Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Riepilogo

Qui, forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

Abstract

Gli xenografti larvali zebrafish sono ampiamente utilizzati per la ricerca sul cancro per eseguire studi in vivo e in tempo reale sul cancro umano. La possibilità di visualizzare rapidamente la risposta alle terapie anti-cancro (chemio, radioterapia e biologia), angiogenesi e metastasi con risoluzione a singola cellula, pone il modello xenograft zebrafish come la scelta migliore per sviluppare studi preclinici.

Il saggio di xenograft larvale zebrafish presenta diversi vantaggi sperimentali rispetto ad altri modelli, ma probabilmente il più sorprendente è la riduzione della scala delle dimensioni e di conseguenza del tempo. Questa riduzione della scala consente l'imaging a singola cellula, l'uso di un numero relativamente basso di cellule umane (compatibili con le biopsie), screening farmacologici a media-alta produttività, ma soprattutto consente una significativa riduzione del tempo del saggio. Tutti questi vantaggi rendono il saggio di xenograft zebrafish estremamente attraente per le future applicazioni di medicina personalizzata.

Molti protocolli di xenoinnesto zebrafish sono stati sviluppati con un'ampia varietà di tumori umani; tuttavia, manca ancora un protocollo generale e standardizzato per generare in modo efficiente xenografti larvali di zebrafish. Qui forniamo un protocollo passo-passo, con suggerimenti per generare xenografti e linee guida per l'analisi del comportamento tumorale, l'immunofluorescenza a montaggio intero e la quantificazione dell'imaging confocale.

Introduzione

Zebrafish (Danio rerio) sta emergendo come un potente organismo modello di vertebrato per studiare lo sviluppo e le malattie. Zebrafish condivide caratteristiche genetiche altamente conservate (~70% omologia genetica e ~84% geni correlati alle malattie) e caratteristiche morfologiche di base degli organi^{con l'uomo 1,2}. Questa conservazione consente l'uso di zebrafish per modellare diverse malattie umane, tra cui il^{cancro 3,4}.

La manipolazione e la manutenzione del pesce zebra è molto più facile ed economica rispetto ai topi a causa delle loro piccole dimensioni, dell'elevata fecondità tutto l'anno e della fecondazione^{esterna 3,5}. Gli embrioni di zebrafish non richiedono un'alimentazione dal vivo durante i loro primi 5-7 giorni di vita e sono stati utilizzati come modello efficace per lo sviluppo, l'infezione e^{il cancro 1,4,6,7}. Gli embrioni di zebrafish si schiudono a 48 ore dopo la fecondazione (HPF) e sono animali a nuoto libero con tutti gli organi formati, un cuore pulsante e un sistema circolatorio funzionale, fegato, cervello, midollo renale,^{ecc. 1,3}. Inoltre, in questa fase di sviluppo è in gioco solo l'immunità innata, l'immunità adattiva è ancora in fase di sviluppo, consentendo un innesto generale ed efficiente delle cellule umane senza bisogno di utilizzare mutanti immunocompro compromessi^7,8. Tuttavia, è importante notare che non tutte le cellule umane si innesto^{allo stesso modo 9} e che, ad esempio, per le cellule leucemie è stato dimostrato che i fagociti (neutrofili e macrofagi) devono essere esauriti per un efficiente innesto¹⁰.

La trattabilità genetica del pesce zebra e la trasparenza ottica dei suoi primi stadi embrionali consentono l'imaging intravitale a singola cellula ad alta risoluzione e quindi, per la creazione di tecniche di imaging all'avanguardia in diversi campi della biologia. Inoltre, nel contesto del cancro, queste caratteristiche sono utili per studi in tempo reale delle prime fasi delle interazioni ospite-tumore, come lo studio del potenziale angiogenico e metastatico, nonché delle interazioni con il sistema immunitario innato^8,9,11,12,13.

Sebbene nel breve saggio xenograft non ci sia tempo per l'"evoluzione" metastatica- è possibile analizzare la capacità metastatica delle cellule tumorali (cioè la loro efficienza di passare attraverso passaggi metastatici come invasione, intravasazione, sopravvivenza in circolazione, estravasione e colonizzazione, e quindi studiare questi processi in vivo e in tempo reale^8,11,13,14).

Le caratteristiche del suo ciclo vitale posizionare il pesce zebra come modello unico per la medicina personalizzata nel cancro. I saggi possono essere eseguiti in un arco di tempo più breve e i risultati ottenuti in^{poche settimane 7,8,9,11,12,15,16}. La sedano e la fattibilità di questi saggi offrono a medici e ricercatori la possibilità di ottenere risultati tras tras traslazione che possono essere utili per i pazienti oncologici, per i quali il tempo è un bisogno essenziale.

Nonostante i crescenti tentativi di generare xenografti embrionale zebrafish di successo, c'è ancora bisogno della standardizzazione della procedura di iniezione e della valutazione della vitalità cellulare e del comportamento tumorale dopo l'iniezione.

In questo protocollo forniamo ai ricercatori una guida dettagliata e chiara per l'iniezione di linee cellulari tumorali umane negli embrioni di zebrafish e la successiva fissazione, immunostaining, imaging e quantificazione del comportamento delle cellule tumorali.

Protocollo

Il modello zebrafish (Danio rerio) è stato gestito e mantenuto secondo i protocolli standard della legislazione europea sul benessere degli animali, della direttiva 2010/63/UE (Commissione europea, 2016) e della piattaforma di pesce Champalimaud. Tutti i protocolli sono stati approvati dal Comitato etico per gli animali champalimaud e dalle organizzazioni istituzionali portoghesi ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Animal Welfare and Ethics Body) e DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Direzione generale per l'alimentazione e la veterinaria).

NOTA: Prima di iniziare l'esperimento principale, praticare con la linea cellulare del cancro del colon-retto umano (CRC) HCT116. Questa linea cellulare è facile da preparare (altamente proliferativa), facile da iniettare e si inietta in modo molto efficiente (circa il 95-100%). Inizia con cellule in eccesso (~ 12x10^{6 cellule,} pallone T-75) e pesci in eccesso (400 pesci) fino a diventare abile nella tecnica, poiché molte cellule e pesci andranno persi durante l'allenamento. Gli sperimentatori sono pronti una volta raggiunto l'innesto di ~95% negli xenograft HCT116. Vedere la figura 1 per uno schema del protocollo completo.

1. Impostazione per iniezione

1. Due settimane prima dell'iniezione, espandere le cellule in coltura (cfr. tabella 1 per una guida dettagliata della confluenza ottimale in vitro per l'iniezione di diverse linee cellulari).
2. Tre giorni prima dell'iniezione, attraversare il pesce zebra dello sfondo desiderato.

2. 24 ore prima dell'iniezione

1. Pulire le placche embrionale zebrafish (scartare tutti gli embrioni morti e non sviluppati) e rinfrescare il mezzo E3.
2. Nella stanza di coltura cellulare, scartare il mezzo di coltura cellulare dai contenitori previsti per l'iniezione, lavare una volta con 1 soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) per rimuovere le cellule morte e aggiungere mezzo fresco.
3. Preparare gli strumenti per la procedura di iniezione, come: aghi di microiniezione, piastre di agarosio e forcine per allineare gli embrioni per iniezione(Figura 2A-D, dettagliata di seguito).
   1. Aghi a microiniezione (Figura 2A)
      1. Utilizzare capillari di vetro borosilicato (4 pollici, OD 1,0 mm, nessun filamento in un estrattore di micropipette (calore: ≈500; fil: 10; vel: 50; dic: 60; tirare: 100).
   2. Preparazione piastra(figura 2B)
      1. Preparare il 2% di agarosio in H₂O, scaldarlo e versare uno strato di agarosio disciolto nel coperchio di una piastra di Petri pulita. Lascia che polimerizzi e con l'aiuto di un righello, crea da tre a quattro linee di agarosio dritte per l'allineamento degli embrioni.
   3. Gruppo tornanti (Figura 2C-D)
      1. Posizionare 1 capello all'interno di un tubo capillare di vetro lasciando circa 1 centimetro di capelli fuori dal tubo.
      2. Arricciare la punta esterna dei capelli con l'aiuto di forcep nel tubo capillare di vetro formando un anello di ~ 0,5 mm di lunghezza.
      3. Sigillare il bordo del tubo capillare con una goccia di smalto per unghie. Questo aiuterà anche a correggere il ciclo in posizione. Lascialo asciugare. Ripetere la procedura sull'altro bordo del tubo.
      4. Tagliare un pezzo di nastro elettrico (più resistente, impermeabile e rigido rispetto al normale nastro adesivo).
      5. Sigillare il nastro attorno al capillare per proteggerlo dalla rottura.

