Verhaltensbewertung der visuellen Funktion über optomotorische Reaktion und kognitive Funktion über Y-Maze bei diabetischen Ratten

Zusammenfassung

Neuronale Degeneration in Augen und Gehirn als Folge von Diabetes kann durch Verhaltenstests an Nagetieren beobachtet werden. Das Y-Labyrinth, ein Maß für die räumliche Kognition, und die optomotorische Reaktion, ein Maß für die visuelle Funktion, geben beide Einblick in mögliche Diagnosen und Behandlungen.

Zusammenfassung

Die optomotorische Reaktion und das Y-Labyrinth sind Verhaltenstests, die zur Beurteilung der visuellen bzw. kognitiven Funktion nützlich sind. Die optomotorische Reaktion ist ein wertvolles Werkzeug, um Veränderungen der Räumlichen Frequenz (SF) und kontrastempfindlichen (CS) Schwellenwerte im Laufe der Zeit in einer Reihe von Netzhauterkrankungsmodellen, einschließlich diabetischer Retinopathie, zu verfolgen. In ähnlicher Weise kann das Y-Labyrinth verwendet werden, um die räumliche Kognition (gemessen durch spontane Abwechslung) und das explorative Verhalten (gemessen an einer Reihe von Einträgen) in einer Reihe von Krankheitsmodellen zu überwachen, die das zentrale Nervensystem betreffen. Zu den Vorteilen der optomotorischen Reaktion und des Y-Labyrinths gehören Empfindlichkeit, Testgeschwindigkeit, die Verwendung angeborener Reaktionen (Training ist nicht erforderlich) und die Fähigkeit, an wachen (nicht betäubten) Tieren durchgeführt zu werden. Hier werden Protokolle sowohl für die optomotorische Reaktion als auch für das Y-Labyrinth beschrieben und Beispiele für ihre Verwendung in Modellen von Typ-I- und Typ-II-Diabetes gezeigt. Zu den Methoden gehören die Vorbereitung von Nagetieren und Ausrüstung, die Leistung der optomotorischen Reaktion und des Y-Labyrinths sowie die Datenanalyse nach dem Test.

Einleitung

Über 463 Millionen Menschen leben mit Diabetes, was ihn zu einer der größten globalen Krankheitsepidemien ^macht1. Eine der schwerwiegenden Komplikationen, die sich aus Diabetes ergeben, ist die diabetische Retinopathie (DR), eine der Hauptursachen für Blindheit bei amerikanischen Erwachsenen im erwerbsfähigen ^Alter2. In den nächsten 30 Jahren wird sich der Prozentsatz der Bevölkerung, der für DR gefährdet ist, voraussichtlich verdoppeln, daher ist es von entscheidender Bedeutung, neue Wege zur Diagnose von DR in seinen früheren Stadien zu finden, um die DR-Entwicklung zu verhindern und zu mildern3. DR wurde herkömmlicherweise für eine Gefäßerkrankung ^{gehalten4,5,6}. Jetzt, mit Hinweisen auf neuronale Dysfunktion und Apoptose in der Netzhaut, die der vaskulären Pathologie vorausgeht, ist DR definiert, um neuronale und vaskuläre Komponenten zu haben4,5,6,7,8,9. Eine Möglichkeit, DR zu diagnostizieren, wäre die Untersuchung neuronaler Anomalien in der Netzhaut, einem Gewebe, das anfälliger für oxidativen Stress und metabolische Belastung durch Diabetes sein kann als anderes nervenaufreibendes ^Gewebe10.

