Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

Resumen

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Resumen

Xenoinjertos larvales de pez cebra están siendo ampliamente utilizados para la investigación del cáncer para realizar estudios in vivo y en tiempo real del cáncer humano. La posibilidad de visualizar rápidamente la respuesta a las terapias anticáncer (quimio, radioterapia y biológicos), angiogénesis y metástasis con resolución unicelular, coloca al xenoinjerto de pez cebra como una de las mejores opciones para desarrollar estudios preclínicos.

El ensayo de xenoinjerto larval de pez cebra presenta varias ventajas experimentales en comparación con otros modelos, pero probablemente la más llamativa es la reducción de tamaño de escala y consecuentemente de tiempo. Esta reducción de escala permite la obtención de imágenes unicelulares, el uso de un número relativamente bajo de células humanas (compatible con biopsias), exámenes de detección de fármacos de rendimiento medio-alto, pero lo más importante permite una reducción significativa del tiempo del ensayo. Todas estas ventajas hacen que el ensayo de xenoinjerto de pez cebra sea extremadamente atractivo para futuras aplicaciones de medicina personalizada.

Muchos protocolos del xenoinjerto del pez cebra se han desarrollado con una amplia diversidad de tumores humanos; sin embargo, todavía falta un protocolo general y estandarizado para generar eficientemente xenoinjertos larvales de pez cebra. Aquí proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) está emergiendo como un poderoso organismo modelo de vertebrados para estudiar el desarrollo y la enfermedad. El pez cebra comparte características genéticas altamente conservadas (~70% de homología genética y ~84% genes relacionados con enfermedades) y características morfológicas básicas de órganos con los humanos^1,2. Esta conservación permite el uso del pez cebra para modelar varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer^3,4.

El manejo y mantenimiento del pez cebra es mucho más fácil y rentable que los ratones debido a su pequeño tamaño, alta fecundidad durante todo el año y fertilización externa^3,5. Los embriones de pez cebra no requieren alimentación viva durante sus primeros 5-7 días de vida y se han utilizado como un modelo eficaz para el desarrollo, la infección y el cáncer^1,4,6,7. Los embriones de pez cebra eclosionan a las 48 horas después de la fertilización (hpf) y son animales que nadan libremente con todos los órganos formados, un corazón latiendo y un sistema circulatorio funcional, hígado, cerebro, médula renal, etc.^1,3. Además, en esta etapa de desarrollo sólo la inmunidad innata está en juego, la inmunidad adaptativa todavía se está desarrollando, lo que permite un injerto general eficiente de las células humanas sin necesidad de uso de mutantes inmunocomprometidos^7,8. Sin embargo, es importante señalar que no todas las células humanas se injerten por igual⁹ y que, por ejemplo, para las células leucémicas se demostró que los fagocitos (neutrófilos y macrófagos) necesitan ser agotados para un injerto eficiente^10.

La capacidad de tracción genética del pez cebra y la transparencia óptica de sus primeras etapas embrionarias permiten obtener imágenes intravitales unicelulares a una alta resolución y, por lo tanto, para el establecimiento de técnicas de imagen de vanguardia en diversos campos de la biología. Además, en el contexto del cáncer, estas características son útiles para estudios en tiempo real de las primeras etapas de las interacciones huésped-tumor, como el estudio del potencial angiogénico y metastásico, así como las interacciones con el sistema inmune innato^{8,9,11,12,13.}

Aunque en el ensayo de xenoinjerto corto no hay tiempo para la "evolución" metastásica, es posible analizar la capacidad metastásica de las células tumorales (es decir, su eficiencia para pasar por pasos metastásicos como invasión, intravasación, supervivencia en circulación, extravasación y colonización, y por lo tanto estudiar estos procesos in vivo y en tiempo real^8,11,13,14).

Las características de su ciclo de vida sitúan al pez cebra como un modelo único de medicina personalizada en cáncer. Los ensayos se pueden realizar en un lapso de tiempo más corto y los resultados se obtienen en unas pocas semanas^{7,8,9,11,12,15,16.} La celeridad y viabilidad de estos ensayos proporcionan a médicos e investigadores la posibilidad de obtener resultados traslacionales que pueden ser útiles para los pacientes con cáncer, para quienes el tiempo es una necesidad esencial.

A pesar de los crecientes intentos de generar xenoinjertos de embriones de pez cebra exitosos, todavía hay una necesidad de la estandarización del procedimiento de inyección, así como la evaluación de la viabilidad celular y el comportamiento del tumor después de la inyección.

En este protocolo proporcionamos a investigadores una guía paso a paso clara y detallada para la inyección de líneas celulares humanas del cáncer en embriones del pez cebra y la fijación subsecuente, immunostaining, proyección de imagen, y cuantificación del comportamiento de la célula del tumor.

Protocolo

El modelo de pez cebra (Danio rerio) fue manejado y mantenido de acuerdo con los protocolos estándar de la Legislación Europea de Bienestar Animal, la Directiva 2010/63 / UE (Comisión Europea, 2016) y la Plataforma de Peces Champalimaud. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal champalimaud y las organizaciones institucionales portuguesas-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Animal Welfare and Ethics Body) y DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Dirección General de Alimentación y Veterinaria).

NOTA: Antes de comenzar el experimento principal, practique con la línea celular HCT116 del cáncer colorrectal humano (CRC). Esta línea celular es fácil de preparar (altamente proliferativa), fácil de inyectar e injertas de manera muy eficiente (alrededor del 95-100%). Comience con células en exceso (~ 12x10⁶ células, matraz T-75) y exceso de peces (400 peces) hasta llegar a ser competente en la técnica, ya que muchas células y peces se perderán durante el entrenamiento. Los experimentadores están listos una vez que se logra el injerto de ~ 95% en xenoinjertos HCT116. Consulte la figura 1 para obtener un esquema del protocolo completo.

1. Configuración para inyección

1. Dos semanas antes de la inyección, expanda las células en cultivo (consulte la Tabla 1 para obtener una guía detallada de la confluencia in vitro óptima para la inyección de varias líneas celulares).
2. Tres días antes de la inyección, cruzar el pez cebra del fondo deseado.

2. 24 h antes de la inyección

1. Limpie las placas de embriones de pez cebra (deseche todos los embriones muertos y no desarrollados) y actualice el medio E3.
2. En la sala de cultivo celular, deseche el medio de cultivo celular de los frascos planeados para inyección, lave una vez con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las células muertas y agregar medio fresco.
3. Preparar las herramientas para el procedimiento de inyección, tales como: agujas de microinyección, placas de agarosa y horquillas para alinear los embriones para inyección(Figura 2A-D,que se detalla a continuación).
   1. Agujas de microinyección (Figura 2A)
      1. Utilizar capilares de vidrio de borosilicato (4 pulgadas, OD 1.0 mm, Sin filamento en un tirador de micropipeta (calor: ≈500; fil: 10; vel: 50; dec: 60; tire: 100).
   2. Preparación de placas (Figura 2B)
      1. Prepare agarosa al 2% en_H2O, clímela y vierta una capa de agarosa disuelta en la tapa de una placa de Petri limpia. Déjalo polimerizar y con la ayuda de una regla, haz de tres a cuatro líneas rectas de agarosa para la alineación de los embriones.
   3. Montaje de horquilla (Figura 2C-D)
      1. Coloque 1 cabello dentro de un tubo capilar de vidrio dejando aproximadamente 1 centímetro de cabello fuera del tubo.
      2. Enrosque la punta exterior del cabello con la ayuda de fórceps en el tubo capilar de vidrio formando un bucle de ~ 0,5 mm de longitud.
      3. Selle el borde del tubo capilar con una gota de esmalte de uñas. Esto también ayudará a corregir el bucle en su lugar. Déjalo secar. Repita el procedimiento en el otro borde del tubo.
      4. Corte un pedazo de cinta aislante (más resistente, impermeable y rígida que la cinta adhesiva regular).
      5. Selle la cinta alrededor del capilar para protegerlo de la rotura.