3. Giorno di iniezione

1. Separare gli embrioni nati dalle uova non odiate. L'aggiunta di 1x pronasi (0,6 mg/mL, tabella 3) al mezzo embrionale in questa fase può aumentare la schiusa. Posizionare gli embrioni nell'incubatrice (a 28 °C) fino all'iniezione.
   NOTA: Non lasciare gli embrioni nella soluzione di pronasi per più di 1 ora, poiché l'enzima agirà sugli embrioni nati aumentando il loro rischio di mortalità. Assicurarsi che lo stadio di sviluppo degli embrioni sia quello corrispondente a 48 hpf(figura 3A, A')per evitare il rischio di edema e mortalità.
2. Preparare 1x Tricaine (da uno stock 25x).
   NOTA: Una ricetta dettagliata è disponibile nella tabella 3 e nella rete informativo Zebrafish - pagina web ZFIN¹⁷.

4. Etichettatura cellulare per iniezione

NOTA: L'etichettatura delle cellule può essere eseguita direttamente in un pallone o in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml dopo distacco enzimatico. Per ulteriori informazioni, vedere Discussione.

1. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare e lavare il pallone due volte (2x) con 1X PBS.
2. Etichettare le cellule con un colorante lipofilo preferito direttamente nel pallone (soluzione da 2 ml/ pallone T75) o in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml dopo distacco enzimatico. Evitare l'esposizione a cellule leggere e incubate a 37 °C (cfr. tabella 1 e tabella 2 per condizioni/soluzioni).
3. Se l'etichettatura nel pallone
   1. Rimuovere il colorante, lavare con 1x PBS e staccare le cellule con EDTA e un raschietto per celle.
   2. Trasferire le celle in tubi a microcentrifugo da 1,5 ml. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g, quindi andare al passaggio 4.5.
4. Se l'etichettatura nel tubo di microcentrifugo da 1,5 ml:
   1. Centrifugare 5 minuti a 300 x g per rimuovere il colorante e scartare il supernatante. Resuspend in 1x PBS da lavare.
   2. Centrifugare 5 minuti a 300 x g e quindi andare al passo 4.5.
5. Scartare il supernatante e resospendare il pellet con il mezzo di coltura cellulare (per un pellet da 50 μL aggiungere ~ 150-200 μL di mezzo).
6. Quantificare la vitalità cellulare usando una camera Neubauer con esclusione blu trypan o altro metodo di scelta.
7. Centrifugare per 4 minuti a 300 x g e scartare il supernatante. Rimosoppo le cellule nel mezzo di iniezione.
   NOTA: La concentrazione cellulare raccomandata (in generale da 0,25-0,5x10⁶ cellule/μL) e il mezzo si trovano nella tabella 1.
8. Da questo punto in poi, tenere le cellule sul ghiaccio.

5. Procedura di iniezione

1. Anestetizzare gli embrioni in 1x Tricaine per 5 minuti.
2. Con una pipetta Pasteur in plastica, trasferire una piccola quantità (~ 50) di embrioni anestetizzati sulla piastra di agarosio e allinearli attentamente con l'aiuto di un anello di forcine. Assicurarsi di mantenere la distanza tra gli embrioni, in particolare tra il tuorlo di uno e la testa del prossimo (Figura 4A).
   NOTA: Il numero di embrioni da allineare varierà a seconda del livello di competenza del ricercatore che esegue le iniezioni. Inizia con alcuni (~ 10-20). Per uno schema del corretto posizionamento degli embrioni nella piastra agar/agarrose vedere figura 4A.
3. Assicurarsi che gli embrioni allineati non si asciughino nella piastra di agarosio per prevenire la mortalità, aggiungendo con cura 1-3 gocce di soluzione di 1x Tricaina alla piastra.
4. Toccare leggermente il tubo di microcentrifugo per rimescolare le cellule. Ricaricare l'ago di iniezione con la sospensione cellulare utilizzando una punta del microloader evitando bolle d'aria, in quanto possono compromettere l'integrità degli embrioni.
5. Aprire la valvola di pressione dell'aria (40 psi), impostare il microiniettore e posizionare con cura l'ago di microiniezione nel supporto.
   NOTA: Utilizzare le seguenti impostazioni consigliate per i microiniettori: Tenere premuta la pressione - sfiato (3 psi); Espelle pressione - sfiato; Intervallo - 100 ms.
6. Tagliare l'ago di microiniezione vicino alla punta con pini Dumont #5 o simili sotto lo stereomicroscopio.
   NOTA: La punta deve essere abbastanza smussata e sottile da consentire alle cellule di passare senza intasarsi e di evitare di danneggiare gli embrioni e perdere cellule. Una spessa punta dell'ago di microiniezione ferirà l'embrione e promuoverà la formazione di edema o morte di zebrafish. Graticule non viene utilizzato per la calibrazione dell'ago. Per una spiegazione dettagliata, vedere Discussione.
7. Prima di iniettare gli embrioni, testare la pressione del microiniettore a partire dalla pressione di espulsione più bassa fino a quando in ~1-3 pulsa un volume simile alle dimensioni dell'occhio dell'embrione zebrafish.
   NOTA: Si raccomanda l'uso di uno stereomicroscopio a fluorescenza ogni volta che è possibile all'inizio dell'allenamento. Ciò consentirà una più facile identificazione delle cellule marcate fluorescentmente.
8. Perforare con cura al centro del tuorlo dell'embrione, abbassando l'angolo dell'ago e spingere cautamente fino a quando la punta dell'ago raggiunge lo spazio perivitellino (PVS) (Figura 4B-D).
9. Premere il pedale del microiniettore e iniettare le cellule nel PVS. Usa l'occhio dell'embrione come guida. Cerca di iniettare un volume di cellule simile alle dimensioni dell'occhio dell'embrione e il più lontano possibile dal cuore per prevenire l'edema cardiaco.
10. Rimuovere con cura l'ago e passare all'embrione successivo.
11. Regolare la pressione del microiniettore, se necessario.
    NOTA: Le cellule tendono a iniziare a intasarsi, quindi la pressione può essere aumentata. Se necessario, è possibile tagliare il capillare (per aumentare il diametro) riducendo al contempo la pressione.
12. Trasferire gli embrioni iniettati in una piastra di Petri pulita (Tabella 4) con 1 soluzione di Tricaina e lasciarli riposare per 5-10 minuti. Questo darà il tempo alla ferita di chiudersi.
    NOTA: Per trasferire gli embrioni dalla piastra di agar alla piastra di Petri aggiungere alcune gocce di soluzione di 1x Tricaina sopra gli embrioni e raccoglierli con cura con una pipetta Pasteur di plastica. Lascia cadere gli embrioni raccolti in una nuova piastra di Petri con soluzione di 1x Tricaine.
13. Rimuovere la soluzione 1x Tricaine e aggiungere il mezzo E3 fresco.
14. Incubare gli xenoinnesti a 34 °C (una temperatura compromessa tra la sopravvivenza delle linee cellulari umane e lo sviluppo del pesce zebra⁸).

