Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Özet

Burada, ksnograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelemesi için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Özet

Zebra balığı larva ksinograftları, insan kanserinin in vivo ve gerçek zamanlı çalışmalarını gerçekleştirmek için kanser araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Anti-kanser tedavilerine (kemoterapi, radyoterapi ve biyolojikler), anjiogenez ve metastazlara yanıtı tek hücre çözünürlüğü ile hızla görselleştirme olasılığı, zebra balığı ksinograft modelini preklinik çalışmalar geliştirmek için en iyi seçim olarak yerleştirir.

Zebra balığı larva xenograft testi, diğer modellere kıyasla birkaç deneysel avantaj sunar, ancak muhtemelen en çarpıcı olanı boyut ölçeğinin ve dolayısıyla zamanın azaltılmasıdır. Ölçeğin bu şekilde azaltılması, tek hücreli görüntülemeye, nispeten düşük sayıda insan hücresinin (biyopsilerle uyumlu), orta-yüksek verimli ilaç taramalarına izin verir, ancak en önemlisi tahlil süresinin önemli ölçüde azaltılmasını sağlar. Tüm bu avantajlar zebra balığı xenograft testini gelecekteki kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için son derece çekici hale getirir.

Çok çeşitli insan tümörleri ile birçok zebra balığı ksinograft protokolü geliştirilmiştir; bununla birlikte, zebra balığı larva ksinograftlarını verimli bir şekilde üretmek için genel ve standartlaştırılmış bir protokol hala eksiktir. Burada, ksinograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelleştirme için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio), gelişimi ve hastalığı incelemek için güçlü bir omurgalı model organizma olarak ortaya çıkıyor. Zebra balığı, yüksek oranda korunmuş genetiği (~%70 genetik homoloji ve ~%84 hastalıkla ilişkili genler) ve temel organ morfolojik özelliklerini insanlarla paylaşır^1,2. Bu koruma, zebra balıklarının kanser³,⁴de dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarını modellemek için^{kullanılmasına}izin verir.

Zebra balıklarının kullanımı ve bakımı, küçük boyutları, tüm yıl boyunca yüksek doğurganlıkları ve dış gübreleme^3,5nedeniyle farelerden çok daha kolay ve daha uygun maliyetlidir. Zebra balığı embriyoları, yaşamlarının ilk 5-7 günü boyunca canlı beslenme gerektirmez ve gelişim, enfeksiyon ve kanser¹, 4^,6,7için etkili bir model olarak kullanılmıştır. Zebra balığı embriyoları döllenme sonrası 48 saatte yumurtadan çıkar (hpf) ve tüm organları oluşmuş, atan bir kalp ve fonksiyonel dolaşım sistemi, karaciğer, beyin, böbrek iliği^vb. Ayrıca, gelişimin bu aşamasında sadece doğuştan gelen bağışıklık oyundadır, adaptif bağışıklık hala gelişmektedir, bu da bağışıklık sistemi baskılanmış mutantların kullanımına gerek kalmadan insan hücrelerinin genel olarak verimli bir şekilde kaplanmasına izin verir^7,8. Bununla birlikte, tüm insan hücrelerinin eşit olarak^9grafya etmediğini ve örneğin lösemi hücreleri için, verimli engraftasyon için fagositlerin (nötrofiller ve makrofajlar) tükenmesi gerektiğinin gösterildiğini belirtmek önemlidir¹⁰.

Zebra balığı genetik çekiş kabiliyeti ve erken embriyonik aşamalarının optik şeffaflığı, tek hücreli intravital görüntülemenin yüksek çözünürlükte ve böylece çeşitli biyoloji alanlarında son teknoloji görüntüleme tekniklerinin oluşturulmasına izin verir. Ayrıca, kanser bağlamında, bu özellikler anjiyojenik ve metastatik potansiyeli incelemek gibi konak tümör etkileşimlerinin en erken aşamalarının gerçek zamanlı çalışmaları ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile etkileşimler için yararlıdır 8^,9,11,12,13.

Kısa ksenograft tahlilinde metastatik "evrim" için zaman olmamasına rağmen- tümör hücrelerinin metastatik kapasitesini analiz etmek mümkündür (yani, invazyon, intravazasyon, dolaşımda sağkalım, ekstravazasyon ve kolonizasyon gibi metastatik adımlardan geçme verimlilikleri ve bu nedenle bu süreçleri vivo ve gerçek zamanlı olarak incelemek^8,11,13,14).

Yaşam döngüsünün özellikleri zebra balığını kanserde kişiselleştirilmiş tıp için benzersiz bir model olarak yerleştirir. Tahliller daha kısa bir zaman aralığında yapılabilir ve birkaç hafta içinde elde edilen sonuçlar^7,8,9^,11,12,15,16. Bu tahlillerin kerevizi ve fizibilitesi, doktorlara ve araştırmacılara, zamanın önemli bir ihtiyaç olduğu kanser hastaları için yararlı olabilecek çevirisel sonuçlar elde etme imkanı sağlar.

Başarılı zebra balığı embriyo ksinograftları üretme girişimlerine rağmen, enjeksiyon prosedürünün standartlaştırılmasının yanı sıra enjeksiyon sonrası hücre canlılığının ve tümör davranışının değerlendirilmesinde hala ihtiyaç vardır.

Bu protokolde araştırmacılara zebra balığı embriyolarına insan kanseri hücre çizgilerinin enjeksiyonu ve daha sonra tümör hücre davranışının sabitlenmesi, immünostaining, görüntüleme ve nicelleştirilmesi için açık ve ayrıntılı bir adım adım kılavuz sunuyoruz.

Protokol

Zebra balığı(Danio rerio)modeli, Avrupa Hayvan Refahı Mevzuatı, Direktifi 2010/63/AB (Avrupa Komisyonu, 2016) ve Champalimaud Balık Platformu'nun standart protokollerine göre ele alındı ve sürdürüldü. Tüm protokoller Champalimaud Hayvan Etik Komitesi ve Portekizli kurumsal kuruluşlar-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Hayvan/Hayvan Refahı ve Etik Organı) ve DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Gıda ve Veterinerlik Genel Müdürlüğü) tarafından onaylandı.

NOT: Ana deneye başlamadan önce, insan kolorektal kanser (CRC) hücre hattı HCT116 ile pratik yapın. Bu hücre hattının hazırlanması kolaydır (son derece proliferatif), enjekte etmesi kolaydır ve çok verimli bir şekilde (%95-100 civarında) engrafittir. Fazla hücrelerle başlayın (~12x10⁶ hücre, T-75 şişesi) ve fazla balık (400 balık) teknikte yetkin hale gelene kadar, çünkü eğitim sırasında birçok hücre ve balık kaybolacaktır. HCT116 kinograftlarda ~%95'lik bir alan elde edildikten sonra deneyciler hazırdır. Tam iletişim kuralının şeması için Şekil 1'e bakın.

1. Enjeksiyon için ayarlama

1. Enjeksiyondan iki hafta önce, kültürdeki hücreleri genişletin (birkaç hücre hattının enjeksiyonu için en uygun in vitro birleştiği ayrıntılı bir kılavuz için Tablo 1'e bakın).
2. Enjeksiyondan üç gün önce, istenen arka planın zebra balıklarını geçin.

2. Enjeksiyondan önce 24 saat

1. Zebra balığı embriyo plakalarını temizleyin (tüm ölü ve gelişmemiş embriyoları atın) ve E3 ortamını yenileyin.
2. Hücre kültürü odasında, enjeksiyon için planlanan şişelerden hücre kültürü ortamını atın, ölü hücreleri çıkarmak ve taze ortam eklemek için 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın.
3. Enjeksiyon prosedürü için araçları hazırlayın, örneğin: mikroenjeksiyon iğneleri, agarose plakaları ve saç tokaları enjeksiyon için embriyoları hizalamak için(Şekil 2A-D, aşağıda ayrıntılı olarak verilmiştir).
   1. Mikroenjeksiyon iğneleri (Şekil 2A)
      1. Borosilikat cam kılcal damarları kullanın (4 inç, OD 1.0 mm, Mikropipette çekmede Filament yok (ısı: ≈500; fil: 10; vel: 50; ara: 60; çekme: 100).
   2. Plaka hazırlama (Şekil 2B)
      1. H 2 O'da%₂agarose hazırlayın, ısıtın ve temiz bir Petri kabının kapağına bir kat çözünmüş agarose dökün. Polimerize olmasına izin verin ve bir cetvel yardımıyla embriyoların hizalanması için üç ila dört düz agarose çizgisi yapın.
   3. Saç tokası montajı (Şekil 2C-D)
      1. 1 saçı, tüpün dışında yaklaşık 1 santimetre saç bırakarak cam bir kılcal borunun içine yerleştirin.
      2. Saçın dış ucunu forseps yardımıyla cam kılcal boruya kıvırın ve ~0,5 mm uzunluğunda bir döngü oluşturun.
      3. Kılcal borunun kenarını bir damla oje ile kapatın. Bu aynı zamanda döngüyü yerinde düzeltmeye yardımcı olacaktır. Bırakın kurusun. Prosedürü tüpün diğer kenarında tekrarlayın.
      4. Bir parça elektrik bandı kesin (normal yapışkan banttan daha dayanıklı, geçirimsiz ve sert).
      5. Kırılmasını korumak için bandı kılcal damarın etrafına kapatın.