Ein Rückgang der kognitiven und motorischen Funktion tritt auch bei Diabetes auf und korreliert oft mit Netzhautveränderungen. Ältere Personen mit Typ-II-Diabetes zeichnen sich durch eine schlechtere kognitive Leistungsfähigkeit zu Studienbeginn aus und zeigen einen stärkeren kognitiven Verfall als ^{Kontrollteilnehmer11}. Darüber hinaus wurde die Netzhaut als Erweiterung des zentralen Nervensystems etabliert und Pathologien können sich in der Netzhaut ^{manifestieren12}. Klinisch wurde die Beziehung zwischen Netzhaut und Gehirn im Zusammenhang mit Alzheimer und anderen Krankheiten untersucht, wird aber nicht häufig mit Diabetes untersucht12,13,14,15,16. Veränderungen im Gehirn und in der Netzhaut während des Fortschreitens von Diabetes können anhand von Tiermodellen untersucht werden, einschließlich der STZ-Ratte (ein Modell für Typ-I-Diabetes, bei dem das Toxin Streptozotocin oder STZ verwendet wird, um Betazellen der Bauchspeicheldrüse zu schädigen) und der Goto-Kakizaki-Ratte (ein polygenes Modell von Typ-II-Diabetes, bei dem Tiere im Alter von etwa 3 Wochen spontan eine Hyperglykämie entwickeln). In diesem Protokoll wird eine Beschreibung für das Y-Labyrinth und die optomotorische Reaktion zur Beurteilung kognitiver und visueller Veränderungen bei diabetischen Nagetieren gegeben. Die optomotorische Reaktion (OMR) bewertet die Ortsfrequenz (ähnlich der Sehschärfe) und die Kontrastempfindlichkeit, indem sie charakteristische reflexive Kopfverfolgungsbewegungen überwacht, um die visuellen Schwellenwerte für jedes Auge zu ^messen17. Die Ortsfrequenz bezieht sich auf die Dicke oder Feinheit der Balken, und die Kontrastempfindlichkeit bezieht sich darauf, wie viel Kontrast zwischen den Balken und dem Hintergrund besteht (Abbildung 1E). In der Zwischenzeit testet das Y-Labyrinth das räumliche Kurzzeitgedächtnis und die explorative Funktion, die durch spontane Wechsel und Eintritte durch die Arme des Labyrinths beobachtet werden.

Beide Tests können bei wachen, nicht betäubten Tieren durchgeführt werden und haben den Vorteil, dass sie aus den angeborenen Reaktionen der Tiere Kapital schlagen, was bedeutet, dass sie kein Training benötigen. Beide sind relativ empfindlich, da sie verwendet werden können, um Defizite früh im Fortschreiten von Diabetes bei Nagetieren zu erkennen, und zuverlässig, da sie Ergebnisse liefern, die mit anderen visuellen, netztinalen oder Verhaltenstests korrelieren. Darüber hinaus kann die Verwendung der OMR und des Y-Labyrinths in Verbindung mit Tests wie Elektroretinogramm- und optischen Kohärenztomographie-Scans Informationen darüber liefern, wann sich netzhautale, strukturelle und kognitive Veränderungen relativ zueinander in Krankheitsmodellen entwickeln. Diese Untersuchungen könnten nützlich sein, um neuronale Degenerationen zu identifizieren, die aufgrund von Diabetes auftreten. Letztendlich könnte dies zu neuen diagnostischen Methoden führen, die DR in frühen Stadien der Progression effektiv identifizieren.

Die OMR- und Y-Labyrinth-Systeme, die zur Entwicklung dieses Protokolls verwendet wurden, sind in der Materialtabelle beschrieben. Frühere Forschungen zur OMR von Prusky et ^al.18 und zum Y-Labyrinth von Maurice et ^al.19 wurden als Ausgangspunkt für die Entwicklung dieses Protokolls verwendet.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und entsprachen dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publications, 8^. Auflage, aktualisiert 2011).