3. Día de la inyección

1. Separe los embriones eclosionados de los huevos no incubados. La adición de 1x pronasa (0,6 mg/mL, Tabla 3)al medio embrionario en esta etapa puede aumentar la eclosión. Coloque los embriones en la incubadora (a 28 °C) hasta la inyección.
   NOTA: No deje los embriones en la solución de pronasa por más de 1 hora, ya que la enzima actuará sobre los embriones eclosionados aumentando su riesgo de mortalidad. Asegurar que la etapa de desarrollo de los embriones sea la correspondiente a 48 hpf(Figura 3A,A')para evitar el riesgo de edema y mortalidad.
2. Preparar 1x Tricaine (de una 25x culata).
   NOTA: Una receta detallada se puede encontrar en la Tabla 3 y en la Red de Información sobre el Pez Cebra - ZFIN página web¹⁷.

4. Etiquetado celular para inyección

NOTA: El etiquetado de las células puede realizarse directamente en un matraz o en un tubo microcentrífugo de 1,5 ml después del desprendimiento enzimático. Consulte Discusión para obtener más información.

1. Retire el medio de cultivo celular y lave el matraz dos veces (2x) con 1X PBS.
2. Etiquete las células con un tinte lipofílico de elección, ya sea directamente en el matraz (solución de 2 ml/matraz T75) o en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml después del desprendimiento enzimático. Evite la exposición a la luz e incube las células a 37 °C (consulte la Tabla 1 y la Tabla 2 para ver las condiciones/soluciones).
3. Si el etiquetado en el matraz
   1. Retire el tinte, lave con 1x PBS y suelte las células con EDTA y un raspador celular.
   2. Transferir células a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrífuga durante 5 minutos a 300 x g y luego vaya al paso 4.5.
4. Si se etiqueta en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL:
   1. Centrífuga 5 minutos a 300 x g para eliminar el tinte y desechar el sobrenadante. Resuspend en 1x PBS para lavar.
   2. Centrífuga 5 minutos a 300 x g y luego ir al paso 4.5.
5. Deseche el sobrenadante y resuspiente el pellet con medio de cultivo celular (para un pellet de 50 μL agregue ~ 150-200 μL de medio).
6. Cuantifique la viabilidad celular utilizando una cámara de Neubauer con exclusión de azul trypan u otro método de elección.
7. Centrifugar durante 4 minutos a 300 x g y desechar el sobrenadante. Resuspend las células en el medio de inyección.
   NOTA: La concentración celular recomendada (en general de 0.25-0.5x10⁶ células/μL) y el medio se pueden encontrar en la Tabla 1.
8. A partir de este punto, mantenga las células en el hielo.

5. Procedimiento de inyección

1. Anestesiar los embriones en 1x Tricaine durante 5 minutos.
2. Con una pipeta pasteur de plástico, transfiera una pequeña cantidad (~ 50) de embriones anestesiados a la placa de agarosa y alinee cuidadosamente con la ayuda de un lazo de horquilla. Asegúrese de mantener la distancia entre los embriones, especialmente entre la yema de uno y la cabeza del siguiente (Figura 4A).
   NOTA: El número de embriones a alinear variará según el nivel de experiencia del investigador que realiza las inyecciones. Comience con unos pocos (~ 10-20). Para un esquema del posicionamiento correcto de los embriones en la placa de agar/agarosa ver Figura 4A.
3. Asegúrese de que los embriones alineados no se sequen en la placa de agarosa para prevenir la mortalidad, agregando cuidadosamente 1-3 gotas de 1x solución de tricaína a la placa.
4. Toque ligeramente el tubo de microcentrífuga para resuspend las células. Retrocargue la aguja de inyección con la suspensión celular utilizando una punta de microcargador evitando burbujas de aire, ya que pueden comprometer la integridad de los embriones.
5. Abra la válvula de presión de aire (40 psi), configure el microinyector y coloque cuidadosamente la aguja de microinyección en el soporte.
   NOTA: Utilice los siguientes ajustes de microinyector recomendados: Mantenga la presión - ventilación (3 psi); Presión de expulsión - ventilación; Rango - 100 ms.
6. Corte la aguja de microinyección cerca de la punta con las #5 de las autogiros De Dumont o similar debajo del estereomicroscopio.
   NOTA: La punta debe ser lo suficientemente roma y delgada como para permitir que las células pasen sin obstrucciones, así como para evitar dañar los embriones y perder células. Una punta gruesa de la aguja de la microinyección dañará el embrión y promoverá la formación de edema o muerte del pez cebra. La retícula no se utiliza para la calibración de agujas. Consulte Discusión para obtener una explicación detallada.
7. Antes de inyectar los embriones, pruebe la presión del microinyector comenzando por la presión de expulsión más baja hasta que en ~ 1-3 pulsos se logre un volumen similar al tamaño del ojo del embrión de pez cebra.
   NOTA: Se recomienda el uso de un estereomicroscopio de fluorescencia siempre que sea posible al comienzo del entrenamiento. Esto permitirá una identificación más fácil de las células marcadas fluorescentemente.
8. Perfore cuidadosamente en el centro de la yema del embrión, bajando el ángulo de la aguja y empuje cautelosamente hasta que la punta de la aguja alcance el espacio perivitellineo (PVS) (Figura 4B-D).
9. Presione el pedal del microinyector e inyecte las células en el PVS. Utilice el ojo del embrión como guía. Trate de inyectar un volumen de células similar al tamaño del ojo del embrión y lo más lejos posible del corazón para prevenir el edema cardíaco.
10. Retire cuidadosamente la aguja y pase al siguiente embrión.
11. Ajuste la presión del microinyector si es necesario.
    NOTA: Las células tienden a comenzar a obstruirse, por lo que la presión puede aumentar. Si es necesario, es posible cortar el capilar (para aumentar el diámetro) mientras se reduce la presión.
12. Transferir los embriones inyectados a una placa de Petri limpia(Tabla 4)con 1x solución de Tricaine y dejarlos reposar durante 5-10 minutos. Esto dará tiempo para que la herida se cierre.
    NOTA: Para transferir los embriones de la placa de agar a la placa de Petri añadir unas gotas de 1x solución de Tricaine en la parte superior de los embriones y recogerlos cuidadosamente con una pipeta pasteur de plástico. Deje caer los embriones recogidos en una nueva placa de Petri con 1x solución de Tricaine.
13. Retire la solución Tricaine 1x y agregue el medio E3 fresco.
14. Incubar los xenoinjertos a 34 °C (una temperatura comprometida entre la supervivencia de las líneas celulares humanas y el desarrollo del pez cebra⁸).

6. Ensayo metastásico

1. Aproximadamente a 1 hora después de la inyección (hpi), examinar los embriones inyectados en un estereomicroscopio fluorescente y clasificar los xenoinjertos en 2 grupos, según la ausencia(Figura 5A)o presencia(Figura 5B)de células en circulación.
   NOTA: Incluso si sólo se detecta una célula cancerosa en el corazón o la circulación, incluya estos xenoinjertos en el grupo de xenoinjertos con células en circulación. Alternativamente, las células se pueden inyectar directamente en la circulación para aumentar el número de xenoinjertos en este grupo.