3. Enjeksiyon günü

1. Yumurtadan çıkan embriyoları unhatched yumurtalardan ayırın. Bu aşamada embriyo ortamına 1x pronaz (0.6 mg/mL, Tablo 3)eklenmesi kuluçkayı artırabilir. Embriyoları enjeksiyona kadar inkübatöre (28 °C'de) yerleştirin.
   NOT: Enzim yumurtadan çıkan embriyolara etki ederek mortalite riskini arttıracağından, embriyoları pronaz çözeltisinde 1 saatten uzun süre bırakmayın. Ödem ve mortalite riskini önlemek için embriyoların gelişim aşamasının 48 hpf'ye(Şekil 3A, A') karşılık gelen aşama olduğundan emin olun.
2. 1x Tricaine hazırlayın (25x stoktan).
   NOT: Ayrıntılı bir tarif Tablo 3'te ve Zebra Balığı Bilgi Ağı ' nda bulunabilir - ZFIN web sayfası¹⁷.

4. Enjeksiyon için hücre etiketleme

NOT: Hücrelerin etiketlenmesi, enzimatik ayırmadan sonra doğrudan bir şişede veya 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde gerçekleştirilebilir. Daha fazla bilgi için Bkz. Tartışma.

1. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve şişeyi 1X PBS ile iki kez (2x) yıkayın.
2. Hücreleri doğrudan şişede (2 mL çözelti/T75 şişesi) veya enzimatik deklarjden sonra 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde tercih ettiği bir lipofilik boya ile etiketleyin. 37 °C'de ışığa maruz kalmaktan kaçının ve hücreleri kuluçkaya yatırın (koşullar/çözümler için Tablo 1 ve Tablo 2'ye bakın).
3. Şişede etiketleme varsa
   1. Boyayı çıkarın, 1x PBS ile yıkayın ve hücreleri EDTA ve bir hücre kazıyıcı ile ayırın.
   2. Hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından 4.5 adımına geçin.
4. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde etiketleme varsa:
   1. Boyayı çıkarmak ve üst yapıyı atmak için 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Yıkamak için 1x PBS'de yeniden dirildi.
   2. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve ardından 4,5 adıma geçin.
5. Süpernatant atın ve peletin hücre kültürü ortamı ile yeniden ıslatır (50 μL pelet için ~ 150-200 μL orta ekleyin).
6. Trypan mavi dışlama veya başka bir tercih yöntemi ile bir Neubauer odası kullanarak hücre canlılığını ölçün.
7. 300 x g'da 4 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Enjeksiyon ortamındaki hücreleri yeniden biriktirin.
   NOT: Önerilen hücre konsantrasyonu (genel olarak 0,25-0,5x10⁶ hücre/μL)'den itibaren Tablo 1'debulunabilir.
8. Bu noktadan sonra hücreleri buzda tutun.

5. Enjeksiyon prosedürü

1. Embriyoları 1x Trikain içinde 5 dakika uyuşturun.
2. Plastik bir Pasteur pipetle, az miktarda (~50) uyuşturuldu embriyoyu agarose plakasına aktarın ve bir saç tokası döngüsü yardımıyla dikkatlice hizalayın. Embriyolar arasında, özellikle birinin sarısı ile bir sonrakinin başı arasında mesafeyi koruduğunuzdan emin olun (Şekil 4A).
   NOT: Hizalanacak embriyo sayısı, enjeksiyonları gerçekleştiren araştırmacının uzmanlık seviyesine göre değişecektir. Birkaç (~10-20) ile başlayın. Embriyoların agar/agarose plakadaki doğru konumlandırılmasının şeması için bkz.
3. Plakaya dikkatlice 1-3 damla 1x Trikain çözeltisi ekleyerek, hizalanmış embriyoların mortaliteyi önlemek için agarose plakasında kurumamasını sağlayın.
4. Hücreleri yeniden çıkarmak için mikrosantrifüj tüpüne hafifçe dokunun. Enjeksiyon iğnesini, embriyoların bütünlüğünü tehlikeye atabilecekleri için hava kabarcıklarından kaçınan bir mikro doldurucu ucu kullanarak hücre süspansiyonu ile geri yükleyin.
5. Hava basıncı vanasını (40 psi) açın, mikroenjektörü kurun ve mikroenjeksiyon iğnesini dikkatlice tutucuya yerleştirin.
   NOT: Aşağıdaki önerilen mikroenjektör ayarlarını kullanın: Basıncı tutun - havalandırma (3 psi); Basınç dışarı atma - havalandırma; Menzil - 100 ms.
6. Mikroenjeksiyon iğnesini stereomikroskop altında dumont #5 veya benzeri bir şekilde ucuna yakın kesin.
   NOT: Uç, hücrelerin tıkanmadan geçmesine izin vermek ve embriyolara zarar vermemek ve hücreleri kaybetmemek için yeterince kör ve ince olmalıdır. Kalın bir mikroenjeksiyon iğne ucu embriyoya yarayacak ve ödem veya zebra balığı ölümünün oluşumunu teşvik edecektir. Graticule iğne kalibrasyonu için kullanılmaz. Ayrıntılı bir açıklama için Tartışma'ya bakın.
7. Embriyoları enjekte etmeden önce, en düşük fırlatma basıncından başlayarak mikroenjektör basıncını, zebra balığı embriyosunun gözünün büyüklüğüne benzer bir hacim elde edilene kadar ~1-3 darbeye kadar test edin.
   NOT: Eğitimin başında mümkün olduğunca floresan stereomikroskop kullanılması önerilir. Bu, floresan etiketli hücrelerin daha kolay tanımlanmasına izin verecektir.
8. Embriyonun sarısının ortasında dikkatlice delin, iğnenin açısını düşürün ve iğnenin ucu perivitellin uzayına (PVS) ulaşana kadar dikkatlice itin (Şekil 4B-D).
9. Mikroenjektör pedalına basın ve hücreleri PVS'ye enjekte edin. Embriyonun gözünü rehber olarak kullanın. Kardiyak ödemi önlemek için embriyonun gözünün büyüklüğüne ve kalpten mümkün olduğunca uzak bir hücre hacmi enjekte etmeye çalışın.
10. İğneyi dikkatlice çıkarın ve bir sonraki embriyoya geçin.
11. Gerekirse mikroenjektör basıncını ayarlayın.
    NOT: Hücreler tıkanmaya başlar, bu nedenle basınç artabilir. Gerekirse, basıncı azaltırken kılcal damarı kesmek (çapı artırmak için) mümkündür.
12. Enjekte edilen embriyoları 1x Tricaine çözeltisi ile temiz bir Petri kabına(Tablo 4)aktarın ve 5-10 dakika dinlenmeye bırakın. Bu yaranın kapanması için zaman kazandıracak.
    NOT: Embriyoları agar plakasından Petri kabına aktarmak için embriyoların üzerine birkaç damla 1x Tricaine çözeltisi ekleyin ve plastik bir Pasteur pipetle dikkatlice toplayın. Toplanan embriyoları 1x Trikaine çözeltili yeni bir Petri kabına bırakın.
13. 1x Tricaine çözeltisini çıkarın ve taze E3 ortamı ekleyin.
14. Ksinograftları 34 °C'de kuluçkaya yatırın (insan hücre hatlarının hayatta kalması ve zebra balığı gelişimi arasında tehlikeye atılmış bir sıcaklık^8).