6. Saggio metastatico

1. A circa 1 ora di post-iniezione (hpi), vengono proiettati gli embrioni iniettati su uno stereomicroscopio fluorescente e si ordinano gli xenoinnesti in 2 gruppi, in base all'assenza (Figura 5A) o alla presenza (Figura 5B) delle cellule in circolazione.
   NOTA: Anche se viene rilevata una sola cellula tumorale nel cuore o nella circolazione, includere questi xenoinnesti nel gruppo degli xenoinnesti con cellule in circolazione. In alternativa, le cellule possono essere iniettate direttamente in circolazione per aumentare il numero di xenoinnesti in questo gruppo.

7. 1 giorno dopo l'iniezione

1. Su uno stereomicroscopio fluorescente analizzare attentamente ogni embrione e selezionare quelli con tumori correttamente iniettati (Figura 6).
   NOTA: Se necessario, anestetizzare gli embrioni iniettati con soluzione Tricaine 1X prima dello screening.
2. Scartare i seguenti embrioni/xenoinnesti(figura 6A-A''):
   • senza tumore/morfologia anomala/morto,
   • con edema cardiaco e/o tuorlo,
   • con cellule tumorali solo nel tuorlo,
   • con pochissime cellule tumorali.
3. Ordina gli xenoinnesti selezionati in base alle loro dimensioni tumorali. Utilizzare la dimensione dell'occhio per il confronto (Figura 6B-B'', 6C).
   • Tumori più piccoli delle dimensioni dell'occhio (+),
   • Tumori delle stesse dimensioni dell'occhio (++),
   • Tumori più grandi delle dimensioni dell'occhio (+++).
4. Distribuire gli xenoinnesti in base al layout sperimentale desiderato e iniziare il test del farmaco (controllo vs farmaco, ecc.). Sostituire i farmaci e e3 medi giornalieri(tabella 4).
5. Incubare gli xenoinnesti mantenendo la temperatura di 34°C fino alla fine del saggio.

8. 4 giorni dopo l'iniezione

1. L'ultimo giorno del saggio, anestetizza gli xenoinnesti con soluzione di 1x Tricaine e allineali accuratamente sulla piastra di agar.
   NOTA: Scartare eventuali xenoinnesti morti o gonfi. I trattamenti farmacologici e alcune cellule tumorali possono indurre tossicità e alla fine causare mortalità da xenograft. Questi xenoinnesti non sono considerati per la quantificazione dell'innesto.
2. Per determinare la percentuale di innesto: su uno stereomicroscopio fluorescente analizzare ogni xenograft vivo e valutare l'assenza (Figura 6D) / presenza (Figura 6E) dei tumori nel PVS.
   
3. Per determinare la percentuale di metastasi: su uno stereomicroscopio fluorescente analizzare ogni xenograft e valutare la presenza/assenza di micrometastasi nel tessuto ematopoietico caudale (CHT) dei 2 gruppi precedentemente definiti (CIRC e NO CIRC, Figura 6F)
   
4. Secondo l'insieme sperimentale, selezionare gli xenoinnesti di interesse ed eutanasiarli con 25x Tricaine(Tabella 3).
5. Fissarli in formaldeide al 4% (FA) per almeno 4 ore a temperatura ambiente (RT) o durante la notte a 4 °C.
   NOTA: Utilizzare formaldeide priva di metanolo (16% FA) diluita al 4% in PBS/0,1% Tritone. Riempire i tubi verso l'alto con fissante. Posizionare i tubi orizzontalmente per garantire una fissazione omogenea di tutti gli xenoinnesti, aumentando la permeabilità e impedendo al pesce zebra di aggregarsi sul fondo.
6. In alternativa fissarli con TUBI (Per 1 mL: 100 μL di 1 M TUBI sale di sodio (4 °C); 1 μL di 1 M MgSO₄ (RT); 4 μL di 0,5 M EGTA (RT); 93,7 μL del 16% FA (RT); 801,3 μL di ddH₂O).
   NOTA: PIPES preserva la fluorescenza delle linee transgeniche RFP e mCherry meglio del 4% fa.
7. Se l'immunostaining verrà eseguito in un giorno diverso, sostituire la FA con metanolo al 100% (MetOH). Gli xenoinnesti fissati al 100% in metanolo possono essere conservati a -20 °C indefinitamente.
   NOTA: Il MetOH può compromettere l'efficienza di alcune colorazioni (cioè la filloidina) e spegnere alcune etichettatura fluorescenti. Confermare preventivamente l'efficienza degli anticorpi nei campioni fissi MetOH.

9. Immunostaining a montaggio intero per l'imaging confocale

NOTA: L'intera tecnica di immunofluorescenza del supporto richiede 3 giorni divisi come segue: Il primo giorno è per la permeabilizzazione degli xenoinnesti e l'incubazione degli anticorpi primari. Il secondo giorno per il lavaggio e l'incubazione secondaria degli anticorpi e il terzo giorno per il lavaggio, la fissazione degli xenoinnesti e la conservazione nei mezzi di montaggio.

1. Giorno 1
   1. Se gli xenoinnesti sono stati immagazzinati in MetOH al 100%, reidratarli con una serie di concentrazioni di MetOH decrescente (75%, 50%, 25% di MetOH diluite in PBS/0,1% Tritone). Se fissato in FA, sostituirlo con PBS/0,1% Tritone.
   2. Lavare 4 volte per 5 minuti in PBS/0,1% Tritone.
   3. Lavare 1x per 5 minuti in H₂O.
      NOTA: I tubi devono essere posizionati orizzontalmente sempre in fasi di fissazione, permeabilizzazione e lavaggio, salvo diversa indicazione.
   4. Sostituire l'H₂O per l'acetone ghiacciato e incubare a -20 °C per 7 minuti.
      NOTA: Posizionare un tubo da 50 ml con acetone a -20 °C in modo che sia pronto per l'uso. I tubi a microcentrifugo devono essere posizionati verticalmente su un rack in modo che l'acetone non fuoriesi.
   5. Lavare 2 volte per 10 minuti in PBS/0,1%Tritone.
   6. Incubare con una soluzione di blocco per 1 h PBDX_GS RT (tampone di blocco PBDX_GS: 50 mL di 1x PBS; 0,5 g di albumina sierice bovina - BSA; 0,5 mL di DMSO; 250 μL di Tritone al 10%; 750 μL di siero di capra - GS (15 μL/1 mL)).
   7. Rimuovere PBDX_GS e aggiungere ~40 μL di diluizione primaria degli anticorpi (generalmente 1:100).
      NOTA: Il volume della diluizione dell'anticorpo primario varia a seconda del numero di xenoinnesti presenti nel tubo di microcentrifugo. Assicurarsi che tutti gli xenoinnesti siano sommersi.
   8. Incubare per 1 ora a RT e poi a 4 °C durante la notte. Posizionare i tubi verticalmente.
2. Giorno 2
   1. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 2 volte per 10 minuti in PBS/0,1% Tritone.
   2. Lavare 4 volte per 30 minuti in PBS/0,05% Tween.
      NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti al buio (utilizzare un foglio di alluminio per proteggere i tubi dalla luce).
   3. Rimuovere PBS/0,05% Tween e aggiungere ~50-100 μL di diluizione anticorpale secondaria (generalmente 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg/mL) diluito in PBDX_GS.
   4. Incubare per 1 ora a RT e poi a 4 °C durante la notte. Posizionare i tubi verticalmente e proteggere dalla luce.
3. Giorno 3 (utilizzare un foglio di alluminio per proteggere i tubi dalla luce)
   1. Rimuovere la diluizione secondaria degli anticorpi e lavare 4 volte per 15 minuti in PBS/0,05% Tween.
   2. Fissare a temperatura ambiente per 20 minuti in FA 4%.
   3. Lavare 1x per 5 minuti in PBS/0.05% Tween.
   4. Rimuovere PBS/0,05% Tween e aggiungere 1 goccia di mezzo di montaggio acquoso a ciascun tubo di microcentrifugo. Posizionare i tubi verticalmente.
   5. Montare o conservare a 4 °C protetto dalla luce fino al montaggio. Posizionare i tubi verticalmente.