7. 1 día después de la inyección

1. En un estereomicroscopio fluorescente analice cuidadosamente cada embrión y seleccione aquellos con tumores debidamente inyectados(Figura 6).
   NOTA: Si es necesario, anestesiar los embriones inyectados con solución Tricaine 1X antes de la detección.
2. Deseche los siguientes embriones/xenoinjertos (Figura 6A-A''):
   • sin tumor/morfología anormal/muerto,
   • con edema cardíaco y/o de yema,
   • con células tumorales sólo en la yema,
   • con muy pocas células cancerosas.
3. Ordene los xenoinjertos seleccionados según su tamaño de tumor. Utilice el tamaño del ojo para la comparación (Figura 6B-B'', 6C).
   • Tumores más pequeños que el tamaño del ojo (+),
   • Tumores del mismo tamaño que el ojo (++),
   • Tumores mayores que el tamaño del ojo (+++).
4. Distribuya los xenoinjertos de acuerdo con el diseño experimental deseado e inicie el ensayo de fármacos (control vs fármaco, etc.). Reponer los fármacos y el medio E3 diariamente (Tabla 4).
5. Incubar los xenoinjertos manteniendo la temperatura de 34°C hasta el final del ensayo.

8. 4 días después de la inyección

1. En el último día del ensayo, anestesiar los xenoinjertos con 1x solución de Tricaine y alinearlos cuidadosamente en la placa de agar.
   NOTA: Deseche cualquier xenoinjerto muerto o hinchado. Los tratamientos farmacológicos y algunas células tumorales pueden inducir toxicidad y eventualmente causar mortalidad por xenoinjerto. Estos xenoinjertos no se consideran para la cuantificación del injerto.
2. Para determinar el porcentaje de injerto: sobre un estereomicroscopio fluorescente analizar cada xenoinjerto vivo y valorar la ausencia(Figura 6D)/presencia(Figura 6E)de tumores en el PVS.
   
3. Para determinar el porcentaje de metástasis: sobre un estereomicroscopio fluorescente analizar cada xenoinjerto y valorar la presencia/ausencia de micrometastasis en el tejido hematopoyético caudal (CHT) de los 2 grupos previamente definidos (CIRC y NO CIRC, Figura 6F)
   
4. Según la configuración experimental, seleccionar los xenoinjertos de interés y eutanasiarlos con Tricaine 25x (Tabla 3).
5. Fijarlos en formaldehído al 4% (FA) durante al menos 4 horas a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 4 °C.
   NOTA: Utilice formaldehído libre de metanol (16% FA) diluido al 4% en PBS/0.1% Triton. Llene los tubos a la parte superior con fijador. Coloque los tubos horizontalmente para asegurar una fijación homogénea de todos los xenoinjertos, aumentando la permeabilidad y evitando que el pez cebra se agregue en el fondo.
6. Alternativamente fijarlos con PIPAS (Por 1 mL: 100 μL de 1 M PIPAS sal sódica (4 °C); 1 μL de 1 M MgSO₄ (RT); 4 μL de 0,5 M EGTA (RT); 93,7 μL de 16% FA (RT); 801,3 μL de ddH₂O).
   NOTA: PIPES preserva la fluorescencia de las líneas transgénicas RFP y mCherry mejor que el 4% de FA.
7. Si la inmunotensación se realizará en un día diferente, reemplace el FA con metanol al 100% (MetOH). Los xenoinjertos fijados en metanol al 100% se pueden almacenar a -20 °C indefinidamente.
   NOTA: MetOH puede afectar la eficiencia de algunas tinciones (es decir, faloidina) y apagar algunos etiquetados fluorescentes. Confirme la eficiencia de los anticuerpos en muestras fijas de MetOH de antemano.

9. Inmunotensión de montaje completo para imágenes confocales

NOTA: La técnica de inmunofluorescencia de montaje completo toma 3 días divididos de la siguiente manera: El primer día es para la permeabilización de los xenoinjertos y la incubación de anticuerpos primarios. El segundo día para el lavado y la incubación de anticuerpos secundarios y el tercer día para el lavado, fijación de xenoinjertos y almacenamiento en el medio de montaje.

1. Día 1
   1. Si los xenoinjertos se almacenaron en MetOH al 100%, rehidratarlos mediante una serie de concentraciones de MeOH decrecientes (75%, 50%, 25% de MetOH diluido en PBS/0,1% Tritón). Si se fija en FA, reemplácelo por PBS/0.1% Triton.
   2. Lavar 4x durante 5 minutos en PBS/0.1% Triton.
   3. Lavar 1x durante 5 minutos en H₂O.
      NOTA: Los tubos deben colocarse horizontalmente siempre en pasos de fijación, permeabilización y lavado a menos que se indique lo contrario.
   4. Sustituir el_H2O por acetona helada e incubar a -20 °C durante 7 minutos.
      NOTA: Coloque un tubo de 50 mL con acetona a -20 °C para que esté listo para usar. Los tubos de microcentrífuga deben colocarse verticalmente en un bastidor para que la acetona no se filtre.
   5. Lavar 2x durante 10 minutos en PBS/0.1%Triton.
   6. Incubar con PBDX_GS solución de bloqueo durante 1 h a rt (tampón de bloqueo PBDX_GS: 50 mL de 1x PBS; 0,5 g de albúmina sérica bovina - BSA; 0,5 mL de DMSO; 250 μL de Tritón al 10%; 750 μL de suero de cabra - GS (15 μL/1 mL)).
   7. Retire PBDX_GS y agregue ~ 40 μL de dilución de anticuerpos primarios (generalmente 1:100).
      NOTA: El volumen de la dilución primaria del anticuerpo varía dependiendo del número de xenoinjertos presentes en el tubo de la microcentrífuga. Asegúrese de que todos los xenoinjertos estén sumergidos.
   8. Incubar durante 1 hora a RT y luego a 4 °C durante la noche. Coloque los tubos verticalmente.
2. Día 2
   1. Retire el anticuerpo primario y lave 2x durante 10 minutos en PBS/0.1% Triton.
   2. Lavar 4x durante 30 min en PBS/0.05% Tween.
      NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en la oscuridad (use papel de aluminio para proteger los tubos de la luz).
   3. Retire PBS/0.05% Tween y agregue ~ 50-100 μL de dilución de anticuerpos secundarios (generalmente 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg / mL) diluido en PBDX_GS.
   4. Incubar durante 1 hora a RT y luego a 4 °C durante la noche. Coloque los tubos verticalmente y protéjalos de la luz.
3. Día 3 (use papel de aluminio para proteger los tubos de la luz)
   1. Retire la dilución de anticuerpos secundarios y lave 4 veces durante 15 minutos en PBS/0.05% Tween.
   2. Fijar a temperatura ambiente durante 20 minutos en 4% FA.
   3. Lavar 1x durante 5 minutos en PBS/0.05% Tween.
   4. Retire PBS/0.05% Tween y agregue 1 gota de medio de montaje acuoso a cada tubo de microcentrífuga. Coloque los tubos verticalmente.
   5. Montar o almacenar a 4 °C protegido de la luz hasta su montaje. Coloque los tubos verticalmente.