6. Metastatik tahlil

1. Enjeksiyon sonrası yaklaşık 1 saatlik (hpi) bir anda, enjekte edilen embriyoları floresan stereomikroskop üzerinde tarayın ve ksenograftları dolaşımdaki hücrelerin yokluğuna (Şekil 5A) veya varlığına (Şekil 5B) göre 2 gruba ayırın.
   NOT: Kalpte veya dolaşımda sadece bir kanser hücresi tespit edilse bile, bu ksenograftları dolaşımdaki hücrelere sahip ksenograftlar grubuna dahil edin. Alternatif olarak, hücreler bu gruptaki ksinograft sayısını artırmak için doğrudan dolaşıma enjekte edilebilir.

7. 1 gün enjeksiyon sonrası

1. Floresan stereomikroskopta her embriyoyu dikkatlice analiz edin ve düzgün enjekte edilmiş tümörleri olanları seçin (Şekil 6).
   NOT: Gerekirse, taramadan önce enjekte edilen embriyoları Tricaine 1X çözeltisi ile uyuşturun.
2. Aşağıdaki embriyoları/ksinograftları atın (Şekil 6A-A''):
   • tümör/anormal morfoloji/ölü olmadan,
   • kardiyak ve/veya yumurta sarısı ödemi ile,
   • tümör hücreleri sadece yumurta sarısında olacak şekilde,
   • çok az kanser hücresi ile.
3. Seçilen ksinograftları tümör boyutlarına göre sıralayın. Karşılaştırma için gözün boyutunu kullanın (Şekil 6B-B'', 6C).
   • Göz büyüklüğünden küçük tümörler (+),
   • Gözle aynı boyutta tümörler (++),
   • Göz büyüklüğünden büyük tümörler (+++).
4. Ksinograftları istenen deneysel düzene göre dağıtın ve ilaç testini başlatın (kontrol vs ilaç vb.). İlaçları ve E3 ortamını günlük olarak değiştirin (Tablo 4).
5. 34°C'lik sıcaklığı test sonuna kadar koruyan ksinograftları kuluçkaya yatırın.

8. Enjeksiyon sonrası 4 gün

1. Testlerin son gününde, ksinograftları 1x Tricaine çözeltisi ile uyuşturun ve agar plakasına dikkatlice hizalayın.
   NOT: Ölü veya şişmiş ksinograftları atın. İlaç tedavileri ve bazı tümör hücreleri toksisiteye neden olabilir ve sonunda ksinograft mortaliteye neden olabilir. Bu ksinograftlar gravür nicelleştirme için dikkate alınmaz.
2. Engraftment yüzdesini belirlemek için: floresan stereomikroskopta her canlı ksenograftı analiz edin ve PVS'deki tümörlerin yokluğunu (Şekil 6D) / varlığını (Şekil 6E) değerlendirin.
   
3. Metastaz yüzdesini belirlemek için: floresan stereomikroskopta her bir ksenograftı analiz edin ve daha önce tanımlanmış 2 grubun (CIRC ve NO CIRC, Şekil 6F)kaudal hematopoetik dokusunda (CHT) mikrometastaz varlığını/yokluğunu değerlendirin.
   
4. Deneysel kuruluya göre, ilgi çekici ksinograftları seçin ve 25x Tricaine(Tablo 3)ile ötenazi.
5. Oda sıcaklığında (RT) en az 4 saat veya gece boyunca 4 °C'de % 4 formaldehit (FA) olarak sabitlayın.
   NOT: PBS/%0,1 Triton'da %4 oranında seyreltilmiş metanol içermeyen formaldehit (%16 FA) kullanın. Tüpleri fiksatif ile doldurun. Tüm ksinograftların homojen bir şekilde sabitlenmesini sağlamak, geçirgenliği artırmak ve zebra balıklarının altta toplanmasını önlemek için tüpleri yatay olarak konumlandırın.
6. Alternatif olarak borularla sabitleyin (1 mL başına: 100 μL 1 M PIPES sodyum tuzu (4 °C); 1 μL 1 M MgSO₄ (RT); 4 μL 0,5 M EGTA (RT); 93,7 μL% 16 FA (RT); 801,3 μL ddH₂O).
   NOT: PIPES, RFP ve mCherry transgenik hatlarının floresanını %4 FA'dan daha iyi korur.
7. İmmünasyon farklı bir günde yapılacaksa, SK'yı% 100 metanol (MetOH) ile değiştirin. %100 metanolde sabitlenmiş kinograftlar süresiz olarak -20 °C'de saklanabilir.
   NOT: MetOH bazı lekelerin (yani phalloidin) verimliliğini bozabilir ve bazı floresan etiketlemeleri söndürebilir. MetOH sabit numunelerindeki antikorların verimliliğini önceden onaylayın.

9. Konfokal görüntüleme için tüm montaj immünostaining

NOT: Tüm mount immünofluoresans tekniği aşağıdaki gibi bölünmüş 3 gün sürer: İlk gün ksinograftların permeabilizasyonu ve primer antikor inkübasyonu içindir. Yıkama ve ikincil antikor inkübasyonu için ikinci gün ve yıkama, ksnograftların sabitlenmesi ve montaj ortamlarında depolanması için üçüncü gün.

1. 1. Gün
   1. Ksenograftlar% 100 MetOH'da depolanmışsa, bir dizi azalan MetOH konsantrasyonu ile yeniden sulandırın (% 75, % 50, % 25 MetOH PBS/ % 0.1 Triton'da seyreltilir). SK'da sabitlenmişse, PBS/%0,1 Triton ile değiştirin.
   2. PBS/%0,1 Triton'da 4x'i 5 dakika yıkayın.
   3. 1x'i H 2 O'da₅dakika yıkayın.
      NOT: Tüpler aksi belirtilmedikçe her zaman sabitleme, permeabilizasyon ve yıkama adımlarında yatay olarak konumlandırılmalıdır.
   4. Buz gibi aseton için H₂O'nun yerine değiştirin ve -20 °C'de 7 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: -20 °C'de asetonlu 50 mL'lik bir tüp yerleştirin, böylece kullanıma hazırdır. Mikrosantrifüj tüpler, asetonun dışarı sızmaması için bir rafa dikey olarak konumlandırılmalıdır.
   5. PBS/%0,1 Triton'da 2x'i 10 dakika yıkayın.
   6. RT'de 1 saat boyunca PBDX_GS blokaj çözeltisi ile kuluçkaya yaslanın (PBDX_GS engelleme tamponu: 50 mL 1x PBS; 0,5 g sığır serum albümin - BSA; 0,5 mL DMSO; 250 μL% 10 Triton; 750 μL keçi serumu - GS (15 μL/1 mL)).
   7. PBDX_GS çıkarın ve ~40 μL primer antikor seyreltme ekleyin (genellikle 1:100).
      NOT: Birincil antikor seyreltme hacmi mikrosantrifüj tüpünde bulunan ksenograft sayısına bağlı olarak değişir. Tüm ksinograftların su altında olduğundan emin olun.
   8. RT'de 1 saat kuluçkaya yatır ve sonra bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatır. Tüpleri dikey olarak konumlandırın.
2. 2. Gün
   1. Primer antikoru çıkarın ve PBS/%0,1 Triton'da 2x'i 10 dakika yıkayın.
   2. PBS/%0,05 Ara ile 30 dakika boyunca 4x yıkayın.
      NOT: Aşağıdaki adımlar karanlıkta yapılmalıdır (tüpleri ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın).
   3. PBS/%0,05 Arayı çıkarın ve PBDX_GS seyreltilmiş ~50-100 μL ikincil antikor seyreltme (genellikle 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg/mL) ekleyin.
   4. RT'de 1 saat kuluçkaya yatır ve sonra bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatır. Tüpleri dikey olarak konumlandırın ve ışıktan koruyun.
3. 3. Gün (tüpleri ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın)
   1. İkincil antikor seyreltme çıkarın ve PBS/%0,05 Ara 15 dakika boyunca 4x yıkayın.
   2. Oda sıcaklığında %4 FA'da 20 dakika sabitleyin.
   3. PBS/%0,05 Ara'da 1x'i 5 dakika yıkayın.
   4. PBS/%0,05 Arayı çıkarın ve her mikrosantrifüj tüpüne 1 damla sulu montaj ortamı ekleyin. Tüpleri dikey olarak konumlandırın.
   5. Montaja kadar ışıktan korunan 4 °C'de monte edin veya saklayın. Tüpleri dikey olarak konumlandırın.