10. Montaggio di xenoinnesti

NOTA: Proteggere i tubi a microcentrifugo dalla luce durante tutto il processo. Gli xenograft Zebrafish sono montati tra 2 coverlips (24 x 60 mm # 1.5). Ciò consente di capovolgere gli xenoinnesti montati durante l'imaging confocale in modo che entrambi i lati del tumore (superiore e inferiore) siano accessibili. Non utilizzare pipette di plastica con mezzo di montaggio - gli xenoinnesti possono essere catturati nella pipetta. Vedere la figura 7 per la rappresentazione schematica dei passaggi seguenti.

1. Etichettare il coverslip Y e sigillare i bordi del coverslip X con vaselina o grasso siliconico per evitare perdite del supporto di montaggio.
2. Trasferire gli xenoinnesti con una pipetta Pasteur in vetro sul coverslip X.
3. Allinearli con cura con un tornante e rimuovere i supporti di montaggio acquosi in eccesso.
4. Aggiungere supporti di montaggio acquosi al coverslip Y.
5. Posizionare con cura il coverslip Y sopra il coverslip X. Non premere i copripacchi in quanto ciò può potenzialmente interrompere gli xenoinnesti.
6. Posizionare i copripazzo assemblati sopra uno scivolo del microscopio e fissarli con nastro adesivo trasparente. Ciò consente una manipolazione più semplice per l'imaging e l'archiviazione confocali.

11. Imaging confocale

NOTA: Una lente obiettivo ad immersione apochromatica 25x con correzione dell'acqua è ottimale per l'imaging di tumori PVS con risoluzione a singola cellula (vedi figura 8C-C" e figura 9A per esempi).

1. Acquisire campioni utilizzando la funzione z-stack con un intervallo di 5μm tra ogni fetta. Per le immagini finalizzate alla ricostruzione 3D, in particolare nei vasi, utilizzare un intervallo di 1-3μm tra le fette (Figura 8A).

12. Analisi e quantificazione

1. Utilizzare il software FIJI/ImageJ o simili per l'elaborazione e l'analisi delle immagini confocali.
2. Aprire i dati grezzi (.czi, .lsm, ecc.) nel software FIJI.
3. Per selezionare tutto o solo un singolo canale in modalità composita, fare clic su: > colori > canali .
4. Per regolare i livelli di luminosità e contrasto, fare clic su: > regolare > bilanciamento del colore.
5. Per quantificare le dimensioni del tumore
   1. Selezionare tre fette rappresentative del tumore, dall'alto, al centro e verso il basso, per z-stack per xenograft (Figura 8 A).
      NOTA: La risoluzione confocale raggiunge ~ 60-70 μm di profondità tumorale. Se il tumore è grande, potrebbe non essere possibile immagine del suo volume totale.
   2. Aprire un foglio di calcolo per annotare i dati.
   3. Contare ogni nucleo DAPI che corrisponde alle cellule tumorali nelle 3 fette selezionate (Figura 8 A, B). Per fare ciò:
      1. Aprire il plug-in del contatore di celle da FIJI/ImageJ facendo clic su Plugin > Analyze > Cell .
      2. Nello strumento contatore celle fare clic su Inizializza, selezionare un tipo di contatore e fare clic sull'immagine per avviare manualmente la modalità di conteggio. Per ogni clic, il contatore aggiunge il numero di celle conteggiate (numero di clic).
      3. Dopo aver contato una sezione completa, salvare il numero di cella nel documento di Excel corrispondente.
      4. Tornando alle Fiji, fare clic su Reimposta dalla finestra Contatore celle per eliminare le informazioni se verrà utilizzato lo stesso contatore. In caso contrario, le informazioni possono essere conservate e altri contatori possono essere utilizzati con altre sezioni (o celle).
      5. Passare alla seconda sezione rappresentativa e ripetere i passaggi precedenti. Raccogliere tutti i dati.
         NOTA: la contromaninciata DAPI è comunemente usata per contare i numeri di cella a causa della chiara definizione delle singole celle, tuttavia, è possibile utilizzare altre colorazioni specifiche della cella.
   4. Per ottenere il numero totale di cellule nel tumore utilizzare la seguente formula:
      
      NOTA: Il numero di correzione di 1,5 è stato stimato per le cellule che hanno un diametro medio del nucleo di ~ 10-12 μm. Questa correzione potrebbe richiedere una regolazione se le celle sono più grandi/più piccole. Per ulteriori dettagli su questo metodo, vedere Dicussion.
6. Per quantificare altri marcatori (cellule immunitarie, figure mitotiche, PPH3, Caspase3 attivato, Ki67, ecc.), quantificare tutte le fette utilizzando lo stesso plugin (vedere figura 8C-C'' per la visualizzazione delle figure mitotiche). Dividi il numero totale di cellule contate per la dimensione tumorale corrispondente e moltiplica per 100 per ottenere la percentuale.
   NOTA: fai attenzione che alcune celle si trovino tra due fette, vai avanti e indietro nello z-stack per assicurarti che una cella non venga conteggiata due volte.

Risultati

Lo xenograft zebrafish come strumento per studiare le terapie anti-cancro.
La linea cellulare del cancro del colon-retto HCT116 è stata etichettata con CM-DiI e iniettata nel PVS di embrioni post fecondazione (dpf) di 2 giorni. Dopo l'iniezione, gli xenoinnesti sono stati incubati a 34 °C, una temperatura che consente la crescita delle cellule tumorali senza compromettere lo sviluppo del pesce zebra. Il giorno dopo, gli xenoinnesti sono stati vengono schermati in base alla presenza o all'assenza di una massa tumorale nel PVS (i pesci zebra non correttamente iniettati sono stati scartati ed eutanasiati) (Figura 6A-A''). Gli xenoinnesti sono stati raggruppati in base alle loro dimensionitumorali (Figura 6B-B'') e distribuiti casualmente (in una piastra a 6 pozzi: ~ 12 xenografti per pozzo) in controlli non trattati e chemioterapia FOLFIRI (acido folinico 0,18 mM, Irinotecan da 0,08 mM e fluorouracil da 4,2 mM (5-FU)).

Il controllo E3 e i farmaci venivano sostituiti ogni giorno e i pesci zebra morti scartati. 4 dpi e tre giorni dopo il trattamento (dpt), l'innesto è stato quantificato come nella fase 8.2 del protocollo. L'innesto è considerato come la frequenza degli xenoinnesti che presentano una massa tumorale nel PVS a 4 dpi. Ad esempio, se alla fine dell'esperimento ci sono 40 larve vive e 35 delle 40 presentano un tumore nel PVS, il tasso di innesto è dell'87,5%. Gli xenografti sono stati eutanasiati e fissati per valutare le dimensioni del tumore e l'apoptosi mediante immunofluorescenza e microscopia confocale.

L'immunofluorescenza è stata eseguita per rilevare le cellule apoptotiche, utilizzando anticorpi Caspasi 3 anti-scissi (Asp175) (coniglio, 1:100, #CST 9661) e DAPI (50 μg/ mL) per la controsottenimento dei nuclei. I set di dati dello stack di immagini (ogni 5um) sono stati acquisiti in un microscopio confocale LSM710 e l'analisi dei dati eseguita con il software FIJI / ImageJ come spiegato nel passaggio 12. Quantificazione dell'indice mitotico, apoptosi (% della Caspasi3 attivata) e dimensione tumorale, ha rivelato che FOLFIRI induce una significativa diminuzione della mitosi (Mann Whitney Test, P<0.0001) e una significativa induzione dell'apoptosi (test mann whitney, P<0.0001), accompagnata da una riduzione del 54% delle dimensioni tumorali (P<0.001)(Figura 8C-E, Figura 9A-E) .

Queste caratteristiche sono utili negli schermi dei farmaci fenotipici ad alta produttività e per testare gli effetti intrinseci e fisiologici cellulari di diversi trattamenti oncologici in un breve lasso di tempo.

