Un modelo simplificado para el trasplante heterotópico de válvulas cardíacas en roedores

Resumen

Este protocolo describe un método simple y eficiente para el trasplante de valvas de la válvula aórtica debajo de la cápsula renal para permitir el estudio de la alorreactividad de las válvulas cardíacas.

Resumen

Existe una necesidad clínica urgente de reemplazos de válvulas cardíacas que puedan crecer en los niños. El trasplante de válvula cardíaca se propone como un nuevo tipo de trasplante con el potencial de entregar válvulas cardíacas duraderas capaces de crecimiento somático sin necesidad de anticoagulación. Sin embargo, la inmunobiología de los trasplantes de válvulas cardíacas sigue sin explorarse, lo que pone de relieve la necesidad de modelos animales para estudiar este nuevo tipo de trasplante. Se han descrito modelos previos de ratas para el trasplante heterotópico de válvula aórtica en la aorta abdominal, aunque son técnicamente desafiantes y costosos. Para abordar este desafío, se desarrolló un modelo de trasplante subcapsular renal en roedores como un método práctico y más sencillo para estudiar la inmunobiología del trasplante de válvula cardíaca. En este modelo, se cosecha una sola valva de la válvula aórtica y se inserta en el espacio subcapsular renal. El riñón es de fácil acceso, y el tejido trasplantado está contenido de forma segura en un espacio subcapsular que está bien vascularizado y puede acomodar una variedad de tamaños de tejido. Además, debido a que una sola rata puede proporcionar tres valvas aórticas de donantes y un solo riñón puede proporcionar múltiples sitios para el tejido trasplantado, se requieren menos ratas para un estudio determinado. Aquí, se describe la técnica de trasplante, que proporciona un importante paso adelante en el estudio de la inmunología del trasplante de válvula cardíaca.

Introducción

Los defectos cardíacos congénitos son la discapacidad congénita más común en los seres humanos, que afecta a 7 de cada 1.000 niños nacidos vivos cada año¹. A diferencia de los pacientes adultos en los que se implantan rutinariamente varias válvulas mecánicas y bioprotésicas, los pacientes pediátricos actualmente no tienen buenas opciones para el reemplazo de válvulas. Estos implantes convencionales no tienen el potencial de crecer en los niños receptores. Como resultado, se requieren reoperaciones mórbidas para intercambiar los implantes de válvulas cardíacas por versiones sucesivamente más grandes a medida que los niños crecen, y los niños afectados a menudo requieren hasta cinco o más cirugías a corazón abierto en su vida ^2,3. Los estudios han demostrado que la ausencia de intervención o muerte es significativamente pobre para los bebés que para los niños mayores, con el 60% de los bebés con válvulas cardíacas protésicas que enfrentan una nueva operación o la muerte dentro de los 3 años posteriores a su operación inicial⁴. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de administrar una válvula cardíaca que pueda crecer y mantener la función en pacientes pediátricos.

Durante décadas, los intentos de ofrecer reemplazos de válvulas cardíacas en crecimiento se han centrado en la ingeniería de tejidos y las células madre. Sin embargo, los intentos de trasladar estas válvulas a la clínica han sido infructuosos hasta ahora 5,6,7,8. Para abordar esto, un trasplante de válvula cardíaca se propone como una operación más creativa para administrar reemplazos de válvulas cardíacas en crecimiento que tienen la capacidad de autorrepararse y evitar la trombogénesis. En lugar de trasplantar todo el corazón, solo se trasplanta la válvula cardíaca y luego crecerá con el niño receptor, similar a los trasplantes de corazón convencionales o un autógrafo pulmonar de Ross ^9,10,11. Después de la operación, los niños receptores recibirán inmunosupresión hasta que la válvula trasplantada pueda cambiarse por una prótesis mecánica de tamaño adulto cuando ya no se requiera el crecimiento de la válvula. Sin embargo, la biología del trasplante de los injertos de trasplante de válvula cardíaca permanece inexplorada. Por lo tanto, se necesitan modelos animales para estudiar este nuevo tipo de trasplante.