10. Ksinograftların montajı

NOT: Mikrosantrifüj tüplerini işlem boyunca ışıktan koruyun. Zebra balığı ksinograftları 2 kapak arasına monte edilir (24 x 60 mm # 1,5). Bu, konfokal görüntüleme sırasında monte edilen ksinograftların çevrilmesine izin verir, böylece tümörün her iki tarafına da (üst ve alt) erişilebilir. Montaj ortamına sahip plastik pipetler kullanmayın - ksinograftlar pipete yakalanabilir. Aşağıdaki adımların şematik gösterimi için Şekil 7'ye bakın.

1. Kapak Y'yi etiketleyin ve montaj medyasının sızmasını önlemek için kapak X'in kenarlarını petrol jeli veya silikon gresle kapatın.
2. Xenograft'ları cam pastör pipetle kapak X'e aktarın.
3. Bunları dikkatlice bir saç tokası ile hizalayın ve fazla sulu montaj medyasını çıkarın.
4. Coverlip Y'ye sulu montaj ortamı ekleyin.
5. Kapak X'in üzerine kapak Y'nin üzerine dikkatlice yerleştirin. Ksinograftları bozabileceği için kapaklara basmayın.
6. Monte edilmiş kapakları bir mikroskop slaydının üzerine yerleştirin ve şeffaf yapışkan bantla sabitleyin. Bu, konfokal görüntüleme ve depolama için daha kolay bir manipülasyon sağlar.

11. Konfokal görüntüleme

NOT: Su düzeltmeli Apochromatic 25x daldırma objektif lens, PVS tümörlerini tek hücre çözünürlüğüyle görüntülemek için en uygunudur (örneğin Şekil 8C-C" ve Şekil 9A'ya bakın).

1. Her dilim arasında 5μm aralıklarla z-stack işlevini kullanarak numune alın. 3D rekonstrüksiyonu amaçlayan görüntüler için, özellikle gemilerde, dilimler arasında 1-3μm aralık kullanın (Şekil 8A).

12. Analiz ve nicelik

1. Konfokal görüntü işleme ve analiz için FIJI/ImageJ yazılımı veya benzerini kullanın.
2. FIJI yazılımında ham verileri (.czi, .lsm, vb.) açın.
3. Bileşik modda tek bir kanalın tümünden veya yalnızca tek bir kanaldan birini seçmek için şunu tıklatın: Görüntü > Renkler > Kanallar Aracı.
4. Parlaklık ve kontrast düzeylerini ayarlamak için şu tıklatın: Görüntü > renk dengesini ayarlama >.
5. Tümör boyutunu ölçmek için
   1. Ksenograft başına z-yığını başına üst, orta ve alttan tümörün üç temsili dilimini seçin (Şekil 8 A).
      NOT: Konfokal çözünürlük ~ 60-70 μm tümör derinliğine ulaşır. Tümör büyükse, toplam hacmini görmek mümkün olmayabilir.
   2. Verilere açıklama eklemek için bir elektronik tablo açın.
   3. Seçilen 3 dilimdeki tümör hücrelerine karşılık gelen her DAPI çekirdeğini sayın (Şekil 8 A, B). Bunu yapmak için:
      1. Hücre sayacı > Çözümlemek > Eklentiler'i tıklatarak FIJI/ImageJ'den hücre sayacı eklentisini açın.
      2. Hücre sayacı aracında Başlat'ı tıklatın, bir sayaç türü seçin ve sayım modunu el ile başlatmak için resmi tıklatın. Her tıklama için sayaç, kaç hücrenin sayılacağını (tıklama sayısı) ekler.
      3. Bir tam dilimi saydıktan sonra, hücre numarasını ilgili excel belgesine kaydedin.
      4. Fiji'ye geri döndüğünüzde, aynı sayaç kullanılacaksa bilgileri silmek için Hücre Sayacı penceresinden Sıfırla'yı tıklatın. Aksi takdirde, bilgiler saklanabilir ve diğer sayaçlar diğer dilimlerle (veya hücrelerle) kullanılabilir.
      5. İkinci temsili dilime gitme ve önceki adımları yineleme. Tüm verileri toplayın.
         NOT: DAPI karşıtlık, tek tek hücrelerin net tanımı nedeniyle hücre numaralarını saymak için yaygın olarak kullanılır, ancak diğer hücreye özgü boyama kullanılabilir.
   4. Tümördeki toplam hücre sayısını elde etmek için aşağıdaki formülü kullanın:
      
      NOT: Ortalama çekirdek çapı ~10-12 μm olan hücreler için 1,5 düzeltme sayısı tahmin edildi. Hücreler daha büyük/daha küçükse, bu düzeltmenin ayara ihtiyacı olabilir. Bu yöntem hakkında daha fazla ayrıntı için Dicussion'a bakın.
6. Diğer belirteçleri (bağışıklık hücreleri, mitotik şekiller, PPH3, etkinleştirilmiş Caspase3, Ki67, vb.) ölçmek için, aynı eklentiyi kullanarak tüm dilimleri ölçün (mitotik şekillerin görselleştirilmesi için Şekil 8C-C'' 'ye bakın). Toplam sayılan hücre sayısını ilgili tümör boyutuna bölün ve yüzdeyi elde etmek için 100 ile çarpın.
   NOT: Bazı hücrelerin iki dilim arasında bulunacağına dikkat edin, bir hücrenin iki kez sayılmayacağından emin olmak için z yığınında ileri geri gidin.

Sonuçlar

Zebra balığı yabancıyıldızı, anti-kanser tedavilerini incelemek için bir araç olarak.
HCT116 kolorektal kanser hücre hattı CM-DiI ile etiketlendi ve döllenme sonrası 2 günlük PVS (dpf) embriyolara enjekte edildi. Enjeksiyondan sonra, ksinograftlar zebra balığı gelişiminden ödün vermeden tümör hücrelerinin büyümesini sağlayan bir sıcaklık olan 34 ° C'de inkübe edildi. Ertesi gün, ksinograftlar PVS'de bir tümör kütlesinin varlığına veya yokluğuna göre tarandı (düzgün enjekte edilmeyen zebra balıkları atıldı ve ötenaziye tabi tökezlendi) (Şekil 6A-A''). Ksinograftlar tümör boyutlarına göre gruplandırıldı (Şekil 6B-B'') ve tedavi edilmeyen kontrollerde ve FOLFIRI kemoterapisinde (0.18 mM Folinik asit, 0.08 mM Irinotecan ve 4.2 mM Fluorouracil (5-FU)) rastgele (kuyu başına 6 kuyu plakasında: ~12 ksinograft) dağıtıldı.

Kontrol E3 ve ilaçlar günlük olarak değiştirildi ve ölü zebra balıkları atıldı. 4 dpi ve tedavi sonrası üç gün (dpt), engraftment protokolün 8.2 adımında olduğu gibi ölçüldü. Engraftment, PVS'de 4 dpi'de tümör kütlesi sunan ksinograftların sıklığı olarak kabul edilir. Örneğin, deneyin sonunda 40 canlı larva varsa ve 40'ın 35'i PVS'de bir tümör varsa, engraftment oranı% 87.5'tir. Ksinograftlar, immünofluoresans ve konfokal mikroskopi ile tümör büyüklüğü ve apoptozu değerlendirmek için ötenazi yapıldı ve sabitlendi.

Nüklei karşıtlığı için anti-cleaved Caspase 3 antikoru (asp175) (tavşan, 1:100, #CST 9661) ve DAPI (50 μg/mL) kullanılarak apoptotik hücreleri tespit etmek için immünoresans yapıldı. Görüntü yığını veri kümeleri (her 5um) adım 12'deaçıklandığı gibi FIJI/ImageJ yazılımı ile gerçekleştirilen bir LSM710 konfokal mikroskop ve veri analizinde elde edilmiştir. Mitotik indeksin nicelleştirilmesi, apoptoz (% Aktif Caspase3) ve tümör büyüklüğü, FOLFIRI'nin mitozun önemli bir azalmasına (Mann Whitney Testi, P<0.0001) ve apoptozun önemli bir indüksiyonunu (Mann Whitney testi, P<0.0001), tümör büyüklüğünün % 54 azalmasına neden olduğunu ortaya koydu (P<0.001) (Şekil 8C-E, Şekil 9A-E).

Bu özellikler, yüksek verimli fenotipik ilaç ekranlarında ve birkaç kanser tedavisinin hücre içsel ve fizyolojik etkilerini kısa bir zaman diliminde test etmek için yararlıdır.