Caratterizzazione di xenografti uomo-zebrafish con anticorpi specifici per l'uomo
Come in tutti i modelli di xenograft, c'è il rischio di identificare erroneamente le cellule. Ad esempio, i macrofagi possono faragocitosi cellule tumorali umane, diventando etichettati con il colorante lipofilo, e quindi viaggiare lungo l'ospite di zebrafish e quindi, queste cellule possono essere scambiate per micrometastasi tumorale. Pertanto, l'etichettatura degli xenografti con anticorpi umani specifici come HLA umano, ki-67 o mitocondri umani (hMITO) è fondamentale per la caratterizzazione iniziale e anche per conoscere la morfologia delle cellule tumorali (Figura 9F-I).

Xenograft zebrafish per studiare le interazioni cellula-cellula.
Un altro grande vantaggio del modello di xenoinnesto zebrafish è che è possibile studiare le interazioni di diverse cellule tumorali e analizzare come ogni tipo di cellula può influenzare il comportamento dell'altra. Diverse cellule tumorali umane (cloni diversi dallo stesso tumore o da tumori diversi) possono essere co-iniettate. In questo esempio, due linee cellulari CRC derivate dallo stesso paziente sono state etichettate con coloranti lipofili diversi e mescolate in un rapporto di 1:1 per iniezione(figura 9J-K').

Quando si mescolano linee cellulari umane (per generare tumori policlonali) sullo stesso innesto, evitare di utilizzare il colorante DiO in quanto ciò si traduce in una doppia colorazione non specifica(Tabella 2). Utilizzare invece, ad esempio, CM-DiI (linea di celle#1) con CMFDA verde (riga di cella#2) o CM-DiI (linea di cella#1) con rosso intenso (linea di celle#2) (Tabella 2, Figura 9J-K'),per ottenere una facile discriminazione delle popolazioni alla fine dell'esperimento. Per quantificare la frequenza di ogni clone all'interno del tumore, utilizzare 2 diversi tipi di contatori nelle FIJI per identificare ogni clone e quindi dividere per il numero totale di cellule (somma di tutti i cloni) per ottenere la frazione relativa di ciascuno (%).

Figura 1. Riepilogo diagramma di flusso del protocollo zebrafish xenograft Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Materiali per iniezione embrionale di zebrafish: A. Ago borosilicato B. Piatto di agarosio al 2%. C Ciclo a tornante D. Passi per fare un anello a tornante: 1 . Posizionare1 capello all'interno di un tubo capillare di vetro lasciando circa 1 centimetro di capelli fuori dal tubo. 2-3. Arricciare la punta esterna dei capelli con l'aiuto di forcep nel tubo capillare di vetro formando un anello di ~ 0,5 mm di lunghezza. 4. Sigillare il bordo del tubo capillare con una goccia di smalto per unghie. 5-6. Sigillare un pezzo di nastro elettrico attorno al capillare per proteggerlo dalla rottura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Immagini stereomicroscopiche rappresentative di embrioni di zebrafish a 48 ore dalla fecondazione (48 hpf): A-A'. Morfologia normale di un embrione di zebrafish a 48 HPF di sviluppo, pronto per la microiniezione B-B'. Morfologia di un embrione zebrafish che non ha raggiunto l'adeguato stadio di sviluppo per le microiniezioni a 48 HPF e presenta già un certo grado di edema cardiaco (punta di freccia nera) e tuorlo disteso. A' e B' sono ingrandimenti rispettivamente di A e B. Le barre di scala rappresentano 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Rappresentazione schematica della piastra di microiniezione zebrafish impostata: A. Allineamento degli embrioni anestetizzati nella piastra di Agar/2% Agar al 2%. B. La commissione per l' Rappresentazione grafica di un embrione zebrafish post-fecondazione di 2 giorni, con una freccia nera che indica lo spazio perivitellino (PVS). C e D. Le cellule tumorali possono essere iniettate con diverse angolazioni nel PVS iniettato nello spazio perivitellino (PVS) di un embrione post-fecondazione di 48 ore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Saggio metastatico. 1 ora dopo iniezione (1hpi) gli embrioni iniettati vengono ordinati in base all'assenza (NO_circ) o alla presenza (CIRC) di cellule tumorali in circolazione. A 4 giorni dopo iniezione viene quantificato il numero di xenoinnesti in entrambi i gruppi che presentano micrometastasi. Le cellule del gruppo NO_circ (A) hanno dovuto sottoporsi a tutti i passaggi metastatici per poter formare una micrometastasi, mentre le cellule del gruppo CIRC (B) subiscono solo gli ultimi passaggi della cascata metastatica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Immagini rappresentative stereomicroscopiche fluorescenti di xenografti a 1 giorno dopo l'iniezione e 4 giorni dopo l'iniezione. Le cellule tumorali umane che esprimono proteine fluorescenti TdTomato (rosso) sono state microiniettate in 2 embrioni di zebrafish dpf. A 1 dpi, vengono schermati gli embrioni iniettati e scartare quelli o gli embrioni mal iniettati con un edema(A-A'') ordinare gli embrioni ben iniettati in base alle dimensioni del tumore (B-B''). C. Quantificazione rappresentativa del numero totale di cellule presenti nelle diverse categorie di dimensioni tumorali a 1 dpi negli xenografti SW620. Ogni punto rappresenta uno xenograft quantificato come spiegato nella sezione 12.At 4 dpi, scherma le larve e quantifica le diverse classi: nessun tumore (D); con tumore nel PVS (E) e con una micrometastasi nella CHT (F). Le barre di scala rappresentano 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Rappresentazione schematica del montaggio dello xenograft per l'imaging confocale. 1. Esempio di etichettatura in coverslip Y, la linea azzurra in coverslip X rappresenta il perimetro in cui viene applicato il grasso di vaselina/silicone per evitare perdite del supporto di montaggio. 2. Esempi di allineamento dello xenograft sulla coverslip X per l'imaging confocale. 3. I supporti di montaggio acquosi (freccia blu) vengono utilizzati per legare il coverslip Y sopra il coverslip X. 4. Esempio di coverlips montati correttamente. 5. Le coverlips vengono quindi posizionate sopra uno scivolo di vetro e fissate con nastro trasparente. 6. Xenograft montati pronti per l'imaging confocale. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8. Rappresentazione visiva della quantificazione dell'immagine del microscopio confocale delle dimensioni del tumore. Immagini confocali di uno xenograft HCT116 a 4 giorni dopo l'iniezione A. Serie di fette z-stack nel canale DAPI acquisite con un intervallo di 5 μm. Le linee tratteggiate rosse circondano le tre fette rappresentative utilizzate per il conteggio delle celle. B. La commissione per l' Illustrazione della quantificazione dei nuclei DAPI con il plug-in contatore di celle nel software ImageJ/Fiji. C-E. Esempio di risoluzione a singola cellula all'interno del tumore in cui è possibile visualizzare/quantificare figure mitotiche in DAPI o utilizzando un anticorpo fosfo-istone H3 (verde). D ed E sono ingrandimenti di C. Le barre di scala rappresentano 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9. Risultati rappresentativi. A-E. La linea cellulare del cancro del colon-retto HCT116 è stata etichettata con Vybrant CM-DiI e iniettata nel PVS di embrioni 2 giorni dopo la fecondazione (dpf). Dopo l'iniezione, gli xenoinnesti sono stati incubati a 34 °C. A 1 dpi, gli xenoinnesti sono stati vengono schermati e distribuiti casualmente in controlli non trattati e FOLFIRI, trattati per 3 giorni consecutivi e fissati a 4 dpi. A. L'immunofluorescenza è stata eseguita per rilevare le cellule apoptotiche, utilizzando anticorpi Caspasi 3 anti-scissi e DAPI per la controsottenimento dei nuclei. Quantificazione dell'indice mitotico C, apoptosi (% di Caspasi Attivata3) D, e dimensione tumorale E, ha rivelato che FOLFIRI induce una significativa diminuzione della mitosi (Mann Whitney Test, P<0.0001) e una significativa induzione di apoptosi (mann whitney test, P<0.0001), accompagnata da una riduzione del 54% delle dimensioni tumorali (P<0.001). Il numero di xenoinnesti analizzati è indicato nella figura e ogni punto rappresenta uno xenograft. F-H. Immagini rappresentative di xenografti di cancro del colon-retto a 4 giorni dopo l'iniezione etichettati con marcatori specifici umani in verde (HLA umano, ki67 e hMITO) nel PVS e CHT I. J-J'. Immagini confocali di xenografti policlonali, iniettati con due diverse linee cellulari tumorali colorettali umane etichettate con colorazione lipofila CellTracker Deep Red (Cy5 - bianco), CellTracker Green CMFDA (488 - verde) e dapi controcolore. K-K'. Immagini confocali di due diverse linee cellulari tumorali colorettali umane etichettate con colorazione lipofila CellTracker Deep Red (Cy5 - bianco), Vybrant CM DiI (594 - rosso) e controcolore DAPI. Le barre di scala rappresentano 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Linea cellulare