10. Montaje de xenoinjertos

NOTA: Proteja los tubos de microcentrífuga de la luz durante todo el proceso. Los xenoinjertos de pez cebra están montados entre 2 cubrebocas (24 x 60 mm # 1.5). Esto permite voltear los xenoinjertos montados durante las imágenes confocales para que ambos lados del tumor (superior e inferior) sean accesibles. No use pipetas de plástico con medio de montaje: los xenoinjertos pueden quedar atrapados en la pipeta. Consulte la figura 7 para la representación esquemática de los pasos siguientes.

1. Etiquete la cubierta Y y selle los bordes de la cubierta X con vaselina o grasa de silicona para evitar la fuga del medio de montaje.
2. Transfiera los xenoinjertos con una pipeta Pasteur de vidrio a la cubierta X.
3. Alinee cuidadosamente con una horquilla y retire el exceso de medios de montaje acuosos.
4. Agregue medios de montaje acuosos a la cubierta Y.
5. Coloque cuidadosamente el cubrebocas Y encima del cubrebocas X. No presione los cubrebocas ya que esto puede potencialmente interrumpir los xenoinjertos.
6. Coloque las tapas ensambladas en la parte superior de un portaobjetos de microscopio y colóqueles con cinta adhesiva transparente. Esto permite una manipulación más fácil para la proyección de imagen y el almacenamiento confocales.

11. Imágenes confocales

NOTA: Una lente objetivo de inmersión apocromática 25x con corrección de agua es óptima para obtener imágenes de tumores PVS con resolución unicelular (consulte la Figura 8C-C" y la Figura 9A para ejemplos).

1. Adquiera muestras utilizando la función z-stack con un intervalo de 5μm entre cada segmento. Para las imágenes dirigidas a la reconstrucción 3D, en particular los vasos, utilice un intervalo de 1-3μm entre rebanadas (Figura 8A).

12. Análisis y cuantificación

1. Utilice el software FIJI/ImageJ o similar para el procesamiento y análisis de imágenes confocales.
2. Abra los datos sin procesar (.czi, .lsm, etc.) en el software FIJI.
3. Para seleccionar todo o un solo canal en modo compuesto, haga clic en: Imagen > Colores > Herramienta Canales.
4. Para ajustar los niveles de brillo y contraste, haga clic en: Imagen > Ajustar > Balance de color.
5. Para cuantificar el tamaño del tumor
   1. Seleccione tres rebanadas representativas del tumor, de la parte superior, media e inferior, por pila z por xenoinjerto (Figura 8 A).
      NOTA: La resolución confocal alcanza ~60-70 μm de profundidad tumoral. Si el tumor es grande, es posible que no sea posible obtener imágenes de su volumen total.
   2. Abra una hoja de cálculo para anotar los datos.
   3. Contar todos los núcleos DAPI que corresponden a las células tumorales en las 3 rebanadas seleccionadas (Figura 8 A, B). Para ello:
      1. Abra el complemento de contador de celdasde FIJI /ImageJ haciendo clic en Complementos > Analizar > contador de celdas .
      2. En la herramienta de contador de celdas, haga clic en Inicializar, seleccione un tipo de contador y haga clic en la imagen para iniciar el modo de recuento manualmente. Por cada clic, el contador agrega cuántas celdas se cuentan (número de clics).
      3. Después de contar un sector completo, guarde el número de celda en el documento de Excel correspondiente.
      4. De vuelta a Fiji, haga clic en Restablecer en la ventana Contador de celdas para eliminar la información si se va a utilizar el mismo contador. De lo contrario, la información se puede mantener y otros contadores se pueden utilizar con otros sectores (o celdas).
      5. Vaya al segundo sector representativo y repita los pasos anteriores. Recopilar todos los datos.
         NOTA: Dapi counterstaining se utiliza comúnmente para contar los números de celda debido a la definición clara de células individuales, sin embargo, se puede utilizar otra tinción específica de la célula.
   4. Para obtener el número total de células en el tumor, use la siguiente fórmula:
      
      NOTA: El número de corrección 1.5 se estimó para las células que tienen un diámetro promedio del núcleo de ~ 10-12 μm. Esta corrección puede necesitar ajuste si las celdas son más grandes/más pequeñas. Consulte Dicussión para obtener más detalles sobre este método.
6. Para cuantificar otros marcadores (células inmunes, figuras mitóticas, PPH3, Caspasa activada3, Ki67, etc.), cuantificar todas las rebanadas utilizando el mismo plugin (ver Figura 8C-C'' para la visualización de figuras mitóticas). Divida el número total de células contadas por el tamaño de tumor correspondiente y multiplique por 100 para obtener el porcentaje.
   Nota : tenga en cuenta que algunas celdas se encuentran entre dos sectores, ir hacia adelante y hacia atrás en la pila z para asegurarse de que una celda no se cuenta dos veces.

Resultados

Xenoinjerto de pez cebra como herramienta para estudiar terapias anticancerígenas.
La variedades de células colorrectales del cáncer HCT116 fue etiquetada con CM-DiI e inyectada en el PVS de los embriones de la fertilización del poste de 2 días (dpf). Después de la inyección, los xenoinjertos se incubaron a 34 °C, una temperatura que permite el crecimiento de las células tumorales sin comprometer el desarrollo del pez cebra. Al día siguiente, los xenoinjertos fueron examinados de acuerdo con la presencia o ausencia de una masa tumoral en el PVS (el pez cebra no correctamente inyectado fue desechado y eutanásico) (Figura 6A-A''). Los xenoinjertos se agruparon según su tamaño tumoral (Figura 6B-B'') y se distribuyeron aleatoriamente (en una placa de 6 valios: ~12 xenoinjertos por pozo) en controles no tratados y quimioterapia FOLFIRI (0,18 mM de ácido folínico, 0,08 mM de Irinotecán y 4,2 mM de fluorouracilo (5-FU)).

El control E3 y las drogas fueron substituidos diariamente, y el pez cebra muerto desechado. 4 dpi, y tres días de tratamiento posterior (dpt), el injerto se cuantificó como en el paso 8.2 del protocolo. Engraftment se considera como la frecuencia de los xenoinjertos que presentan una masa de tumor en el PVS en 4 dpi. Por ejemplo, si al final del experimento hay 40 larvas vivas y 35 de las 40 presentan un tumor en el PVS, la tasa de injerto es del 87,5%. Xenografts euthanized y fijado para evaluar tamaño de tumor y apoptosis por inmunofluorescencia y microscopia confocal.

La inmunofluorescencia se realizó para detectar células apoptóticas, utilizando anticuerpos anti-escindida Caspasa 3 (Asp175) (conejo, 1:100, #CST 9661) y DAPI (50 μg/mL) para la contratensión de núcleos. Los conjuntos de datos de la pila de imágenes (cada 5um) se adquirieron en un microscopio confocal LSM710 y el análisis de datos se realizó con el software FIJI / ImageJ como se explica en el paso 12. La cuantificación del índice mitótico, apoptosis (% de Caspasa Activada3) y tamaño tumoral, reveló que FOLFIRI induce una disminución significativa de la mitosis (Test de Mann Whitney, P<0.0001) y una inducción significativa de apoptosis (Test de Mann Whitney, P<0.0001), acompañada de una reducción del 54% del tamaño tumoral (P<0.001)(Figura 8C-E, Figura 9A-E).

Estas características son útiles en pantallas fenotípicas de alto rendimiento de drogas, así como para probar los efectos intrínsecos y fisiológicos de la célula de varios tratamientos contra el cáncer en un corto período de tiempo.