İnsan-zebra balığı ksinograftlarının insana özgü antikorlarla karakterizasyonu
Tüm ksinograft modellerinde olduğu gibi, hücreleri yanlış tanımlama riski vardır. Örneğin, makrofajlar insan kanser hücrelerini fagositoz ederek lipofilik boya ile etiketlenebilir ve daha sonra zebra balığı konağı boyunca seyahat edebilir ve böylece bu hücreler tümör mikrometastaz ile karıştırılabilir. Bu nedenle, ksinograftların insan HLA, ki-67 veya insan mitokondri (hMITO) gibi spesifik insan antikorlarıyla etiketlenmesi, ilk karakterizasyon ve ayrıca tümör hücrelerinin morfolojisi ile tanışması için çok önemlidir (Şekil 9F-I).

Hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için Zebra balığı ksinograft.
Zebra balığı ksinograft modelinin bir başka büyük avantajı, farklı tümör hücrelerinin etkileşimlerini incelemek ve her hücre türünün diğerinin davranışını nasıl etkileyebileceğini analiz etmek mümkündür. Farklı insan kanser hücreleri (aynı tümörden veya farklı tümörlerden farklı klonlar) birlikte enjekte edilebilir. Bu örnekte, aynı hastadan elde edilen iki CRC hücre hattı farklı lipofilik boyalarla etiketlenmiş ve enjeksiyon için 1:1 oranında karıştırılmıştır (Şekil 9J-K').

aynı greft üzerinde insan hücre hatlarını karıştırırken (poliklonal tümörler oluşturmak için), dio boyasını kullanmaktan kaçının, çünkü bu spesifik olmayan çift boyama ile sonuçlanır(Tablo 2). Bunun yerine, denemenin sonunda popülasyonların kolay bir şekilde ayırt edileceğini görmek için örneğin, yeşil CMFDA (hücre satırı#2) ile CM-DiI (hücre satırı#2) veya Derin kırmızı (hücresatırı#2) (Tablo 2, Şekil 9J-K') ile CM-DiI (hücre satırı#1) kullanın. Tümör içindeki her klonun sıklığını ölçmek için, her klonu tanımlamak için FIJI'de 2 farklı sayaç tipi kullanın ve ardından her birinin (%) göreli fraksiyonunu elde etmek için toplam hücre sayısına (tüm klonların toplamı) bölün.

Şekil 1. Zebra balığı xenograft protokolünün akış şeması özeti Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Zebra balığı embriyo enjeksiyonu için malzemeler: A. Borosilikat iğne B. %2 Agarose tabağı. C Saç tokası halkası D. Saç tokası döngüsü yapmak için adımlar: 1. 1 saç tüp dışında yaklaşık 1 santimetre saç bırakarak bir cam kılcal tüp içine yerleştirin. 2-3. Saçın dış ucunu forseps yardımıyla cam kılcal boruya kıvırın ve ~0,5 mm uzunluğunda bir döngü oluşturur. 4. Kılcal borunun kenarını bir damla oje ile kapatın. 5-6. Kırılmasını korumak için kılcal damarın etrafına bir parça elektrik bandı kapatın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Zebra balığı embriyolarının döllenme sonrası 48 saatte temsili stereomikroskop görüntüleri (48 hpf): A-A'. 48 hpf gelişimde zebra balığı embriyosunun normal morfolojisi, mikroenjeksiyon B-B'ye hazır. 48 hpf'de mikroenjeksiyonlar için yeterli gelişim aşamasına ulaşamayan ve zaten bir dereceye kadar kardiyak ödem (siyah ok ucu) ve şişmiş yumurta sarısı sunan bir zebra balığı embriyosunun morfolojisi. A' ve B' sırasıyla A ve B büyütmeleridir. Ölçek çubukları 500 μm'yi temsil eder.

Şekil 4. Zebra balığı mikroenjeksiyon plakası kurulumunun şematik gösterimi: A. Uyuşturulma embriyolarının %3 Agar/%2 Agarose plakada hizalanması. B. Perivitelline alanını (PVS) gösteren siyah bir okla 2 günlük döllenme sonrası zebra balığı embriyosunun grafik gösterimi. C ve D. Kanser hücreleri, döllenme sonrası 48 saatlik bir embriyonun perivitelline uzayına (PVS) enjekte edilen PVS'ye farklı açılarla enjekte edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. Metastatik test. Enjeksiyon sonrası 1 saat (1hpi) enjekte edilen embriyolar dolaşımdaki tümör hücrelerinin yokluğuna (NO_circ) veya varlığına (CIRC) göre sıralanır. Enjeksiyondan 4 gün sonra mikrometastaz sunan her iki gruptaki ksinograftların sayısı ölçülür. (A )NO_circ grubundaki hücreler mikrometastaz oluşturabilmek için tüm metastatik adımlardan geçmek zorunda kalırken, CIRC grubundaki(B)hücreler metastatik basamaklamanın sadece son adımlarından geçerler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Enjeksiyon sonrası 1 gün ve enjeksiyon sonrası 4 gün xenografts temsili floresan stereomikroskop görüntüleri. Floresan protein TdTomato'yu (kırmızı) ifade eden insan kanser hücreleri 2 dpf zebra balığı embriyosuna mikroenjected edildi. 1 dpi'de, enjekte edilen embriyoları tarayın ve kötü enjekte edilenleri veya embriyoları ödem(A-A'') ile atın, iyi enjekte edilen embriyoları tümör boyutlarına (B-B'') göre sıralayın. C. SW620 ksinograftlarda 1 dpi'de farklı tümör boyutu kategorilerinde bulunan toplam hücre sayısının temsili nicelemesi. Her nokta, 4 dpi'12.At bölümde açıklandığı gibi ölçülen bir ksinograftı temsil eder, larvaları tarar ve farklı sınıfları ölçer: tümör yok (D); PVS 'de tümör (E) ve CHT'de(F)mikrometastaz ile. Ölçek çubukları 500 μm'yi temsil eder.

Şekil 7. Konfokal görüntüleme için ksinograft montajının şematik gösterimi. 1. Kapak Y'de etiketleme örneği, kapak X'te açık mavi çizgi, montaj ortamlarının sızmasını önlemek için petrol jölesi / silikon gresinin uygulandığı çevreyi temsil eder. 2. Konfokal görüntüleme için coverlip X'te ksinograft hizalama örnekleri. 3. Sulu montaj ortamı (mavi ok), kapak kılıfı X' in üstüne Y'yi bağlamak için kullanılır. Düzgün monte edilmiş kapak kılıfları örneği. 5. Kapaklar daha sonra bir cam kaydırağın üzerine yerleştirilir ve şeffaf bantla sabitlenir. 6. Konfokal görüntüleme için hazır monteli ksinograftlar. BioRender.com ile oluşturuldu Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8. Tümör boyutunun konfokal mikroskop görüntüsünün görsel gösterimi. Enjeksiyon sonrası 4 gün A'da bir HCT116 xenograft konfokal görüntüleri. DAPI kanalındaki z-yığın dilimleri serisi 5 μm aralıkla elde edilir. Kırmızı kesikli çizgiler, hücre sayımı için kullanılan üç temsili dilimi daire içine alan çizgiler. B. ImageJ/Fiji yazılımındaki Hücre Sayacı Eklentisi ile DAPI çekirdeklerinin ölçülmesi. C-E. DAPI'da veya fosfo-histon H3 antikor (yeşil) kullanarak mitotik figürleri görselleştirmenin/ölçmenin mümkün olduğu tümör içinde tek hücreli çözünürlük örneği. D ve E, C'nin büyütmeleridir. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder.

Şekil 9. Temsili sonuçlar. A-E. HCT116 kolorektal kanser hücre hattı Vybrant CM-DiI ile etiketlendi ve döllenme sonrası 2 günlük PVS (dpf) embriyolara enjekte edildi. Enjeksiyondan sonra, ksinograftlar 34 °C'de inkübe edildi. 1 dpi'de, ksinograftlar tedavi edilmeyen kontrollerde ve FOLFIRI'de tarandı ve rastgele dağıtıldı, art arda 3 gün boyunca tedavi edildi ve 4 dpi'de sabitlendi. A. Nüklei karşıtlığı için anti-cleaved Caspase 3 antikoru ve DAPI kullanılarak apoptotik hücreleri tespit etmek için immünoresans yapıldı. Mitotik indeksin C,apoptoz (% Aktif Caspase3) D'nin ölçülmesi, ve tümör boyutu E, FOLFIRI'nin mitozun önemli bir azalmasına (Mann Whitney Testi, P<0.0001) ve apoptozun önemli bir indüksiyonunu (Mann Whitney testi, P<0.0001), tümör büyüklüğünün% 54 azalmasına neden olduğunu ortaya koydu (P<0.001). Analiz edilen ksinograft sayısı şekilde belirtilir ve her nokta bir xenograft'ı temsil eder. F-H. PVS ve CHT I'deyeşil (insan HLA, ki67 ve hMITO) insan spesifik belirteçleri ile etiketlenmiş enjeksiyon sonrası 4 günde kolorektal kanser ksinograftlarının temsili görüntüleri. J-J'. Lipofilik boyama CellTracker Deep Red (Cy5 - beyaz), CellTracker Green CMFDA (488 - yeşil) ve DAPI karşıtlık ile etiketlenmiş iki farklı insan kolorektal kanser hücre hattı ile enjekte edilen poliklonal ksinograftların konfokal görüntüleri. K-K'. Lipofilik boyama CellTracker Deep Red (Cy5 - beyaz), Vybrant CM DiI (594 - kırmızı) ve DAPI karşıtlık ile etiketlenmiş iki farklı insan kolorektal kanser hücre hattının konfokal görüntüleri. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder.