1. Die optomotorische Reaktion (OMR)

1. Einrichten des OMR-Geräts (Details zu Gerät und Software in der Materialtabelle)
   1. Wählen Sie die plattformgerechte Größe für das Nagetier: Maus, Ratte oder große/beeinträchtigte Ratte (Abbildung 1A).
   2. Öffnen Sie die OMR-Software, die sich zu einem Fenster mit mehreren Registerkarten mit Optionen und einem Live-Video-Feed des Inneren der OMR/virtuellen Trommel öffnen sollte (Abbildung 1B). Zoomen Sie mit der Videokamera nach Bedarf hinein oder heraus, damit die Plattform und ihre Umgebung sichtbar sind.
   3. Beachten Sie die Symbole auf der linken Seite des Livebilds (Abbildung 1C). Klicken Sie auf das Sternchensymbol und das Symbol für rotierende Streifen, sodass sowohl das grüne Sternchen als auch die grünen rotierenden Streifen aus dem Live-Feed verschwinden.
   4. Klicken Sie auf das Kompasssymbol , damit ein grüner Kreis und zwei senkrechte Linien angezeigt werden. Dehnen Sie den grünen Kreis so, dass er perfekt mit dem schwarzen Kreis auf der Plattform übereinstimmt, wodurch sichergestellt wird, dass der OMR perfekt ausgerichtet ist.
   5. Klicken Sie auf das Kompasssymbol , da es nicht notwendig ist, den Kreis während des Tests zu sehen. Klicken Sie auf das grüne Sternchensymbol und das grüne Symbol für rotierende Streifen , damit diese wieder angezeigt werden. Beachten Sie, dass sich die grünen Streifen in die gleiche Richtung drehen wie die Streifen in der Trommel, so dass der Forscher die Richtung der Streifen kennen kann.
   6. Klicken Sie auf die Registerkarte Testen . Klicken Sie unter Testen auf die Registerkarte Psychophysik . Wählen Sie unter Schwellenwert die Option Frequenz aus, um die Ortsfrequenz zu messen.
      HINWEIS: Die OMR-Software verwendet ein Treppenparadigma, um die Ortsfrequenz (SF) automatisch zu berechnen. Der Kontrast wird bei 100% gehalten.
   7. Klicken Sie unter Testen auf die Registerkarte Vorgaben . Wählen Sie die Standardeinstellungen für ^Mouse18 oder ^Rat20 aus.
   8. Klicken Sie unter Testen auf die Registerkarte Ausblenden . Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Blank on Tracking , um die Streifen anzuhalten / die Computerbildschirme in der Trommel auszublenden, wenn die Maus mit der rechten Maustaste angeklickt wird.
   9. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse , auf der die Ergebnisse des Tests angezeigt werden.
2. Raumfrequenz auswerten
   1. Platzieren Sie das Nagetier auf der kreisförmigen Plattform in der Mitte der Virtual-Reality-Kammer, die aus vier Computermonitoren besteht, die vertikale Sinuswellengitter zeigen, die die Kammer mit einer Geschwindigkeit von 12 ° / s umkreisen (Abbildung 1D).
   2. Beachten Sie, dass die Videokamera, die oben in der Kammer positioniert ist, das Verhalten des Nagetiers live auf den Computermonitor projiziert.
   3. Achten Sie auf das Vorhandensein oder Fehlen reflexiver Handlungen des Nagetierkopfes, wenn sich die Gitter im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn bewegen. Stellen Sie sicher, dass illustrierte Balken im Programm sichtbar sind – diese zeigen die Richtung der Gitterbewegung an.
      1. Achten Sie darauf, dass sich der Kopf des Nagetiers in die gleiche Richtung wie die Gitter bewegt. Warten Sie, bis es eine reibungslose Verfolgung gibt, keine unberechenbaren Ausbrüche von Kopfbewegungen, um es als Tracking zu zählen.
      2. Klicken Sie auf Ja oder Nein . Beachten Sie, dass SF mit 0,042 cyc/deg beginnt und sich mit jedem Ja und Nein anpasst, um einfacher oder schwieriger zu werden (Abbildung 1E). Klicken Sie auf Zurücksetzen , wenn der Test aufgrund eines versehentlichen oder falschen Klickens von Ja und Nein zurückgesetzt werden muss.
