifs de la tête que ceux observés lors des tests de fréquence spatiale. Notez que le contraste diminuera au fur et à mesure que le test progresse jusqu’à ce que le rongeur n’ait plus de mouvements réflexifs de la tête en réponse au stimulus (Figure 1E).
   4. Surveillez le système pour dire « Terminé » et les boutons Oui et Non ne sont plus cliquables une fois que le rongeur ne répond plus au stimulus visuel et que le seuil de sensibilité au contraste a été atteint. Cliquez sur l’onglet Résultats , où la sensibilité au contraste de l’œil gauche, de l’œil droit et des yeux combinés sera répertoriée.
4. Effectuer une analyse post-test
   1. Pour les études sur la rétinopathie diabétique, où les deux yeux devraient présenter des déficits similaires, utilisez le score combiné (moyenne des yeux droit et gauche) pour l’analyse. Pour les modèles qui causent des dommages différentiels aux yeux (c.-à-d. une blessure par explosion ou un glaucome), conservez les données de l’œil gauche et de l’œil droit séparées.
   2. Pour la fréquence spatiale, utilisez les scores bruts (les données de l’onglet Résultats ) pour l’analyse et faites la moyenne de ces scores ensemble par groupe (c.-à-d. diabétique, témoin, etc.).
   3. Pour Sensibilité au contraste, utilisez la valeur brute pour calculer la sensibilité au contraste rapportée par le contraste de Michelson à partir d’une mesure précédente de la luminance de l’écran.

2. Le labyrinthe en Y

1. Préparer les rongeurs pour les tests
   1. Adaptez les rongeurs à la pièce pendant 30 minutes avant le test.
      REMARQUE: Le chercheur peut rester dans la pièce avec les lumières allumées, mais doit rester silencieux pendant ce temps.
   2. Nettoyez le labyrinthe en Y avec une solution désinfectante sans danger pour les animaux et essuyez toute solution désinfectante avec des serviettes en papier. Assurez-vous que le labyrinthe est sec.
2. Conduisez le labyrinthe en Y
   1. Étiquetez le bras initial du labyrinthe en Y comme B et les 2 autres bras comme A et C (Figure 2A). Placez un rongeur dans le bras le plus proche du chercheur (bras B) près du centre du labyrinthe en Y. Une fois le rongeur placé, démarrez la minuterie (détails sur le labyrinthe et la minuterie dans la table des matériaux).
      1. Laissez chaque rongeur explorer le labyrinthe en Y pendant 8 min. Prenez des enregistrements pendant cette période et notez toutes les observations. Asseyez-vous à plusieurs mètres du labyrinthe tout en le gardant en vue et évitez de faire du bruit.
      2. Enregistrez l’emplacement de départ comme A, et chaque fois que le rongeur fait une entrée dans un nouveau bras, enregistrez le nouvel emplacement du rongeur (Figure 2B). Définissez une entrée comme les quatre membres du rongeur se trouvant dans l’un des bras.
      3. Surveillez les rongeurs pour qu’ils se cachent et restent immobiles dans un bras du labyrinthe. Si le rongeur reste au même endroit pendant plus de 60 s et ne semble pas montrer de comportement exploratoire, déplacez le rongeur vers le centre du labyrinthe Y et continuez l’essai.
   2. Après chaque rongeur, enlevez les excréments et nettoyez le labyrinthe avec une solution désinfectante.
      1. Assurez-vous que toute la solution désinfectante est essuyée avec des serviettes en papier et que le labyrinthe est complètement sec avant de placer le prochain rongeur dans le labyrinthe.
3. Calculer l’alternance spontanée et le comportement exploratoire
   1. Calculez le comportement exploratoire comme le nombre total d’entrées effectuées pendant 8 min.
   2. Calculer la cognition spatiale mesurée par l’alternance spontanée :
      le nombre d’alternances réussies/(le nombre total d’entrées - 2)
      1. Définissez une alternance réussie lorsque le rongeur se déplace séquentiellement dans trois endroits différents (exemple: ABC, CAB, BCA, etc.). Notez chaque alternance réussie (Figure 2B).
      2. Si les mouvements ont été enregistrés comme ACABCABABCABC, ne tenez pas compte des deux emplacements de départ initiaux lors du calcul de l’alternance spontanée (de sorte qu’il y ait 11 mouvements dans le dénominateur). Comptez le nombre de mouvements précis (mouvements précis = 8). Calculez le pourcentage de précision comme suit : 8/(13 - 2) = 72,7 %.

Résultats

L’OMR est considéré comme réussi si des seuils de sensibilité à la fréquence spatiale et au contraste peuvent être obtenus à partir d’un rongeur. Ici, l’utilisation de l’OMR pour évaluer la fréquence spatiale est illustrée chez des rats témoins naïfs Brown-Norway et Long-Evans, tous deux jeunes (3-6 mois) et âgés (9-12 mois). Les rats bruns-norvégiens montrent généralement une fréquence spatiale de base plus élevée que les rats Long-Evans. De plus, un effet du vieillissement sur la fréquence...

Discussion

L’OMR et le labyrinthe en Y permettent l’évaluation non invasive des déficits de la fonction visuelle et de la fonction cognitive chez les rongeurs au fil du temps. Dans ce protocole, il a été démontré que l’OMR et le labyrinthe en Y suivent les déficits visuels et cognitifs dans les modèles de diabète chez les rongeurs.

Étapes critiques du protocole

L’OMR

Certains points importants à considérer lors d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		OMR apparatus & software
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze apparatus	San Diego Instruments	7001-043	Available specifically for rats