Hücre satırı

doku

tür

morfoloji

Büyüme modu

Enjeksiyon için ideal izdiham

Enjeksiyon için ayrıştırıcı madde

Ayrışma zamanı

Etiketleme protokolü

Enjeksiyon ortamı

Toplam hücre sayısını böl (enjeksiyon için ideal konsantrasyonu elde etmek için)

SW480

Kolorektal adenokarsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 dakika

Şişe

PBS 1x

0,25

SW620

Kolorektal adenokarsinom (metastaz)

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 dakika

Şişe

PBS 1x

0,25

HCT116

Kolorektal karsinom (primer), Kras mutant

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 dakika

Şişe

PBS 1x

0,25

HKE3

Kolorektal karsinom, Kras WT

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 dakika

Şişe

PBS 1x

0,25

HT-29

Kolorektal adenokarsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 2 mM

5 dakika

Şişe

PBS 1x

0,2

CACO-2

Kolorektal adenokarsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

Tam ortam

0,25

MCF-7

Meme adenokarsinom (metastaz)

insan

Epitel

Yapışık

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

%60 FBS + %40 komple orta

0,5

Hs578T

Meme karsinomu (primer)

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

2 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

%60 FBS + %40 komple orta

0,5

MDA-MB-468

Meme adenokarsinom (metastaz)

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

8 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

%60 FBS + %40 komple orta

0,5

MDA-MB-231

Meme adenokarsinom (metastaz)

insan

Epitel

Yapışık

70% - 75 %

PBS/EDTA 1 mM

5 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

Tam ortam

0,5

RT112

İdrar kesesi geçiş hücreli karsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

85% - 90%

TRYPLE

6 dakika + hücre kazıyıcı

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

Tam ortam

0,5

BFTC905

İdrar kesesi geçiş hücreli karsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

75% - 85%

TRYPLE

10 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

%80 komple orta + %20 PBS/EDTA 2 mM

0,5

J82

İdrar kesesi geçiş hücreli karsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

85% - 90%

TRYPLE

10 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

Tam ortam

0,5

RT4

İdrar kesesi geçiş hücreli karsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

85% - 90%

TRYPLE

6 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

Tam ortam

0,5

MIA PaCa-2

Pankreas epiteliod karsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

80% - 90%

TRYPLE

3 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

%60 FBS + %40 komple orta

0,5

PANC-1

Pankreas epiteliod karsinom (primer)

insan

Epitel

Yapışık

80%

TRYPLE

5 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

PBS/EDTA 2mM

0,5

VC8

Akciğer fibroblastları, BRCA2 mutant, İk eksikliği

Çin hamster

Epitel

Yapışık

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

Tam ortam

0,25

VC8-B2

Akciğer fibroblastları, insan BRCA2, BRCA2 −/− İk eksikliği

Çin hamster

Epitel

Yapışık

70% - 80 %

PBS/EDTA 1 mM

5 dakika

1,5 mL mikrosantrifüj tüpü

Tam ortam

0,25

Tablo 1: Birkaç hücre hattının enjeksiyonu için optimum in vitro izdiham

Hücre boyası

Katalog numarası

Floresan spektrumu (Eksn. - Em.)

Stok seyreltme

Bir şişede leke yapmak için çalışma seyreltme

1,5 mL mikrosantrifüjde lekeleme için çalışma seyreltme

Kuluçka süresi

Gözlem

Vybrant CM-DiI

V22888

549 nm - 569 nm

Zaten seyreltilmiş

PBS 1x'te 4:1000

PBS 1x'te 4:1000

15 dk @ 37 ºC + 4 dk @ 4 ºC

Vybrant DiO

V22886

484 nm - 501 nm

Zaten seyreltilmiş

PBS 1x'te 5:1000

PBS 1x'te 5:1000

15 dk @ 37 ºC + 4 dk @ 4 ºC

Enjeksiyon sonrası 4 günde konfokal görüntülemede iyi çözünürlük değil

CellTracker Derin Kırmızı

C34565

630 nm - 660 nm

DMSO'da 1 mM

PBS 1x'te 0,5 - 2,5 μM

PBS 1x'te 0,5 - 2,5 μM

15 dk @ 37 ºC

CellTracker Yeşil CMFDA

C7025

492 nm - 517 nm

DMSO'da 10 mM

PBS 1x'te 0,5 - 2,5 μM

PBS 1x'te 0,5 - 2,5 μM

15 dk @ 37 ºC

Ürün enjeksiyondan 48 saat sonra karın boşluğuna sızar, ancak ko-enjeksiyon çalışmaları için idealdir

Tablo 2: Boya ve koşullar

boyut	larvaların sayısı	E3 1x orta Hacim
100 mm x 15 mm (standart)	50'ye kadar	20-25 mL
60 mm x 15 mm	20'ye kadar	10 mL
6 kuyulu tabak	Kuyu başına 15'e kadar	Kuyu başına 3-4 mL

Tablo 3: Petri kabı seçenekleri

E3 orta 50x - stok	10 litre steril su için:
	146,9 g NaCl
	6,3 g KCl
	24,3 g CaCl2·2H2O
	40,7 g MgSO4·7H2O
E3 orta 1x – kullanıma hazır	400 mL E3 orta 50x
	60 mL % 0.01 Metilen Mavi Çözüm
	20 litreye kadar balık sistemi suyunu doldurun
Tricaine 25x – stok ve ötenazi	2 g Trikaine tozu
	500 mL ters ozmos suyu
	10 mL 1 M Tris (pH 9)
	pH 7'ye uyum sağlama
Trikain 1x - Anestezi	20 mL Tricaine 25x
	500 mL'ye kadar sistem suyu doldurun
60 mg/mL Pronaz - stok 100x	1 g pronaz
	16,7 mL steril su
0.6 mg/mL Pronaz – 1x kullanıma hazır	100 μL pronaz 100x
	9,9 mL E3 orta 1x

Tablo 4: Çözelti kompozisyonları

Tartışmalar

Zebra balığının kanser gelişimi ve ilaç taraması için bir model olarak artan önemi, çok sayıda yayınla sonuçlandı³, 4^{,7,13,14,16,18,19,20,21}. Bununla birlikte, zebra balığı embriyolarına kanser hücrelerinin enjekte edilmesi, araştırmacılar için zorlayıcı olabilecek yüksek düzeyde el becerisi gerektiren bir tekniktir. Bu protokolde, zebra balığı embriyo ksinograftlarının kurulmasının ilk zorluklarının üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek pratik bilgiler ve bazı ipuçları sağlamayı amaçlıyoruz.

Hücre işleme öncesi enjeksiyon
Hücre hatlarına sahip zebra balığı ksinograftlarının üretimi için optimize edilmiş bu protokol, farklı morfolojilere sahip çeşitli (kanser) hücre türlerine uyarlanabilir. Zebra balığı ksinograftları için kullanılan tüm hücre hatlarının mikoplazma içermemesi tavsiye ediyoruz. Diğer bakteriyel kontaminasyonların aksine, hücre kültüründe mikoplazmanın varlığı mikroskop altında kolayca tespit edilebilen değişiklikler oluşturmaz²². Mikoplazma kontaminasyonu hücre hatlarının engraftasyon potansiyelini, ilaçlara duyarlılıklarını ve zebra balığı embriyolarının canlılığını etkileyebilir.