   4. Wenn das Nagetier getestet wird, achten Sie darauf, das Sternchen über dem Kopf des Nagetiers zu halten.
      HINWEIS: Dies hat zwei Auswirkungen: 1) Es behält die korrekte Ortsfrequenz bei. Wenn das Sternchen beispielsweise zwischen den Schultern positioniert ist, ist die Ortsfrequenz niedriger und die Balken sind leichter zu sehen, was zu einer falsch hohen Punktzahl führt. 2) Bei Nagetieren mit leichten Kopfbewegungen lässt sich das Sternchen leichter beurteilen, ob sich der Kopf tatsächlich bewegt.
   5. Achten Sie darauf, dass das System "Fertig" sagt, wenn die Ortsfrequenz des Nagetiers erreicht ist. Beachten Sie, dass die Schaltflächen Ja und Nein nicht mehr angeklickt werden können.
   6. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse , auf der die Ortsfrequenz für das linke Auge, das rechte Auge und die kombinierten Augen angezeigt wird.
      HINWEIS: Manchmal ist die Software so eingestellt, dass die Ergebnisse umgedreht werden, d.h. das rechte Auge wird als das linke Auge und das linke Auge als das rechte Auge gemeldet. Dies wurde bei der Beurteilung von Nagetieren entdeckt, die in einem Glaukommodell nur eine Augenlähmung aufwiesen.
3. Bewerten der Kontrastempfindlichkeit
   HINWEIS: Der Kontrastempfindlichkeitstest kann unmittelbar nach dem Schritt der Ortsfrequenzmessung oder allein am selben Tag oder an einem anderen Tag durchgeführt werden, wenn das Nagetier nach der Ortsfrequenzprüfung ermüdet erscheint (befolgen Sie die Schritte 1 bis 2.2, wenn Sie nur die Kontrastempfindlichkeit testen).
   1. Klicken Sie auf die Registerkarte Tests und dann auf die Registerkarte Psychophysik . Wählen Sie unter Schwellenwert die Option Kontrast (einzeln) aus, um die Kontrastempfindlichkeit zu messen.
   2. Beginnen Sie auch mit einem Treppenparadigma Gitter mit SF-Konstante auf dem Höhepunkt der CS-Kurve (Contrast Sensitivity). Klicken Sie dazu auf die Registerkarte Stimulus und dann auf die Registerkarte Gitter . Geben Sie im Feld Ortsfrequenz den Wert 0,064 für Ratten und 0,103 für Mäuse ein.
   3. Beginnen Sie den Kontrast bei 100% und suchen Sie nach den gleichen reflexiven Kopfbewegungen wie bei der Ortsfrequenzprüfung. Beachten Sie, dass der Kontrast im Laufe der Tests abnimmt, bis das Nagetier keine reflexiven Kopfbewegungen mehr als Reaktion auf den Reiz hat (Abbildung 1E).
   4. Achten Sie darauf, dass das System "Fertig" sagt und die Tasten Ja und Nein nicht mehr anklickbar sind, sobald das Nagetier nicht mehr auf den visuellen Reiz reagiert und die Kontrastempfindlichkeitsschwelle erreicht wurde. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse , wo die Kontrastempfindlichkeit für das linke Auge, das rechte Auge und die kombinierten Augen aufgelistet wird.
4. Durchführen einer Analyse nach dem Testen
   1. Für diabetische Retinopathie-Studien, bei denen erwartet wird, dass beide Augen ähnliche Defizite aufweisen, verwenden Sie den kombinierten Score (Durchschnitt des rechten und linken Auges) für die Analyse. Für Modelle, die eine differentielle Schädigung der Augen verursachen (z. B. Explosionsverletzung oder Glaukom), halten Sie die Daten des linken und rechten Auges getrennt.
   2. Verwenden Sie für Die Räumliche Frequenz die Rohwerte (die Daten von der Registerkarte Ergebnisse ) für die Analyse und berechnen Sie diese Werte zusammen nach Gruppen (z. B. Diabetiker, Kontrollwerte usw.).
   3. Verwenden Sie für Die Kontrastempfindlichkeit den Rohwert, um die gemeldete Kontrastempfindlichkeit durch den Michelson-Kontrast aus einer vorherigen Messung der Luminanz des Bildschirms zu berechnen.