Se han descrito previamente varios modelos de ratas para el trasplante heterotópico de la válvula aórtica en la^{aorta abdominal} 12,13,14,15,16,17,18. Sin embargo, estos modelos son prohibitivamente complicados, a menudo requieren cirujanos capacitados para operar con éxito. Además, son costosos y requieren mucho tiempo¹⁹. Se desarrolló un nuevo modelo de rata para crear un modelo animal más simple para estudiar la inmunobiología de los trasplantes de válvulas cardíacas. Las valvas de la válvula aórtica única se extirpan y se insertan en el espacio subcapsular renal. El riñón es especialmente adecuado para estudiar el rechazo del trasplante, ya que está altamente vascularizado con acceso a células inmunes circulantes^20,21. Mientras que varios otros han utilizado un modelo subcapsular renal para estudiar la biología del trasplante de otros trasplantes de aloinjertos como páncreas, hígado, riñón y córnea ^{22,23,24,25,26,27}, esta es la primera descripción del trasplante de tejido cardíaco en esta posición. Aquí, se describe la técnica de trasplante, que proporciona un importante paso adelante en el estudio de la inmunología del trasplante de válvula cardíaca.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Animal siguiendo la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Información sobre el modelo animal (Ratas)

1. Use un microscopio quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de hasta 20x para todos los procedimientos quirúrgicos.
2. Use cepas singénicas (como Lewis-Lewis) o alogénicas (como Lewis-Brown Norway) para los trasplantes según sea necesario para el experimento.
3. Use ratas de edad entre 5-7 semanas y peso corporal de 100-200 g que sean apropiadas para la pregunta experimental.

2. Eliminación del pelaje, preparación de la piel y anestesia

1. Realizar todas las operaciones en condiciones estériles.
   NOTA: El paso se realiza en un espacio quirúrgico dedicado y en condiciones estériles.
2. Coloque las ratas en una cámara de inducción anestésica e induzca la anestesia con 5% de isoflurano en oxígeno. Mantener la anestesia con isoflurano al 3,5% en oxígeno durante todo el procedimiento.
3. Para la operación del donante, retire el pelaje de la rata del ombligo a la muesca esternal usando cortadores de piel. Para la operación de receptor, recorte el cabello sobre el campo quirúrgico en la línea axilar posterior desde las costillas hasta la pelvis. A continuación, prepare la piel con un desinfectante quirúrgico.
4. Obtenga un plano quirúrgico de anestesia antes de comenzar el procedimiento. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia comprimiendo firmemente los dedos de los pies de la rata con fórceps. Si la rata se retira al dolor, titule el anestésico según sea necesario.
5. Controlar clínicamente la frecuencia respiratoria y la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento; el nivel de isoflurano se ajusta según sea necesario para mantener una frecuencia respiratoria de 55-65 respiraciones/min.

3. Operación del donante

1. Prepare y anestesia a la rata como se indica en el paso 2. Incise la piel desde el xifoide hasta la muesca esternal usando tijeras de disección. Realice una esternectomía cortando las costillas de cada lado lateral al esternón hasta lograr un acceso óptimo al corazón.
2. Heparinizar la rata con una inyección de 100 U/100 g en la aurícula izquierda.
3. Sacrificar al donante a través de la exsanguinación.
4. Extirpa el timo para mejorar la visualización de los grandes vasos. Luego, retire el corazón en bloque con la aorta ascendente hasta el nivel de la arteria innominada.

4. Preparación de valvas de la válvula aórtica

1. Coloque el corazón del donante en una placa de Petri estéril inmediatamente después de la cardiectomía. Diseccionar el corazón del donante en un tampón de almacenamiento frío helado (ver Tabla de Materiales).
2. Usando fórceps y tijeras de resorte Vannas, diseccionar el corazón del donante hasta que solo quede la raíz aórtica con un manguito ventricular de 1 mm proximal a la válvula aórtica.
3. Abra la válvula aórtica haciendo un corte longitudinal para abrir el seno de Valsalva entre los senos izquierdo y no coronario para visualizar las tres valvas.
   NOTA: El corte debe ser de toda la longitud del Seno de Valsalva. Las dimensiones reales dependen del tamaño de la rata.
4. Extirpar cada valva de la válvula aórtica individualmente. Específicamente, use fórceps contundentes para agarrar el borde del folleto y use tijeras de resorte Vannas para extirpar el folleto cortando desde una comisura hasta el anillo, y luego hacia la siguiente comisura.
   NOTA: Tenga especial cuidado de agarrar solo el borde de la valva para minimizar la interrupción de las células endoteliales valvulares.
5. Almacene las muestras después de la escisión del prospecto en una solución tampón de almacenamiento en frío hasta que estén listas para ser implantadas en la rata receptora. Implante todos los prospectos dentro de las 4 h posteriores al almacenamiento en frío.