Hücreler uzun süre çoğalmaya devam etse de, fenotipleri ve genotipleri değişikliklere eğilimli olabilir. Kültürdeki hücre çizgilerinin morfolojisine ve davranışına aşina olmak önemlidir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için 3-12 arasında çözdükten sonra hücre pasajı sayısını korumanızı öneririz. Bu nedenle düzenli mikoplazma testleri yapılmalıdır.

Hücreler günlük aşamasında olmalıdır (birışıklığa ulaşmadan önce üstel büyüme aşaması ~%70) enjeksiyon gününde. Bu, tümörün ayırt edici özelliklerinin yeterli bir şekilde bir şekilde ele edilmesini ve uygun şekilde gelişmesini sağlayacaktır. Ksinograft içindeki hücrelerin fenotipinde varyasyonu önlemek için, deneyler arasında enjeksiyon sabiti için birleştiği yer kritik öneme sahiptir. Enjekte edilen hücrelerin sayısı, zebra balığı embriyolarında gelişmek için daha yüksek enjeksiyon yoğunlukları gerektirebileceğinden, her hücre hattının özelliklerine uyarlanabilir.

Hücre etiketlemeyle ilgili önemli noktalar
Enjeksiyon ve ileride yapılacak analizler için insan tümör hücrelerini daha iyi görselleştirmek için tümör hücreleri floresan boyalarla etiketlenebilir. Hücresel boyuttaki farklılıklar nedeniyle, yapışan kültürlerdeki toplam hücre/cm² sayısı hücre çizgileri arasında değişmektedir. Bu, boyama protokolünün etkinliğini ve enjeksiyon için hasat edilen hücre sayısını etkileyecektir. Şişe başına düşük sayılar veren (örneğin, Hs578T) veya kümeler halinde büyüyen büyük hücreler (örneğin, BFTC905) tek bir deneme için birkaç şişenin birikmesini gerektirir. Bu durumda, hücrelerin boyanması doğrudan şişede yapılmamalıdır, çünkü bu aşırı miktarda boya kullanımına neden olacaktır (yüksek maliyet). Öte yandan, aşırı santrifüjleme döngülerine ve şişe başına yüksek sayılar veren hücrelere (yani HCT116) doğrudan şişede boyanabilir ve daha sonra EDTA/ hücre kazıyıcı ile ayrılabilir (Daha fazla bilgi için bkz. Tablo 1).

Mümkün olduğunda, enzimatik bir yaklaşım kullanmak yerine, enjeksiyon gününde hücreleri ayırmak için EDTA'yı kullanın, böylece hücreler hücre hücre bağlantılarını daha hızlı bir şekilde kurtarır ve daha az santrifüjleme adımlarına maruz kalırlar. Bununla birlikte, hücreler EDTA'ya duyarlıysa, kümelerde çok yapışır veya büyür - enzymatic bir yöntem uygulanabilir. Enjeksiyon için ideal konsantrasyonun ve enjeksiyon ortamının optimizasyonu her hücre hattının özelliklerine bağlıdır, bu nedenle bazı ayarlamalara ihtiyaç duyabilir (Tablo 1).

Mikroenjeksiyon kalibrasyonu
Zebra balığı embriyosuna oligonükleotidlerin veya ilaçların verilmesinin aksine, ksinograftlar için hücre hatlarıyla çalışırken iğneyi kalibre etmek için bir graticule kullanılmaz. Enjeksiyon sırasında bir süre sonra, hücreler tıkanmaya başlayacaktır ve çapını artırmak veya iğneyi tamamen değiştirmek için iğnenin ucunu kesmek gerekir. Bu prosedür graticule kalibrasyonunu engeller.

Bu sorunu gidermek için, dağıtılan hücre sayısı, 1-3 darbe içinde embriyo gözüne benzer bir boyuta ulaşmak için gereken basınç ve süre ile düzenlenir. Daha sonra tümör boyutunu daha fazla kontrol etmek için 1 dpi'de ksinograftlar Şekil 6 B-B"degösterildiği gibi tümör büyüklüğüne göre sıralanır. Şekil 6C örneğinde belirtildiği gibi, bu sıralama yöntemi tümör boyutlarının varyasyonunun azaltılmasında etkilidir: hepsini bir araya alırsak (+, ++, +++ ) STEV ++sınıfının ~iki katıdır (~906 hücreden ~422 hücreye) ve katsayı varyasyonu ++sınıfında %14,5'e kıyasla ~%31,9'dur. Enjeksiyon referansı hacim olduğundan, toplam hücre sayısı hücre tipleri arasında çok değişir - hücrelerin boyutuna ve şekline bağlı olarak. Örneğin, meme kanseri Hs578T gibi çok fazla sitoplazman olan büyük hücreler çok daha küçük tümörler üretir (~600 hücre). Ayrıca, her hücre satırı farklı sayıda hücre gerektirir. Örneğin, HT29 CRC ve RT112 idrar kesesi kanseri hücre hatları, enjekte edilen hücre sayısı ne kadar yüksekse zebra balığı mortalitesinin de o kadar yüksek olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, hücre hattının embriyoda toksik etkileri olup olmadığını veya enjeksiyonun daha yüksek / daha düşük yoğunluklarını gerektirip gerektirmediğini test etmek için ksenograftları geliştirirken bir optimizasyon süresine ihtiyaç vardır.

Enjeksiyon bölgesi
Zebra balığı embriyo ksinograftları üretirken en yaygın tutarsızlıklardan biri enjeksiyon yeridir. Yumurta sarısı, kolay erişilebilirliği nedeniyle genellikle enjeksiyon için tercih olunacak yerdir. Bununla birlikte, yumurta sarısına enjekte edilen hücrelerin ölme eğiliminin daha yüksek olduğunu gözlemledik. Teknik olarak daha zor olsa da, PVS'ye ve kalpten mümkün olduğunca enjekte etmenizi öneririz. PVS içinde, hücreler metastatik özellikler^8,11görüntülerlerse, damarları ve bağışıklık hücrelerini toplayabilir, toplayabilir ve göç edebilir, intravazat, ekstravazat ve mikrometastaz oluşturabilir.

Engraftment verimliliği
4 dpi'deki hücre hatları arasında engraftasyon verimliliği ve tümör boyutundaki farklılıklar, farklı derecelerde bazal hücre ölümü / sağkalım / çoğalması nedeniyle ve aynı zamanda her hücre hattının gösterebileceği doğuştan gelen immünojeniklik nedeniyle beklenmektedir⁹.

metastaz
Metastaz, iki rasgele aşamaya ayrılabilen çok düzeyli bir olay basamaklamadan oluşur. İlk aşamada, tümör hücreleri birincil bölgeden ayırmak, bitişik dokuları göç etmek ve istila etmek ve daha sonra kan dolaşımına intravazat yapmak zorunda. İkinci aşamada, tümör hücreleri dolaşımda hayatta kalmalı, kan veya lenfatik damarlardan ekstravaze olmalı ve son olarak ikincil bölgelerde kolonileşmelidir²³. Bu erken ve geç olayları ayırt etmek ve farklı tümör hücrelerinin bu adımları gerçekleştirme potansiyelini/yeterliliğini ele almak için basit bir tahlil tasarladık.

Genel olarak, PVS'ye enjekte edildiğinde, tümör hücreleri doğrudan dolaşıma girebilir ve daha sonra kaudal hematopoetik dokuya (CHT) (kuyruk bölgesi) fiziksel olarak hapsolabilir. Bununla birlikte, her tümör hücresinin özelliklerine göre - bazı tümör hücrelerinin CHT 4 dpi'de kaldığını ve diğer tümör hücreleri kaybolurken mikrometastaz oluşturabildiğini gördük (CHT'ye yakalandıktan sonra temizlendi).

Bu nedenle, hücrelerin doğrudan dolaşıma yerleştirilecekleri mikrometastaz verimliliğini (4 dpi'de) karşılaştırarak - CIRC (hücreler sadece metastazın geç adımlarından geçmek zorunda) ve olmadığında - ÇKS YOK (hücrelerin mikrometaz oluşturabilmek için erken ve geç adımlardan geçmesi gerekir) erken veya geç metastatik potansiyellerini değerlendirebiliriz. Her iki grupta da CHT'de verimli bir şekilde mikrometastaz oluşturabilen tümör hücrelerini gözlemledik (CIRC ve NO CIRC), bu hücrelerin metastatik basamaklamanın tüm adımlarından geçme kapasitesine sahip olduğunu öne sürdük (örneğin SW480 ve MDA-MB-468)^8,11. Buna karşılık, diğer tümör hücreleri her iki grupta da çok düşük bir metastatik potansiyele sahiptir, dolaşıma enjekte edildiğinde bile neredeyse hiç mikrometastaz yapmaz (yani, CHT'de 24 hpi'de görülebilir, ancak 4 dpi'de artık orada değiller, örneğin Hs578T)⁸. Bununla birlikte, açıkça başka bir grup bulduk - sadece dolaşıma enjekte edildiğinde mikrometastaz oluşturabilen bir grup (sadece CIRC grubunda mikrometastaz gözlemleyebiliyoruz). Bu, bu hücrelerin metastatik çağlayanın ilk adımlarını gerçekleştirmede düşük bir verimliliğe sahip olduğunu, ancak diğer yandan dolaşımda hayatta kalabildiğini, uzak bir bölgeyi ekstravazasyona ve kolonileştirebildiğini göstermektedir.