Caracterización de xenoinjertos de pez cebra humano con anticuerpos específicos del ser humano
Como en todos los modelos de xenoinjerto, existe el riesgo de identificar erróneamente las células. Por ejemplo, los macrófagos pueden fagocitar las células cancerosas humanas, llegando a ser etiquetados con el tinte lipofílico, y después viajan a lo largo del anfitrión del pez cebra y así, estas células se pueden confundir desde micrometastasis del tumor. Por lo tanto, el etiquetado de xenoinjertos con anticuerpos humanos específicos como HLA humano, ki-67 o mitocondrias humanas (hMITO) es crucial para la caracterización inicial y también para familiarizarse con la morfología de las células tumorales(Figura 9F-I).

Xenoinjerto de pez cebra para estudiar las interacciones célula-célula.
Otra gran ventaja del modelo xenoinjerto de pez cebra es que es posible estudiar las interacciones de diferentes células tumorales y analizar cómo cada tipo de célula puede influir en el comportamiento de la otra. Se pueden coinyectar diferentes células cancerosas humanas (diferentes clones del mismo tumor o de diferentes tumores). En este ejemplo, dos líneas celulares de CCR derivadas del mismo paciente fueron etiquetadas con diferentes colorantes lipofílicos y mezcladas en una proporción de 1:1 para inyección (Figura 9J-K').

Al mezclar líneas celulares humanas (para generar tumores policlonales) en el mismo injerto, evite el uso del tinte DiO, ya que esto resulta en una doble tinción no específica (Tabla 2). En su lugar, use, por ejemplo, CM-DiI (línea celular #1) con CMFDA verde (línea celular #2), o CM-DiI (línea celular #1) con rojo profundo (línea celular #2) (Tabla 2, Figura 9J-K'),para obtener una fácil discriminación de las poblaciones al final del experimento. Para cuantificar la frecuencia de cada clon dentro del tumor, utilice 2 tipos de contadores diferentes en FIJI para identificar cada clon y luego divida por el número total de células (suma de todos los clones) para obtener la fracción relativa de cada uno (%).

Figura 1. Resumen del diagrama de flujo del protocolo de xenoinjerto de pez cebra Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Materiales para la inyección de embriones de pez cebra: A. Aguja de borosilicato B. Placa de agarosa al 2%. C Lazo de horquilla D. Pasos para hacer un lazo de horquilla: 1. Coloque 1 cabello dentro de un tubo capilar de vidrio dejando aproximadamente 1 centímetro de cabello fuera del tubo. 2-3. Enrosque la punta exterior del cabello con la ayuda de fórceps en el tubo capilar de vidrio formando un bucle de ~ 0.5 mm de longitud. 4. Selle el borde del tubo capilar con una gota de esmalte de uñas. 5-6. Selle un pedazo de cinta aislante alrededor del capilar para protegerlo de la rotura. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3. Imágenes representativas del estereomicroscopio de embriones de pez cebra a las 48 horas posteriores a la fecundación (48 hpf): A-A'. Morfología normal de un embrión de pez cebra a 48 hpf de desarrollo, listo para la microinyección B-B'. Morfología de un embrión de pez cebra que no ha alcanzado la etapa de desarrollo adecuada para microinyecciones a 48 hpf y presenta ya algún grado de edema cardíaco (punta de flecha negra) y yema distecha. A' y B' son aumentos de A y B respectivamente. Las barras de escala representan 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Representación esquemática de la placa de microinyección del pez cebra establecida: A. Alineación de embriones anestesiados en placa de Agar/Agar al 2% de Agarosa. B. Representación gráfica de un embrión de pez cebra post-fertilización de 2 días, con una flecha negra que indica el espacio perivitelline (PVS). C y D. Las células cancerosas se pueden inyectar con diferentes ángulos en el PVS inyectado en el espacio de perivitelina (PVS) de un embrión de 48 horas después de la fertilización. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5. Ensayo metastásico. Los embriones inyectados después de la inyección de 1 hora (1hpi) se clasifican según la ausencia (NO_circ) o la presencia (CIRC) de células tumorales en circulación. A los 4 días post inyección se cuantifica el número de xenoinjertos en ambos grupos que presentan micrometastasis. Las células del grupo NO_circ(A)tuvieron que someterse a todos los pasos metastásicos para poder formar una micrometastasis, mientras que las células del grupo CIRC(B)sólo se someten a los últimos pasos de la cascada metastásica. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6. Imágenes representativas del estereomicroscopio fluorescente de xenoinjertos en 1 día post-inyección y 4 días post-inyección. Las células cancerosas humanas que expresan la proteína fluorescente TdTomato (rojo) fueron microinyectadas en embriones de pez cebra 2 dpf. A 1 dpi, tam los embriones inyectados y desechar los mal inyectados o los embriones con un edema(A-A'')clasifican los embriones bien inyectados según los tamaños de tumor(B-B''). C. Cuantificación representativa del número total de células presentes en las diferentes categorías de tamaño tumoral a 1 dpi en xenoinjertos SW620. Cada punto representa un xenoinjerto cuantificado como se explica en la sección 12.At 4 dpi, tam las larvas y cuantifica las diferentes clases: sin tumor(D); con tumor en el PVS(E)y con un micrometastasis en el CHT(F). Las barras de escala representan 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Representación esquemática del montaje del xenoinjerto para la proyección de imagen confocal. 1. Ejemplo de etiquetado en la cubierta Y, la línea azul claro en la cubierta X representa el perímetro en el que se aplica grasa de vaselina/silicona para evitar fugas del medio de montaje. 2. Ejemplos de alineación de xenoinjertos en el cubrebocas X para imágenes confocales. 3. El soporte de montaje acuoso (flecha azul) se utiliza para unir la cubierta Y en la parte superior de la tapa X. 4. Ejemplo de cubrebocas correctamente montados. 5. Los cubrebocas se colocan en la parte superior de una diapositiva de vidrio y se aseguran con cinta transparente. 6. Xenoinjertos montados listos para imágenes confocales. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Representación visual de la cuantificación confocal de la imagen del microscopio del tamaño de tumor. Imágenes confocales de un xenoinjerto HCT116 a los 4 días después de la inyección A. Serie de segmentos z-stack en el canal DAPI adquiridos con un intervalo de 5 μm. Las líneas discontinuas rojas rodean las tres divisiones representativas utilizadas para el recuento de celdas. B. Ilustración de la cuantificación de núcleos DAPI con el cell counter plugin en el software ImageJ/Fiji. C-E. Ejemplo de resolución unicelular dentro del tumor en el que es posible visualizar/cuantificar figuras mitóticas en DAPI o utilizando un anticuerpo fosfo-histona H3 (verde). D y E son aumentos de C. Las barras de escala representan 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9. Resultados representativos. A-E. La variedades de células colorrectales del cáncer HCT116 fue etiquetada con Vybrant CM-DiI e inyectada en el PVS de los embriones de la fertilización del poste de 2 días (dpf). Después de la inyección, los xenoinjertos se incubaron a 34 °C. A 1 dpi, los xenoinjertos fueron tamizados y distribuidos aleatoriamente en controles no tratados y FOLFIRI, tratados durante 3 días consecutivos y fijados en 4 dpi. A.La inmunofluorescencia fue realizada para detectar las células apoptotic, usando el anticuerpo anti-hendido de Caspase 3 y DAPI para los núcleos counterstaining. La cuantificación del índice mitótico C,apoptosis (% de Caspasa3 activada) D, y tamaño tumoral E,reveló que FOLFIRI induce una disminución significativa de la mitosis (Prueba de Mann Whitney, P<0.0001) y una inducción significativa de apoptosis (prueba de Mann Whitney, P<0.0001), acompañada de una reducción del 54% del tamaño del tumor (P<0.001). El número de xenoinjertos analizados se indica en la figura y cada punto representa un xenoinjerto. F-H. Imágenes representativas de xenoinjertos de cáncer colorrectal a los 4 días postinyección etiquetados con marcadores específicos humanos en verde (HLA humano, ki67 y hMITO) en el PVS y CHT I. J-J'. Imágenes confocales de xenoinjertos policlonales, inyectados con dos diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal humano etiquetadas con tinción lipofílica CellTracker Deep Red (Cy5 - blanco), CellTracker Green CMFDA (488 - verde) y DAPI counterstaining. K-K'. Imágenes confocales de dos diversas variedades de células colorrectales humanas del cáncer etiquetadas con la coloración lipofílica CellTracker rojo profundo (Cy5 - blanco), Vybrant CM DiI (594 - rojo) y DAPI counterstaining. Las barras de escala representan 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