2. Das Y-Labyrinth

1. Bereiten Sie Nagetiere für die Prüfung vor
   1. Passen Sie Nagetiere vor dem Test 30 Minuten lang an den Raum an.
      HINWEIS: Der Forscher kann bei eingeschaltetem Licht im Raum bleiben, sollte aber während dieser Zeit stumm bleiben.
   2. Reinigen Sie das Y-Labyrinth mit einer für Tiere sicheren Desinfektionslösung und wischen Sie alle Desinfektionslösungen mit Papiertüchern ab. Stellen Sie sicher, dass das Labyrinth trocken ist.
2. Führe das Y-Labyrinth durch
   1. Beschriften Sie den Anfangsarm des Y-Labyrinths als B und die anderen 2 Arme als A und C (Abbildung 2A). Legen Sie ein Nagetier in den Arm, der dem Forscher am nächsten ist (Arm B) in der Nähe der Mitte des Y-Labyrinths. Sobald das Nagetier platziert wurde, starten Sie den Timer (Details zu Labyrinth und Timer in der Materialtabelle).
      1. Erlauben Sie jedem Nagetier, das Y-Labyrinth für 8 Minuten zu erkunden. Machen Sie während dieser Zeit Aufnahmen und notieren Sie alle Beobachtungen. Setzen Sie sich mehrere Meter vom Labyrinth entfernt, während Sie es in Sichtweite halten und keinen Lärm machen.
      2. Notieren Sie den Startort als A, und jedes Mal, wenn das Nagetier in einen neuen Arm eintritt, notieren Sie den neuen Standort des Nagetiers (Abbildung 2B). Definieren Sie einen Eintrag als alle vier Gliedmaßen des Nagetiers, die sich in einem der Arme befinden.
      3. Achten Sie darauf, dass sich Nagetiere verstecken und in einem Arm des Labyrinths stationär bleiben. Wenn das Nagetier länger als 60 s an der gleichen Stelle bleibt und kein Erkundungsverhalten zu zeigen scheint, bewegen Sie das Nagetier in Richtung des Zentrums des Y-Labyrinths und setzen Sie den Versuch fort.
   2. Entfernen Sie nach jedem Nagetier alle Fäkalien und reinigen Sie das Labyrinth mit Desinfektionslösung.
      1. Stellen Sie sicher, dass alle Desinfektionslösungen mit Papiertüchern abgewischt werden und das Labyrinth vollständig trocken ist, bevor Sie das nächste Nagetier in das Labyrinth legen.
3. Spontanes Wechsel- und Erkundungsverhalten berechnen
   1. Berechnen Sie das explorative Verhalten als die Gesamtzahl der Einträge, die während 8 Minuten getätigt wurden.
   2. Berechnen Sie die räumliche Kognition, gemessen durch spontanen Wechsel:
      die Anzahl der erfolgreichen Änderungen/(die Gesamtzahl der Einträge - 2)
      1. Definieren Sie eine erfolgreiche Abwechslung, während sich das Nagetier nacheinander an drei verschiedenen Orten bewegt (Beispiel: ABC, CAB, BCA usw.). Notieren Sie sich jede erfolgreiche Abwechslung (Abbildung 2B).
      2. Wenn die Bewegungen als ACABCABABCABC aufgezeichnet wurden, ignorieren Sie die beiden anfänglichen Startorte bei der Berechnung des spontanen Wechsels (so dass sich 11 Bewegungen im Nenner befinden). Zählen Sie die Anzahl der genauen Bewegungen (genaue Bewegungen = 8). Berechnen Sie die prozentuale Genauigkeit als: 8/(13 - 2) = 72,7%.

Ergebnisse

Die OMR gilt als erfolgreich, wenn von einem Nagetier Räumliche Frequenz- und Kontrastempfindlichkeitsschwellenwerte erhalten werden können. Hier wird die Verwendung der OMR zur Beurteilung der Ortsfrequenz bei naiven Kontroll-Brown-Norway- und Long-Evans-Ratten veranschaulicht, beide jung (3–6 Monate) und gealtert (9–12 Monate). Braun-Norwegen-Ratten zeigen typischerweise eine höhere Ausgangs-Ortsfrequenz als Long-Evans-Ratten. Zusätzlich wurde bei den Long-Evans-Ratten ein Alterungseffekt auf die Ortsfrequenz b...

Diskussion

Die OMR und das Y-Labyrinth ermöglichen die nicht-invasive Beurteilung von Sehfunktions- und kognitiven Funktionsdefiziten bei Nagetieren im Laufe der Zeit. In diesem Protokoll wurde gezeigt, dass die OMR und das Y-Labyrinth visuelle und kognitive Defizite in Nagetiermodellen von Diabetes verfolgen.

Kritische Schritte im Protokoll

Die OMR

Einige wichtige Punkte, die bei der Durchführung der OMR zur Beurteilung der visue...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
OptoMotry HD	CerebralMechanics Inc.		OMR apparatus & software
Timer	Thomas Scientific	810029AR
Y-Maze apparatus	San Diego Instruments	7001-043	Available specifically for rats