İmmün yetinme ve görüntüleme
Fiksasyondan önce, bu enjeksiyon protokolü canlı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi, eğirme disk mikroskopisi, yüksek çözünürlüklü canlı konfokal görüntüleme ve ışık tabakası mikroskopisi vb.

Ölü hücreler ve hücresel döküntüler floresan stereomikroskoptan gözlendiğinde parlak görünür ve özellikle çalışmanın amacı hücre çizgilerinin metastatik potansiyelini değerlendirmekse, canlı hücrelerle karıştırılabilir. Tümörün sağkalım durumunu ve mikrometastazı değerlendirmek için spesifik canlılık belirteçleri ve DAPI ile konfokal görüntülemenin önemini vurgulamak isteriz. Ayrıca, anti-insan mitokondri veya anti-insan HLA gibi insan hücrelerini tespit etmek için belirli insan antikorlarının kullanılması esastır. Protokolü uygularken, stereomikroskoptaki lekeleri konfokal görüntülerle karşılaştırarak deneyci gözleri eğitin. Bir süre sonra, deneyciler enkazı floresan stereomikroskoptaki canlı hücrelerden açıkça ayırt edebilir.

Tüm floresan alanı gibi tümör yükünü ölçmek için diğer yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, daha doğru bir yöntem olarak tüm montaj immünostaining ve konfokal görüntülemenin yapılması tavsiye edilir. Sadece lipofilik boya boyamanın verimliliği çok değişken değildir (yani, bazı hücreler çok iyi lekelenirken, diğerleri -muhtemelen zarlarının lipit içeriğinden kaynaklanmıyor), aynı zamanda birçok kez lipofilik boyalar agrega oluşturur ve ölü hücreler daha parlak olma eğilimindedir - canlı hücreler için karıştırılabilecek birkaç eser oluşturur.

Hücreler, takiplerine yardımcı olmak ve hücre etiketlemesini atlamak için floresan proteinlerle transdüklenebilir. Bununla birlikte, transdüklenmiş ve transdüklenmiş olmayan hücrelerin zebra balığı ksinograftlarında aynı sonuçları ürettiğinden emin olun.

Ek olarak, makrofajlar bu floresan hücre kalıntılarının floresan olarak etiketlenmesine ve göç ederek yanlış pozitif metastatik hücreler üretmesini fagositleyebilir. Bu nedenle, tümör davranışının daha doğru yorumlanması için elbette diğer birçok okumaya genişletilebilen bir dizi analitik araç öneriyoruz:

• Çoğalma - MITOTİk figürlerin DAPI veya anti-pHH3^Ser10 antikoru ile nicelemesi (Merck Millipore Cat. #06-570),
• Apoptoz ile hücre ölümü- antikor anti-aktif Caspase3^Asp175 (Hücre Sinyal Teknolojileri Cat. #9661) veya eşdeğeri,
• Tümör büyüklüğü - DAPI sayımı- insan tümör hücreleri çok farklı bir kromatin organizasyonu gösterir, bu nedenle zebra balığı hücrelerinden kolayca ayırt edilirler ve boyayı iki kez kontrol etmek her zaman mümkündür (gözünüzü eğitirken),
• Metastatik çalışmalar için, insan hücrelerini net bir şekilde tespit etmek için, - anti-insan HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), anti-insan mitokondri (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).

DAPI karşıtlık ile kontrol kanseri hücrelerinin HCT116 (ortalama nükleer boyut 10-12 μm çapında) Z yığınındaki dilimler arasında 5 μm aralıklı bir konfokal alım için, hücrelerin ~ % 50'sinin ardışık iki dilim arasında paylaşulduğunu gözlemledik. Bu nedenle, her dilim sayılırsa, aynı hücreleri iki kez sayma riski yüksektir. Nicelikte sorun yaşamamak için dilimler arasında gidip gelmek, zaman alıcı ve hataya eğilimli bir teknikle sonuçlanır. Toplam hücre sayısının nicelliğini kolaylaştırmak ve araştırmacılar arasında daha fazla tekrarlanabilirlik sağlamak için, daha önce bu protokolde açıklanan tümör boyutu formülünü oluşturduk⁸.

Dilimler arasında paylaşılan ~%50 hücreleri hesaba katmak için bir düzeltme numarası (1,5) dahil ettik. Araştırmacılar arasında tüm tümörün elle sayılmasında ortalama hatanın %20 olduğunu tespit ettik. Formülü kullanan iki araştırmacıda %2 hata vardı. Bu formülün kullanımı% 93 doğruluk oranına ve% 98 tekrarlanabilirlik oranına sahiptir. Otomatik yöntemleri de test ettik, ancak eşik ayarlarının neden olduğu% 50'den daha yüksek bir hata gösterdiler.

Apoptotik hücrelerin özellikleri nedeniyle, aktif Caspase 3 hücrelerinin nicelemesi daha zordur. Hataların sayısını ve sonuçlardaki varyasyonu azaltmak için, kontrol ve deneysel örneklerin aynı araştırmacı tarafından sayılmasını öneririz. Ek olarak, bu tekniği öğrenirken, yeni bir araştırmacı sonuçları karşılaştırmak ve eğitmek için daha deneyimli araştırmacılar tarafından zaten ölçülen görüntüleri saymalıdır.

Gerekirse tahlil süresi uzatılabilir. Bununla birlikte, zebra balığı larvalarının döllenmeden sonra ~7 günden (enjeksiyondan 5 gün sonra) başlayarak canlı beslenme gerektirdiğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Ek olarak, döllenme sonrası 6 günden daha eski larvalara uygulanan hayvan refahı yönergeleri ve düzenlemeleri değişebilir.

Bu protokol, tek bir araştırmacının saatte yaklaşık ~200-300 zebra balığı larvası enjekte etmesini sağlamak için yararlı araçlar sağlar; ve analiz ve istatistiksel yorumlama da dahil olmak üzere tam tahlil sonuçları üç hafta içinde elde edildi. Bu protokolün araştırmacıların zebra balığı ksinograftları üretme konusunda uzman olmalarına yardımcı olabileceğini umuyoruz. Kolay değil; Pratik yapman gerekiyor ama oraya varacaksın. İyi şanslar!

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar for bacteriology	VWR	97064-336	Agar plate
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)	Cell Signalling Technologies	9661	Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti-human HLA (Rabbit monoclonal)	Abcam EP1395Y	ab52922	Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)
anti- 488 (Rabbit monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35552	Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
anti- 594 (Rabbit monoclonal)	ThermoFisher Scientific	35560	Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)
CellTracker Deep Red Dye	ThermoFisher Scientific	C34565	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
CellTracker Green CMFDA Dye	ThermoFisher Scientific	C2925	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Conical Centrifuge tube 50mL	VWR	525-0610
Conical Centrifuge tube 15mL	VWR	525-0604
DAPI			Nuclear and chromosome counterstain
Laser-Based Micropipette Puller P-2000	Sutter-Instrument		Micropipette Puller
Microcentrifuge tube 1.5mL	Abdos	P10202
Microscope slides, cut edge	RS France	BPB016	Slides for mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Mounting medium
Pneumatic Picopump	World Precision Instruments	PV820	Microinjector
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	ThermoFisher Scientific	631-9430	Coverslips for mounting
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004	Agar plate
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100-4	Borosilicate capillaries
TrypLE	Gibco	12605036	Enzymatic detachment solution
Vaseline			Petroleum jelly for slide sealing
Vybrant CM-DiI Dye	ThermoFisher Scientific	V22888	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	ThermoFisher Scientific	V22886	Lipophilic dye (Dilution 1:1000)
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology	ZEISS		Fluorescence Stereo Zoom Microscope
Zeiss LSM 710	ZEISS		Confocal microscope