línea celular

tejido

especie

morfología

Modo de crecimiento

Confluencia ideal para inyección

Agente disociante inyectable

Tiempo de disociación

Protocolo para el etiquetado

Medio de inyección

Dividir el número total de células por (para lograr la concentración ideal para la inyección)

SW480

Adenocarcinoma colorrectal (primario)

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

matraz

PBS 1x

0,25

SW620

Adenocarcinoma colorrectal (metástasis)

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

matraz

PBS 1x

0,25

HCT116

Carcinoma colorrectal (primario), mutante de Kras

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

matraz

PBS 1x

0,25

HKE3

Carcinoma colorrectal, Kras WT

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

matraz

PBS 1x

0,25

HT-29

Adenocarcinoma colorrectal (primario)

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minutos

matraz

PBS 1x

0,2

CACO-2

Adenocarcinoma colorrectal (primario)

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

Medio completo

0,25

MCF-7

Adenocarcinoma de mama (metástasis)

Humano

epitelial

adherente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

60% FBS + 40% medio completo

0,5

Hs578T

Carcinoma de mama (primario)

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

2 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

60% FBS + 40% medio completo

0,5

MDA-MB-468

Adenocarcinoma de mama (metástasis)

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

8 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

60% FBS + 40% medio completo

0,5

MDA-MB-231

Adenocarcinoma de mama (metástasis)

Humano

epitelial

adherente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

Medio completo

0,5

RT112

Carcinoma de células de transición de la vejiga urinaria (primario)

Humano

epitelial

adherente

85% - 90%

TrypLE

6 minutos + raspador de celdas

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

Medio completo

0,5

BFTC905

Carcinoma de células de transición de la vejiga urinaria (primario)

Humano

epitelial

adherente

75% - 85%

TrypLE

10 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

80% medio completo + 20% PBS/EDTA 2 mM

0,5

J82

Carcinoma de células de transición de la vejiga urinaria (primario)

Humano

epitelial

adherente

85% - 90%

TrypLE

10 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

Medio completo

0,5

RT4

Carcinoma de células de transición de la vejiga urinaria (primario)

Humano

epitelial

adherente

85% - 90%

TrypLE

6 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

Medio completo

0,5

MIA PaCa-2

Carcinoma epiteliodo pancreático (primario)

Humano

epitelial

adherente

80% - 90%

TrypLE

3 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

60% FBS + 40% medio completo

0,5

PANC-1

Carcinoma epiteliodo pancreático (primario)

Humano

epitelial

adherente

80%

TrypLE

5 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

PBS/EDTA 2mM

0,5

VC8

Fibroblastos pulmonares, mutante BRCA2, deficiente en HR

Hámster chino

epitelial

adherente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

Medio completo

0,25

VC8-B2

Fibroblastos pulmonares, BRCA2 humano, BRCA2 −/− deficiente en HR

Hámster chino

epitelial

adherente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minutos

Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL

Medio completo

0,25

Tabla 1: Confluencia in vitro óptima para la inyección de varias líneas celulares

Tinte celular

Número de catálogo

Espectro de fluorescencia (Exc. - Em.)

Dilución de existencias

Dilución de trabajo para manchar en un matraz

Dilución de trabajo para teñir en una microcentrífuga de 1,5 mL

Tiempo de incubación

Observaciones

Vybrant CM-DiI

V22888

549 nm - 569 nm

Ya diluido

4:1000 en PBS 1x

4:1000 en PBS 1x

15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC

Vybrant DiO

V22886

484 nm - 501 nm

Ya diluido

5:1000 en PBS 1x

5:1000 en PBS 1x

15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC

No es una buena resolución en imágenes confocales a los 4 días después de la inyección

CellTracker Rojo profundo

C34565

630 nm - 660 nm

1 mM en DMSO

0,5 - 2,5 μM en PBS 1x

0,5 - 2,5 μM en PBS 1x

15 min @ 37 ºC

CellTracker Verde CMFDA

C7025

492 nm - 517 nm

10 mM en DMSO

0,5 - 2,5 μM en PBS 1x

0,5 - 2,5 μM en PBS 1x

15 min @ 37 ºC

El producto se escapa a la cavidad abdominal 48 horas después de la inyección, pero es ideal para estudios de coinyección

Tabla 2: Tinte y condiciones

tamaño	Nº de larvas	E3 1x volumen medio
100 mm x 15 mm (estándar)	Hasta 50	20-25 mL
60 mm x 15 mm	Hasta 20	10 mL
Placa de 6 pozos	Hasta 15 por pozo	3-4 mL por pozo

Tabla 3: Opciones de placas de Petri

E3 medio 50x - stock	Para 10 litros de agua estéril:
	146,9 g de NaCl
	6,3 g de KCl
	24,3 g de CaCl2·2H2O
	40,7 g de MgSO4·7H2O
E3 medio 1x – listo para usar	400 mL de E3 medio 50x
	60 mL de solución de azul de metileno al 0,01%
	Llene hasta 20 litros de agua del sistema de peces
Tricaine 25x – stock y eutanasia	2 g de polvo de Tricaine
	500 mL de agua de ósmosis inversa
	10 mL de 1 M Tris (pH 9)
	Ajustar a pH 7
Tricaine 1x - Anestesia	20 mL de Tricaine 25x
	Llene hasta 500 mL de agua del sistema
60 mg/mL Pronasa - stock 100x	1 g de pronasa
	16,7 mL de agua estéril
0.6 mg /mL Pronasa – 1x listo para usar	100 μL de pronasa 100x
	9,9 mL de E3 medio 1x

Tabla 4: Composiciones de la solución

Discusión

La creciente importancia del pez cebra como modelo para el desarrollo del cáncer y la detección de fármacos ha dado lugar a numerosas publicaciones^{3,4,7,13,14,16,18,19,20,21.} Sin embargo, la inyección de células cancerosas en embriones de pez cebra es una técnica que requiere un alto nivel de destreza que puede ser un desafío para los investigadores. En este protocolo pretendemos proporcionar información práctica y algunos consejos que puedan ayudar a superar los retos iniciales de la creación de xenoinjertos de embriones de pez cebra.