fazzoletto

specie

morfologia

Modalità di crescita

Confluenza ideale per iniezione

Agente dissociante per iniezione

Tempo di dissociazione

Protocollo per l'etichettatura

Mezzo di iniezione

Dividi il numero totale di cellule per (per ottenere la concentrazione ideale per l'iniezione)

SW480

Adenocarcinoma colorettale (primario)

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minuti

beuta

PBS 1x

0,25

SW620

Adenocarcinoma colorettale (metastasi)

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minuti

beuta

PBS 1x

0,25

HCT116

Carcinoma colorettale (primario), mutante Kras

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minuti

beuta

PBS 1x

0,25

HKE3

Carcinoma colorettale, Kras WT

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minuti

beuta

PBS 1x

0,25

HT-29

Adenocarcinoma colorettale (primario)

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 minuti

beuta

PBS 1x

0,2

CACO-2

Adenocarcinoma colorettale (primario)

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

Mezzo completo

0,25

McF-7

Adenocarcinoma mammario (metastasi)

Umano

epiteliale

aderente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

60% FBS + 40% mezzo completo

0,5

Hs578T

Carcinoma mammario (primario)

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

2 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

60% FBS + 40% mezzo completo

0,5

MDA-MB-468

Adenocarcinoma mammario (metastasi)

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

8 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

60% FBS + 40% mezzo completo

0,5

MDA-MB-231

Adenocarcinoma mammario (metastasi)

Umano

epiteliale

aderente

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

Mezzo completo

0,5

RT112

Carcinoma cellulare transitorio della vescica urinaria (primario)

Umano

epiteliale

aderente

85% - 90%

TripLE

6 minuti + rottamatore di celle

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

Mezzo completo

0,5

BFTC905

Carcinoma cellulare transitorio della vescica urinaria (primario)

Umano

epiteliale

aderente

75% - 85%

TripLE

10 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

80% mezzo completo + 20% PBS/EDTA 2 mM

0,5

J82

Carcinoma cellulare transitorio della vescica urinaria (primario)

Umano

epiteliale

aderente

85% - 90%

TripLE

10 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

Mezzo completo

0,5

Rt4

Carcinoma cellulare transitorio della vescica urinaria (primario)

Umano

epiteliale

aderente

85% - 90%

TripLE

6 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

Mezzo completo

0,5

MIA PaCa-2

Carcinoma epiteliod pancreatico (primario)

Umano

epiteliale

aderente

80% - 90%

TripLE

3 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

60% FBS + 40% mezzo completo

0,5

PANC-1

Carcinoma epiteliod pancreatico (primario)

Umano

epiteliale

aderente

80%

TripLE

5 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

PBS/EDTA 2mM

0,5

Vc8

Fibroblasti polmonari, mutante BRCA2, carente di risorse umane

Criceto cinese

epiteliale

aderente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

Mezzo completo

0,25

Vc8-B2

Fibroblasti polmonari, umani BRCA2, BRCA2 −/− CARENTI DI RISORSE UMANE

Criceto cinese

epiteliale

aderente

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 minuti

Tubo microcentrifugo da 1,5 ml

Mezzo completo

0,25

Tabella 1: Confluenza ottimale in vitro per l'iniezione di diverse linee cellulari

Colorante cellulare

Numero di catalogo

Spettro di fluorescenza (Esc. - Em.)

Diluizione delle scorte

Diluizione di lavoro per macchiare in un pallone

Diluizione di lavoro per macchiare in un microcentrifugo da 1,5 mL

Tempo di incubazione

Osservazioni

Vybrant CM-DiI

V22888

549 nm - 569 nm

Già diluito

4:1000 in PBS 1x

4:1000 in PBS 1x

15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC

Vybrant DiO

V22886

484 nm - 501 nm

Già diluito

5:1000 in PBS 1x

5:1000 in PBS 1x

15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC

Risoluzione non buona nell'imaging confocale a 4 giorni dopo l'iniezione

CellTracker Rosso Profondo

C34565

630 nm - 660 nm

1 mM in DMSO

0,5 - 2,5 μM in PBS 1x

0,5 - 2,5 μM in PBS 1x

15 min @ 37 ºC

CellTracker Green CMFDA

C7025

492 nm - 517 nm

10 mM in DMSO

0,5 - 2,5 μM in PBS 1x

0,5 - 2,5 μM in PBS 1x

15 min @ 37 ºC

Perdite di prodotto nella cavità addominale 48 ore dopo l'iniezione, ma ideale per studi di co-iniezione

Tabella 2: Colorante e condizioni

grandezza	# di larve	Volume medio E3 1x
100 mm x 15 mm (standard)	Fino a 50	20-25 mL
60 mm x 15 mm	Fino a 20	10 mL
Piastra a 6 pozzi	Fino a 15 per pozzo	3-4 mL per pozzo

Tabella 3: Opzioni della piastra di Petri

E3 medio 50x - magazzino	Per 10 litri di acqua sterile:
	146,9 g di NaCl
	6,3 g di KCl
	24,3 g di CaCl2·2H2O
	40,7 g di MgSO4·7H2O
E3 medio 1x - pronto all'uso	400 mL di E3 medio 50x
	60 mL di soluzione blu di metilene 0,01%
	Riempire fino a 20 litri di acqua del sistema ittico
Tricaine 25x - stock ed eutanasia	2 g di polvere di Tricaina
	500 mL di acqua osmosi inversa
	10 mL di 1 M Tris (pH 9)
	Regolare a pH 7
Tricaina 1x - Anestesia	20 mL di Tricaine 25x
	Riempire fino a 500 mL di acqua di sistema
60 mg/mL Pronasi - stock 100x	1 g di pronasi
	16,7 mL di acqua sterile
0,6 mg/mL Pronasi - 1x pronto all'uso	100 μL pronasi 100x
	9,9 mL di E3 medio 1x

Tabella 4: Composizioni delle soluzioni

Discussione

La crescente importanza del pesce zebra come modello per lo sviluppo del cancro e lo screening farmacologico ha portato a numerose^{pubblicazioni 3,4,7,13,14,16,18,19,20,21.} Tuttavia, l'iniezione di cellule tumorali negli embrioni di zebrafish è una tecnica che richiede un alto livello di destrezza che può essere impegnativo per i ricercatori. In questo protocollo miriamo a fornire informazioni pratiche e alcuni suggerimenti che possono aiutare a superare le sfide iniziali della creazione di xenografti embrionale zebrafish.