5. Operación del destinatario

1. Prepare y anestesia a la rata como se indica en el paso 2. Use una almohadilla térmica mantenida a 36-38 ° C para realizar la cirugía.
2. Administrar buprenorfina (0,03 mg/kg por vía subcutánea) a todas las ratas receptoras antes de la cirugía y cada 6-12 h después de la operación según sea necesario para aliviar el dolor.
3. Coloque la rata en una posición recostada lateral derecha para acceder al riñón izquierdo.
   NOTA: Se prefiere el riñón izquierdo debido a su posición más caudal en relación con el riñón derecho.
4. Incise la piel sobre el flanco longitudinalmente sobre 1 pulgada usando tijeras.
   NOTA: La incisión debe permanecer más pequeña que el tamaño del riñón para proporcionar suficiente tensión para evitar que el riñón se retraiga de nuevo en la cavidad abdominal durante el procedimiento.
5. Del mismo modo, incise la pared abdominal subyacente.
6. Externalizar el riñón
   1. Usando el pulgar y el índice, aplique una ligera presión dorsal y ventral mientras usa fórceps curvos para levantar el polo caudal del riñón a través de la incisión abdominal y cutánea. Exteriorice el extremo craneal del riñón de manera similar.
   2. Alternativamente, el riñón puede exteriorizarse agarrando la grasa perirrenal y tirando hacia arriba con ligera tensión.
      NOTA: Tenga cuidado de no agarrar el riñón o los vasos renales directamente.
   3. Una vez que el riñón está externalizado, manténgalo húmedo con solución salina tibia goteada sobre el riñón.
7. Cree un bolsillo subcapsular.
   1. Aplique ligeramente presión a la cápsula renal usando un juego de fórceps contundentes para que la cápsula renal pueda distinguirse claramente del parénquima subyacente. Simultáneamente usando otro juego de pinzas romas, agarre cuidadosamente la cápsula y tire suavemente hacia arriba para crear un agujero en la cápsula.
      NOTA: Debido a la naturaleza delicada de la cápsula, se requiere una fuerza mínima para establecer esta incisión.
   2. Continúe usando pinzas romas para extender la incisión hasta que se haya creado un espacio de ~ 2 mm para acomodar la valva de la válvula aórtica.
   3. Desarrolle una bolsa subcapsular poco profunda que sea ligeramente más grande que la valva de la válvula mientras levanta el borde de la incisión con un juego de fórceps y avanza una sonda roma debajo de la cápsula renal.
8. Trasplante la válvula aórtica en la bolsa subcapsular.
   1. Recupere la valva aórtica del almacenamiento en frío y colóquela en el campo quirúrgico.
   2. Mientras levanta la cápsula fibrosa de borde, avance la valva aórtica hacia el bolsillo subcapsular con fórceps contundentes.
      NOTA: Asegúrese de que el tejido esté lo suficientemente lejos de la incisión para que esté firmemente asegurado debajo de la cápsula. Se debe tener cuidado para evitar daños en el parénquima subyacente o un mayor desgarro de la cápsula fibrosa.
   3. La incisión en la cápsula renal se puede dejar abierta.
9. Empuje el riñón suavemente hacia atrás a su posición anatómica utilizando la contratracción aplicada a los bordes de la incisión.
10. Cierre la incisión abdominal con una sutura quirúrgica estéril en ejecución. Cierre la piel con grapas.
11. Cuidados postoperatorios
    1. Después de la operación, coloque a la rata en una jaula limpia en una almohadilla térmica con acceso a alimentos y agua.
    2. Monitoree al animal diariamente para evaluar la cicatrización rutinaria de heridas y los signos de dolor o angustia. Retire las grapas después de 7-10 días.

6. Recolección de tejido para análisis

1. En los puntos finales seleccionados después del trasplante, eutanasiar al animal por exsanguinación. En concreto, realizar una laparotomía mediana y transectar la aorta abdominal por debajo del 5% de isoflurano en oxígeno.
2. Movilice el riñón y apóselo cortando la arteria renal, la vena y el uréter con tijeras.
   NOTA: Tenga cuidado de no agarrar el área que contiene el prospecto trasplantado.
3. Coloque el riñón en formalina durante la noche, intégrelo en parafina y seccionarlo para la tinción deseada. Oriente la muestra con la cápsula renal mirando hacia atrás y el parénquima renal hacia atrás.

Resultados

Se proporciona una representación gráfica del diseño experimental para el modelo de rata (Figura 1). Además, en la Figura 2 también se muestra una raíz aórtica diseccionada del corazón del donante y una valva de válvula aórtica individual preparada para la implantación. A continuación, se muestra una imagen representativa de la posición de la valva de la válvula aórtica debajo de la cápsula renal para la implantación en la F...

Discusión

Importancia y aplicaciones potenciales
Si bien las válvulas cardíacas mecánicas y bioprotésicas se usan rutinariamente en pacientes adultos que requieren reemplazo de válvulas, estas válvulas carecen del potencial de crecimiento y, por lo tanto, no son óptimas para los pacientes pediátricos. El trasplante de válvula cardíaca es una operación experimental diseñada para administrar reemplazos de válvulas cardíacas en crecimiento para neonatos y bebés con enfermedad cardíaca congénita. S...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C