Manejo celular de inyección previa
Este protocolo optimizado para la generación de xenoinjertos de pez cebra con líneas celulares se puede adaptar a varios tipos de células (cancerosas) con diferentes morfologías. Recomendamos que todas las líneas celulares utilizadas para xenoinjertos de pez cebra estén libres de micoplasma. A diferencia de otras contaminaciones bacterianas, la presencia de micoplasma en el cultivo celular no genera cambios que puedan ser fácilmente detectados bajo el microscopio^22. La contaminación por micoplasma puede afectar el potencial de injerto de las líneas celulares, su sensibilidad a los fármacos, así como la viabilidad de los embriones de pez cebra.

Aunque las células pueden continuar proliferando durante un período prolongado, su fenotipo y genotipo pueden ser propensos a cambios. Es importante familiarizarse con la morfología y el comportamiento de las líneas celulares en cultivo. Recomendamos mantener el número de pasajes celulares después de la descongelación entre 3-12 para obtener resultados reproducibles. Por lo tanto, se deben realizar pruebas regulares de micoplasma.

Las células deben estar en su fase logarítmica (fase de crecimiento exponencial antes de alcanzar la confluencia ~70%) en el día de la inyección. Esto permitirá un engraftment adecuado y un desarrollo apropiado de los sellos distintivos del tumor. Para prevenir la variación en el fenotipo de células dentro del xenoinjerto, es crítico mantener la confluencia para la inyección constante entre los experimentos. El número de células inyectadas se puede adaptar a las características de cada línea celular, ya que algunas pueden requerir densidades más altas de inyección para prosperar en los embriones de pez cebra.

Consideraciones sobre el etiquetado de las células
Para visualizar mejor las células tumorales humanas para su inyección y análisis futuro, las células tumorales se pueden etiquetar con colorantes fluorescentes. Debido a las diferencias en tamaño celular, el número total de cells/cm² en cultivos adherentes varía entre las líneas celulares. Esto afectará la eficacia del protocolo de tinción, así como el número de células cosechadas para inyección. Las células grandes que producen números bajos por matraz (es decir, Hs578T) o crecen en grupos (es decir, BFTC905) requerirán la agrupación de varios matrazs para un solo experimento. En este caso, la tinción de las células no debe realizarse directamente en el matraz, ya que esto causará el uso de cantidades excesivas de colorante (alto costo). Por otro lado, las células que son altamente sensibles a los ciclos excesivos de centrifugación, así como las que producen un número elevado por matraz (es decir, HCT116) pueden teñirse directamente en el matraz y luego desprenderse con EDTA /raspador de células (para obtener más información, consulte la Tabla 1).

Siempre que sea posible, en lugar de usar un enfoque enzimático, use EDTA para separar las células el día de la inyección, de modo que las células recuperen sus uniones célula-célula más rápidamente y se someten a menos pasos de centrifugación. Sin embargo, si las células son sensibles a EDTA, muy adherentes o crecen en racimos, se puede aplicar un método enzimático. La optimización de la concentración ideal para inyección, así como del medio de inyección, depende de las características de cada línea celular, por lo que podría necesitar algunos ajustes (Tabla 1).

Calibración de microinyección
Contrariamente a la entrega de oligonucleótidos o fármacos en el embrión de pez cebra, una retícula no se utiliza para calibrar la aguja cuando se trabaja con líneas celulares para xenoinjertos. Después de algún tiempo durante la inyección, las células comenzarán a obstruirse, y es necesario cortar la punta de la aguja para aumentar su diámetro o cambiar la aguja por completo. Este procedimiento dificulta la calibración de la retícula.

Para abordar este problema, el número de células dispensadas está regulado por la presión de expulsión y el tiempo necesario para alcanzar un tamaño similar al ojo del embrión dentro de 1-3 pulsos. Luego, para controlar aún más el tamaño del tumor, a 1 dpi, los xenoinjertos se clasifican de acuerdo con el tamaño del tumor como se muestra en la Figura 6 B-B". Como se representa en el ejemplo de la Figura 6C, este método de clasificación es eficiente para reducir la variación de los tamaños de los tumores: si los agrupamos todos juntos (+, ++, +++) el STEV es ~doble de la clase ++(~906 células a ~422 células) y la variación del coeficiente es de ~31,9% en comparación con el 14,5% en la clase ++. Dado que la referencia para la inyección es el volumen, el número total de células varía mucho entre los tipos de celdas, dependiendo del tamaño y la forma de las celdas. Por ejemplo, las células grandes con una gran cantidad de citoplasma como el cáncer de mama Hs578T, producen tumores mucho más pequeños (~ 600 células). Además, cada línea celular requiere un número diferente de celdas. Por ejemplo, las líneas celulares de cáncer de vejiga urinaria HT29 CRC y RT112 han demostrado que cuanto mayor es el número de células inyectadas, mayor es la mortalidad del pez cebra. Por lo tanto, se necesita un período de optimización durante el desarrollo de los xenoinjertos para probar si la línea celular tiene efectos tóxicos en el embrión o requiere densidades de inyección más altas / más bajas.

Sitio de inyección
Una de las discrepancias más comunes a la hora de generar xenoinjertos de embriones de pez cebra es el sitio de inyección. La yema suele ser el lugar de elección para la inyección debido a su fácil accesibilidad. Sin embargo, hemos observado que las células inyectadas en la yema tienen una mayor tendencia a morir. Aunque técnicamente más difícil, recomendamos inyectar en el PVS y lo más lejos posible del corazón. Dentro del PVS, las células pueden agregar, reclutar vasos y células inmunes, y migrar, intravasar, extravasar y formar micrometastasis, si presentan características metastásicas^8,11.

Eficiencia del injerto
Se esperan diferencias en la eficiencia del injerto y el tamaño del tumor entre las líneas celulares a 4 dpi debido a sus distintos grados de muerte/supervivencia/proliferación de células basales, pero también debido a la inmunogenicidad innata que cada línea celular puede mostrar^9.

metástasis
La metástasis comprende una cascada de varios pasos de eventos que se pueden dividir en dos etapas arbitrarias. En la primera etapa, las células tumorales tienen que desprenderse del sitio primario, migrar e invadir los tejidos adyacentes y luego intravasar en el torrente sanguíneo. En la segunda etapa, las células tumorales deben sobrevivir en circulación, extravasarse de la sangre o de los vasos linfáticos, y finalmente colonizar en sitios secundarios^23. Para distinguir entre estos eventos tempranos y tardíos y abordar el potencial / competencia de las diferentes células tumorales para realizar estos pasos, diseñamos un ensayo simple.

En general, cuando se inyectan en el PVS, las células tumorales pueden entrar directamente en circulación y luego quedar atrapadas físicamente en el tejido hematopoyético caudal (CHT) (región de la cola). Sin embargo, de acuerdo con las características de cada célula tumoral, hemos visto que algunas células tumorales permanecen en el CHT 4 dpi y son capaces de formar micrometastasis mientras que otras células tumorales desaparecen (despejadas después de quedar atrapadas en el CHT).

Por lo tanto, comparando la eficiencia de la micrometastasis (a 4 dpi) cuando las células se colocaron directamente en circulación - CIRC (las células sólo tienen que pasar por los últimos pasos de la metástasis) vs. cuando no - NO CIRC (las células necesitan pasar por pasos tempranos y tardíos para poder formar una micrometastasis) podemos evaluar su potencial metastásico temprano o tardío. Hemos observado células tumorales que pueden formar eficientemente micrometastasis en el CHT en ambos grupos (CIRC y NO CIRC), lo que sugiere que estas células tienen la capacidad de someterse a todas las etapas de la cascada metastásica (SW480 y MDA-MB-468 por ejemplo)^8,11. Por el contrario, otras células tumorales tienen un potencial metastásico muy bajo en ambos grupos, casi nunca haciendo micrometastasis, incluso cuando se inyectan en circulación (es decir, visibles en el CHT a 24 hpi, pero a 4 dpi ya no están allí, Hs578T por ejemplo)⁸. Sin embargo, hemos encontrado claramente otro grupo - uno que es solamente capaz de formar micrometastasis cuando está inyectado en la circulación (podemos observar solamente micrometastasis en el grupo de CIRC). Esto sugiere que estas células tienen una baja eficiencia en la realización de los primeros pasos de la cascada metastásica, pero por otro lado son capaces de sobrevivir en circulación, extravasar y colonizar un sitio distante.