Manipolazione cellulare prima dell'iniezione
Questo protocollo ottimizzato per la generazione di xenografti zebrafish con linee cellulari può essere adattato a vari tipi di cellule (tumorali) con morfologie diverse. Si consiglia che tutte le linee cellulari utilizzate per gli xenografti zebrafish siano senza micoplasma. A differenza di altre contaminazioni batteriche, la presenza di micoplasma nella coltura cellulare non genera cambiamenti che possono essere facilmente rilevati al^{microscopio 22}. La contaminazione da micoplasma può influenzare il potenziale di innesto delle linee cellulari, la loro sensibilità ai farmaci e la vitalità degli embrioni di zebrafish.

Sebbene le cellule possano continuare a proliferare per un periodo prolungato, il loro fenotipo e genotipo può essere soggetto a cambiamenti. È importante familiarizzare con la morfologia e il comportamento delle linee cellulari in coltura. Si consiglia di mantenere il numero di passaggi cellulari dopo lo scongelamento tra 3-12 per ottenere risultati riproducibili. Pertanto, devono essere eseguiti regolari test del micoplasma.

Le cellule devono essere nella fase di log (fase di crescita esponenziale prima di raggiungere la confluenza ~70%) il giorno dell'iniezione. Ciò consentirà un adeguato innesto e un corretto sviluppo dei tratti distintivi del tumore. Per prevenire variazioni nel fenotipo delle cellule all'interno dello xenograft, è fondamentale mantenere la confluenza per la costante di iniezione tra gli esperimenti. Il numero di cellule iniettate può essere adattato alle caratteristiche di ogni linea cellulare in quanto alcune possono richiedere densità di iniezione più elevate per prosperare negli embrioni di zebrafish.

Considerazioni sull'etichettatura delle celle
Per visualizzare meglio le cellule tumorali umane per l'iniezione e l'analisi futura, le cellule tumorali possono essere etichettate con coloranti fluorescenti. A causa delle differenze nelle dimensioni cellulari, il numero totale di cellule /cm^{2 nelle colture} aderenti varia tra le linee cellulari. Ciò influirà sull'efficacia del protocollo di colorazione e sul numero di cellule raccolte per iniezione. Le celle di grandi dimensioni che producono numeri bassi per pallone (cioè Hs578T) o crescono in cluster (ad esempio, BFTC905) richiederanno la messa in comune di diversi contenitori per un singolo esperimento. In questo caso, la colorazione delle cellule non dovrebbe essere eseguita direttamente nel pallone in quanto ciò causerà l'uso di quantità eccessive di colorante (costo elevato). D'altra parte, le cellule altamente sensibili ai cicli eccessivi di centrifugazione e quelle che producono numeri elevati per pallone (cioè HCT116) possono essere macchiate direttamente nel pallone e quindi staccate con EDTA /raschietto a celle (per ulteriori informazioni vedere tabella 1).

Quando possibile, invece di utilizzare un approccio enzimatico, utilizzare EDTA per staccare le cellule il giorno dell'iniezione, in modo che le cellule recuperino più rapidamente le loro giunzioni cellulare-cellulari e siano sottoposte a passaggi meno centrifugati. Tuttavia, se le cellule sono sensibili all'EDTA, molto aderenti o crescono in cluster - può essere applicato un metodo enzimatico. L'ottimizzazione della concentrazione ideale per iniezione e del mezzo di iniezione dipende dalle caratteristiche di ciascuna linea cellulare, per cui potrebbe essere necessario alcuni aggiustamenti(tabella 1).

Calibrazione della microiniezione
Contrariamente alla consegna di oligonucleotidi o farmaci nell'embrione zebrafish, un graticule non viene utilizzato per calibrare l'ago quando si lavora con linee cellulari per xenografti. Dopo un po 'di tempo durante l'iniezione, le cellule inizieranno a intasarsi ed è necessario tagliare la punta dell'ago per aumentarne il diametro o cambiare del tutto l'ago. Questa procedura ostacola la calibrazione del graticolato.

Per risolvere questo problema, il numero di cellule erose è regolato dalla pressione di espulsione e dal tempo necessario per raggiungere una dimensione simile all'occhio dell'embrione entro 1-3 impulsi. Quindi, per controllare ulteriormente la dimensione del tumore, a 1 dpi, gli xenoinnesti vengono ordinati in base alla dimensione tumorale come mostrato nella figura 6 B-B". Come rappresentato nell'esempio della figura 6C, questo metodo di ordinamento è efficiente nel ridurre la variazione delle dimensioni del tumore: se le uniamo tutte insieme (+, ++, +++) la STEV è ~double della classe ++(~906 cellule a ~422 cellule) e la variazione del coefficiente è di ~31,9% rispetto al 14,5% della classe ++. Poiché il riferimento per l'iniezione è il volume, il numero totale di cellule varia molto tra i tipi di cella, dipendendo dalle dimensioni e dalla forma delle cellule. Ad esempio, le grandi cellule con un sacco di citoplasma come il cancro al seno Hs578T, producono tumori molto più piccoli (~ 600 cellule). Inoltre, ogni riga di cella richiede un numero diverso di celle. Ad esempio, le linee cellulari di cellule tumorali della vescica urinaria HT29 CRC e RT112 hanno dimostrato che maggiore è il numero di cellule iniettate, maggiore è la mortalità dei pesci zebra. Pertanto, è necessario un periodo di ottimizzazione durante lo sviluppo degli xenoinnesti per verificare se la linea cellulare ha effetti tossici nell'embrione o richiede densità di iniezione più elevate / inferiori.

Sito di iniezione
Una delle discrepanze più comuni quando si generano xenografti di embrioni di zebrafish è il sito di iniezione. Il tuorlo è di solito il luogo di scelta per l'iniezione grazie alla sua facile accessibilità. Tuttavia, abbiamo osservato che le cellule iniettate nel tuorlo hanno una maggiore tendenza a morire. Anche se tecnicamente più difficile, si consiglia di iniettare nel PVS e il più lontano possibile dal cuore. All'interno del PVS, le cellule possono aggregare, reclutare vasi e cellule immunitarie e migrare, intravascolarizzare, estrapolare e formare micrometastasi, se mostrano caratteristiche metastatiche^8,11.

Efficienza di innesto
Le differenze nell'efficienza di innesto e nella dimensione del tumore tra le linee cellulari a 4 dpi sono previste a causa dei loro distinti gradi di morte /sopravvivenza / proliferazione delle cellule basali, ma anche a causa dell'immunogenicità innata che ogni linea cellulare può^{mostrare 9}.

metastasi
La metastasi comprende una cascata multistep di eventi che possono essere divisi in due stadi arbitrari. Nella prima fase, le cellule tumorali devono staccarsi dal sito primario, migrare e invadere i tessuti adiacenti e poi intravascolarizzarsi nel flusso sanguigno. Nel secondo stadio, le cellule tumorali devono sopravvivere in circolazione, estrapolare dal sangue o dai vasi linfatici e infine colonizzare nei siti secondari²³. Per distinguere tra questi eventi precominali e tardive e affrontare il potenziale / competenza delle diverse cellule tumorali per eseguire questi passaggi, abbiamo progettato un semplice test.

In generale, quando iniettate nel PVS, le cellule tumorali possono entrare direttamente in circolazione e quindi rimanere fisicamente intrappolate nel tessuto ematopoietico caudale (CHT) (regione della coda). Tuttavia, in base alle caratteristiche di ogni cellula tumorale - abbiamo visto che alcune cellule tumorali rimangono al CHT 4 dpi e sono in grado di formare micrometastasi mentre altre cellule tumorali scompaiono (cancellate dopo essere state catturate nella CHT).