Inmunostaining e imágenes
Antes de la fijación, este protocolo de inyección se puede utilizar para otros enfoques de imágenes en vivo como microscopía de contraste de interferencia diferencial en vivo (DIC), microscopía de disco giratorio, imágenes confocales en vivo de alta resolución y microscopía de láminas de luz, etc.

Las células muertas y los desechos celulares aparecen brillantes cuando se observan a través del estereomicroscopio fluorescente y pueden confundirse con células vivas, especialmente si el objetivo del estudio es evaluar el potencial metastásico de las líneas celulares. Quisiéramos tensionar la importancia de realizar proyección de imagen confocal con los marcadores específicos de la viabilidad y DAPI para evaluar el estado de supervivencia del tumor y del micrometastasis. Además, es fundamental utilizar anticuerpos humanos específicos para detectar células humanas como las mitocondrias antihumanas o el HLA antihumano. Al implementar el protocolo, entrene los ojos del experimentador comparando la tinción en el esteremicroscopio con las imágenes confocales. Después de algún tiempo, los experimentadores pueden distinguir claramente los desechos de las células vivas en el estereomicroscopio fluorescente.

Aunque otros métodos para cuantificar carga del tumor tales como área entera de la fluorescencia sean ampliamente utilizados, recomendamos realizar immunostaining del montaje entero y proyección de imagen confocal como método más exacto. No sólo la eficiencia de la tinción de colorantes lipofílicos es muy variable (es decir, algunas células están muy bien teñidas, mientras que otras no lo están - probablemente debido al contenido de lípidos de sus membranas), sino que también muchas veces los tintes lipofílicos forman agregados, y las células muertas tienden a ser más brillantes - creando varios artefactos que se pueden confundir con células vivas.

Las células se pueden transducir con proteínas fluorescentes para ayudar en su seguimiento y omitir el etiquetado celular. Sin embargo, asegúrese de que las células transducidas y no transducidas producen los mismos resultados en los xenoinjertos de pez cebra.

Además, los macrófagos pueden fagocitos estos restos de células fluorescentes que se etiquetan fluorescentemente y migran, generando falsos positivos en células metastásicas. Por lo tanto, recomendamos una serie de herramientas analíticas, que por supuesto se pueden extender a muchas otras lecturas para una interpretación más precisa del comportamiento del tumor:

• Proliferación - cuantificación de figuras mitóticas con DAPI o anticuerpo anti-pHH3^Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),
• Muerte celular por apoptosis- anticuerpo anti-activado Caspasa3^Asp175 (Tecnologías de Señalización Celular Cat. #9661) o equivalente,
• Tamaño del tumor - conteo de DAPI: las células tumorales humanas muestran una organización de cromatina muy distinta, por lo que se distinguen fácilmente de las células del pez cebra y siempre es posible verificarlas dos veces con el tinte (cuando está entrenando su ojo),
• Para estudios metastásicos,para detectar inequívocamente células humanas, - HLA anti-humano (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), mitocondrias anti-humanas (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clon 113-1).

Para una adquisición confocal con intervalo de 5 μm entre rebanadas en la pila Z de las células cancerosas control HCT116 (tamaño nuclear promedio de 10-12 μm de diámetro) con dapi counterstaining, hemos observado que ~ 50% de las células se comparten entre dos rebanadas consecutivas. Por lo tanto, si se cuenta cada sector, existe un alto riesgo de contar las mismas celdas dos veces. Ir y venir entre rebanadas para evitar problemas en la cuantificación da como resultado una técnica lenta y propensa a errores. Para facilitar la cuantificación del número total de células y permitir una mayor reproducibilidad entre los investigadores, creamos la fórmula de tamaño tumoral previamente descrita en este protocolo^8.

Incluimos un número de corrección (1.5) para tener en cuenta las celdas de ~ 50% compartidas entre las rebanadas. Encontramos que el error medio de la cuenta manual del tumor entero entre los investigadores era el 20%. Dos investigadores que utilizaron la fórmula tuvieron un error del 2%. El uso de esta fórmula tiene una tasa de precisión del 93% y una tasa de reproducibilidad del 98%. También probamos métodos automatizados, pero demostraron un error superior al 50% causado por la configuración del umbral.

Debido a las características de las células apoptóticas, la cuantificación de las células caspasa 3 activadas es más difícil. Para reducir el número de errores y la variación en los resultados, se recomienda que las muestras de control y experimentales sean contadas por el mismo investigador. Además, al aprender esta técnica, un nuevo investigador debe contar imágenes que ya fueron cuantificadas por investigadores más experimentados para comparar resultados y entrenar.

La longitud del ensayo se puede ampliar si es necesario. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las larvas de pez cebra requieren alimentación viva a partir de ~ 7 días después de la fertilización (5 días después de la inyección). Además, las pautas y regulaciones de bienestar animal aplicadas a las larvas mayores de 6 días después de la fertilización pueden variar.

Este protocolo proporciona herramientas útiles para permitir que un solo investigador inyecte aproximadamente ~ 200-300 larvas de pez cebra por hora; y los resultados para el ensayo completo, incluido el análisis y la interpretación estadística, obtenidos en tres semanas. Esperamos que este protocolo pueda ayudar a los investigadores a convertirse en expertos en la generación de xenoinjertos de pez cebra. No es fácil; necesitas practicar pero llegarás allí. ¡Buena suerte!

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar for bacteriology	VWR	97064-336	Agar plate
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)	Cell Signalling Technologies	9661	Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti-human HLA (Rabbit monoclonal)	Abcam EP1395Y	ab52922	Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti- 488 (Rabbit monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35552	Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
anti- 594 (Rabbit monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35560	Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
CellTracker Deep Red Dye	ThermoFisher Scientific	C34565	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
CellTracker Green CMFDA Dye	ThermoFisher Scientific	C2925	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Conical Centrifuge tube 50mL	VWR	525-0610
Conical Centrifuge tube 15mL	VWR	525-0604
DAPI			Nuclear and chromosome counterstain
Laser-Based Micropipette Puller P-2000	Sutter-Instrument		Micropipette Puller
Microcentrifuge tube 1.5mL	Abdos	P10202
Microscope slides, cut edge	RS France	BPB016	Slides for mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Mounting medium
Pneumatic Picopump	World Precision Instruments	PV820	Microinjector
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	ThermoFisher Scientific	631-9430	Coverslips for mounting
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004	Agar plate
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100-4	Borosilicate capillaries
TrypLE	Gibco	12605036	Enzymatic detachment solution
Vaseline			Petroleum jelly for slide sealing
Vybrant CM-DiI Dye	ThermoFisher Scientific	V22888	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	ThermoFisher Scientific	V22886	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology	ZEISS		Fluorescence Stereo Zoom Microscope
Zeiss LSM 710	ZEISS		Confocal microscope