Pertanto, confrontando l'efficienza della micrometastasi (a 4 dpi) quando le cellule sono state poste direttamente in circolazione - CIRC (le cellule devono solo passare attraverso i passaggi tardivi della metastasi) rispetto a quando no - NO CIRC (le cellule devono passare attraverso passaggi precoci e tardivi per essere in grado di formare una micrometastasi) possiamo valutare il loro potenziale metastatico precoce o tardivo. Abbiamo osservato cellule tumorali che possono formare efficacemente micrometastasi nella CHT in entrambi i gruppi (CIRC e NO CIRC), suggerendo che queste cellule hanno la capacità di subire tutti i passaggi della cascata metastatica (SW480 e MDA-MB-468 per esempio)^8,11. Al contrario, altre cellule tumorali hanno un potenziale metastatico molto basso in entrambi i gruppi, quasi mai facendo micrometastasi, anche se iniettate in circolazione (cioè, visibili nella CHT a 24 hpi, ma a 4 dpi non ci sono più, Hs578T per^{esempio) 8}. Tuttavia, abbiamo chiaramente trovato un altro gruppo - uno che è in grado di formare micrometastasi solo quando iniettato in circolazione (possiamo osservare solo la micrometastasi nel gruppo CIRC). Ciò suggerisce che queste cellule hanno una bassa efficienza nell'eseguire i primi passi della cascata metastatica ma d'altra parte sono in grado di sopravvivere in circolazione, estrapolare e colonizzare un sito lontano.

Immunostaining e imaging
Prima della fissazione, questo protocollo di iniezione può essere utilizzato per altri approcci di imaging dal vivo come microscopia DIC (Live Differential Interference Contrast), microscopia a disco rotante, imaging confocale vivo ad alta risoluzione e microscopia a fogli luminosi, ecc.

Le cellule morte e i detriti cellulari appaiono luminosi se osservati attraverso lo stereomicroscopio fluorescente e possono essere scambiati per cellule vive, specialmente se lo scopo dello studio è valutare il potenziale metastatico delle linee cellulari. Vorremmo sottolineare l'importanza di eseguire l'imaging confocale con specifici marcatori di vitalità e DAPI per valutare lo stato di sopravvivenza del tumore e della micrometastasi. Inoltre, è fondamentale utilizzare anticorpi umani specifici per rilevare cellule umane come i mitocondri anti-umani o l'HLA anti-umano. Quando si implementa il protocollo, addestrare gli occhi dello sperimentatore confrontando la colorazione nello stereomicroscopio con le immagini confocali. Dopo un po 'di tempo, gli sperimentatori possono distinguere chiaramente i detriti dalle cellule vive nello stereomicroscopio fluorescente.

Sebbene altri metodi per quantificare il carico tumorale come l'intera area di fluorescenza siano ampiamente utilizzati, si consiglia di eseguire l'immunostaining a montaggio intero e l'imaging confocale come metodo più accurato. Non solo l'efficienza della colorazione dei coloranti lipofili è molto variabile (cioè, alcune cellule sono molto ben macchiate mentre altre non sono - probabilmente a causa del contenuto lipidico delle loro membrane), ma anche molte volte i coloranti lipofili formano aggregati e le cellule morte tendono ad essere più luminose - creando diversi artefatti che possono essere scambiati per cellule vive.

Le cellule possono essere trasdotto con proteine fluorescenti per aiutare nel loro tracciamento e saltare l'etichettatura cellulare. Tuttavia, assicurarsi che le cellule trasdutte e non trasdutte producano gli stessi risultati negli xenografti zebrafish.

Inoltre, i macrofagi possono fagocitare questi detriti cellulari fluorescenti diventando marcati fluorescentmente e migrano, generando false cellule metastatiche positive. Pertanto, raccomandiamo una serie di strumenti analitici, che ovviamente possono essere estesi a molte altre letture per un'interpretazione più accurata del comportamento tumorale:

• Proliferazione - quantificazione di figure mitotiche con anticorpo DAPI o anti-pHH3^Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),
• Morte cellulare per apoptosi- Anticorpo antiattiva Caspase3^Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) o equivalente,
• Dimensione tumorale - Conteggio DAPI - le cellule tumorali umane mostrano un'organizzazione cromatica molto distinta, quindi si distinguono facilmente dalle cellule zebrafish ed è sempre possibile ricontrollare con il colorante (quando si allena l'occhio),
• Per studi metastatici- per rilevare inequivocabilmente le cellule umane, - HLA anti-umano (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), mitocondri anti-umani (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).

Per un'acquisizione confocale con intervallo di 5 μm tra fette nella pila Z delle cellule tumorali di controllo HCT116 (dimensione nucleare media di 10-12 μm di diametro) con controsottenimento DAPI, abbiamo osservato che ~50% delle cellule sono condivise tra due fette consecutive. Pertanto, se ogni fetta viene conteggiata, c'è un alto rischio di contare le stesse celle due volte. Andare avanti e indietro tra una sezione e l'altra per evitare problemi di quantificazione si traduce in una tecnica che richiede tempo e soggetta a errori. Per facilitare la quantificazione del numero totale di cellule e consentire una maggiore riproducibilità tra i ricercatori, abbiamo creato la formula delle dimensioni tumorali precedentemente descritta in questo protocollo⁸.

Abbiamo incluso un numero di correzione (1.5) per tenere conto delle celle ~50% condivise tra le sezioni. Abbiamo scoperto che l'errore medio del conteggio manuale dell'intero tumore tra i ricercatori era del 20%. Due ricercatori che hanno usato la formula hanno avuto un errore del 2%. L'uso di questa formula ha un tasso di precisione del 93% e un tasso di riproducibilità del 98%. Abbiamo anche testato metodi automatizzati, ma hanno dimostrato un errore superiore al 50% causato dalle impostazioni di soglia.

A causa delle caratteristiche delle cellule apoptotiche, la quantificazione delle cellule Caspasi 3 attivate è più difficile. Per ridurre il numero di errori e variazioni nei risultati, si consiglia di contare il controllo e i campioni sperimentali dallo stesso ricercatore. Inoltre, quando si impara questa tecnica, un nuovo ricercatore deve contare immagini che erano già state quantificate da ricercatori più esperti per confrontare i risultati e allenarsi.

La lunghezza del saggio può essere estesa se necessario. Tuttavia, è importante considerare che le larve di zebrafish richiedono un'alimentazione viva a partire da ~ 7 giorni dopo la fecondazione (5 giorni dopo l'iniezione). Inoltre, le linee guida e i regolamenti sul benessere degli animali applicati alle larve di età superiore a 6 giorni dopo la fecondazione possono variare.

Questo protocollo fornisce strumenti utili per consentire a un singolo ricercatore di iniettare circa ~ 200-300 larve di zebrafish all'ora; e i risultati per il saggio completo, compresa l'analisi e l'interpretazione statistica, ottenuti in tre settimane. Speriamo che questo protocollo possa aiutare i ricercatori a diventare esperti nella generazione di xenografti zebrafish. Non è facile; devi esercitarti ma ci arrivarai. Buona Fortuna!

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar for bacteriology	VWR	97064-336	Agar plate
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)	Cell Signalling Technologies	9661	Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti-human HLA (Rabbit monoclonal)	Abcam EP1395Y	ab52922	Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti- 488 (Rabbit monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35552	Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
anti- 594 (Rabbit monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35560	Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
CellTracker Deep Red Dye	ThermoFisher Scientific	C34565	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
CellTracker Green CMFDA Dye	ThermoFisher Scientific	C2925	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Conical Centrifuge tube 50mL	VWR	525-0610
Conical Centrifuge tube 15mL	VWR	525-0604
DAPI			Nuclear and chromosome counterstain
Laser-Based Micropipette Puller P-2000	Sutter-Instrument		Micropipette Puller
Microcentrifuge tube 1.5mL	Abdos	P10202
Microscope slides, cut edge	RS France	BPB016	Slides for mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Mounting medium
Pneumatic Picopump	World Precision Instruments	PV820	Microinjector
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	ThermoFisher Scientific	631-9430	Coverslips for mounting
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004	Agar plate
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100-4	Borosilicate capillaries
TrypLE	Gibco	12605036	Enzymatic detachment solution
Vaseline			Petroleum jelly for slide sealing
Vybrant CM-DiI Dye	ThermoFisher Scientific	V22888	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	ThermoFisher Scientific	V22886	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology	ZEISS		Fluorescence Stereo Zoom Microscope
Zeiss LSM 710	ZEISS		Confocal microscope