설치류의 이종 주제 심장 판막 이식을위한 단순화 된 모델

요약

이 프로토콜은 심장 판막의 동종 활성에 대한 연구를 허용하기 위해 신장 캡슐 아래에 대동맥 판막 전단지를 이식하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

초록

소아에서 자랄 수있는 심장 판막 교체에 대한 긴급한 임상 적 필요성이 있습니다. 심장 판막 이식은 항응고에 대한 필요없이 체세포 성장이 가능한 내구성있는 심장 판막을 제공 할 수있는 잠재력을 가진 새로운 유형의 이식으로 제안됩니다. 그러나 심장 판막 이식의 면역 생물학은 아직 탐구되지 않았으며,이 새로운 유형의 이식을 연구하기 위해 동물 모델의 필요성을 강조합니다. 복부 대동맥으로의 이질성 대동맥 판막 이식을위한 이전의 쥐 모델이 설명되었지만 기술적으로 어렵고 비용이 많이 듭니다. 이 과제를 해결하기 위해 신장 피막 이식 모델은 설치류에서 심장 판막 이식 면역 생물학을 연구하기위한 실용적이고 직접적인 방법으로 개발되었습니다. 이 모델에서는 단일 대동맥 판막 전단지를 수확하여 신장 피막 하부 공간에 삽입합니다. 신장은 쉽게 접근 할 수 있으며, 이식 된 조직은 혈관이 잘 형성되고 다양한 조직 크기를 수용 할 수있는 피막 하 공간에 안전하게 포함되어 있습니다. 또한, 단일 쥐가 세 개의 기증자 대동맥 전단지를 제공 할 수 있고 단일 신장이 이식 된 조직에 여러 부위를 제공 할 수 있기 때문에 주어진 연구에 더 적은 수의 쥐가 필요합니다. 여기에서, 이식 기술이 설명되어, 심장 판막 이식의 이식 면역학을 연구하는데 있어서 중요한 진전을 제공한다.

서문

선천성 심장 결함은 인간에서 가장 흔한 선천성 장애로 매년 1,000 명의 출생 아동 중 7 명에게 영향을^미칩니다. 다양한 기계 및 생체 보철 판막이 일상적으로 이식되는 성인 환자와 달리 소아 환자는 현재 밸브 교체를위한 좋은 옵션이 없습니다. 이러한 종래의 임플란트는 수용자 소아에서 성장할 가능성이 없다. 결과적으로, 병적 인 재 수술은 아이들이 성장함에 따라 심장 판막 임플란트를 연속적으로 더 큰 버전으로 교환해야하며, 영향을받는 어린이는 종종 평생 동안 최대 다섯 개 이상의 개방 심장 수술을 필요로합니다 ^2,3. 연구에 따르면 개입이나 사망으로부터의 자유는 나이가 많은 어린이보다 유아에게 현저히 좋지 않으며, 보철 심장 판막이있는 유아의 60 %는 초기 수술 후 3 년 이내에 재 수술 또는 사망에 직면합니다⁴. 따라서, 소아 환자에서 성장하고 기능을 유지할 수 있는 심장 판막을 전달해야 할 긴급한 필요성이 존재한다.

수십 년 동안 성장하는 심장 판막 대체물을 제공하려는 시도는 조직 공학 및 줄기 세포에 집중되어 왔습니다. 그러나 이러한 밸브를 클리닉으로 번역하려는 시도는 지금까지 성공하지 못했습니다 ^5,6,7,8. 이를 해결하기 위해, 심장 판막 이식은 자기 회복과 혈전 생성을 피할 수있는 능력을 가진 성장하는 심장 판막 교체를 제공하는보다 창의적인 수술로 제안됩니다. 전심을 이식하는 대신, 심장 판막 만 이식되고 기존의 심장 이식 또는 로스 폐 사인^9,10,11과 유사하게 수용자 아이와 함께 자랄 ^{것입니다.} 수술 후, 수용자 어린이는 판막의 성장이 더 이상 필요하지 않을 때 이식 된 판막이 성인 크기의 기계적 보철물로 교환 될 때까지 면역 억제를 받게됩니다. 그러나 심장 판막 이식 이식편의 이식 생물학은 아직 탐구되지 않았습니다. 따라서이 새로운 유형의 이식을 연구하기 위해서는 동물 모델이 필요합니다.

몇몇 래트 모델은 복부 대동맥 내로의 대동맥 판막의 이종 국소 이식을 위해 이전에 기술되었다 12,13,14,15,16,17,18. 그러나 이러한 모델은 엄청나게 까다 롭고 종종 숙련 된 외과 의사가 성공적으로 수술해야합니다. 또한 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다¹⁹. 심장 판막 이식의 면역 생물학을 연구하기위한 간단한 동물 모델을 만들기 위해 새로운 쥐 모델이 개발되었습니다. 단일 대동맥 판막 전단지를 절제하여 신장 피막 하 공간에 삽입합니다. 신장은 순환 면역 세포^20,21에 대한 접근으로 고도로 혈관화되어 있기 때문에 이식 거부를 연구하는 데 특히 적합합니다. 몇몇 다른 사람들이 신장 피막 하 모델을 사용하여 췌장, 간, 신장 및 각막 ^{22,23,24,25,26,27}과 같은 다른 동종 이식편 이식의 이식 생물학을 연구했지만^,이 위치에서이 위치에서 심장 조직의 이식에 대한 첫 번째 설명입니다. 여기에서, 이식 기술이 설명되어, 심장 판막 이식의 이식 면역학을 연구하는데 있어서 중요한 진전을 제공한다.

프로토콜

이 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드에 따라 동물 연구위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물모델(쥐)에 대한 정보

1. 모든 수술 절차에 대해 최대 20x 배율의 작동 현미경 ( 재료 표 참조)을 사용하십시오.
2. 실험에 필요한 경우 합성(예: 루이스-루이스) 또는 동종이계(예: 루이스-브라운 노르웨이) 균주를 이식에 사용합니다.
3. 실험 질문에 적합한 5-7 주와 100-200g의 체중을 가진 쥐를 사용하십시오.

2. 모피 제거, 피부 준비 및 마취

1. 멸균 조건에서 모든 작업을 수행하십시오.
   참고: 이 단계는 전용 수술 공간 및 멸균 조건에서 수행됩니다.
2. 래트를 마취 유도 챔버에 넣고 산소 중의 5% 이소플루란으로 마취를 유도한다. 절차 전반에 걸쳐 산소에서 3.5 % 이소플루란으로 마취를 유지하십시오.
3. 기증자 수술을 위해 모피 깎기를 사용하여 쥐의 모피를 움빌리쿠스에서 흉골 노치로 제거하십시오. 받는 사람 수술의 경우, 갈비뼈에서 골반까지 후부 겨드랑이 라인의 수술 필드 위에 머리카락을 클립하십시오. 다음으로, 외과 용 소독제로 피부를 준비하십시오.
4. 절차를 시작하기 전에 마취의 수술 평면을 얻을. 집게로 쥐의 발가락을 단단히 압축하여 적절한 마취 깊이를 확인하십시오. 쥐가 통증으로 물러나면 필요에 따라 마취제를 적정하십시오.
5. 절차 전반에 걸쳐 임상적으로 호흡률과 마취의 깊이를 모니터링; 이소플루란의 수준은 55-65 호흡 / 분의 호흡 속도를 유지하기 위해 필요에 따라 조정됩니다.

3. 기증자 운영

1. 단계 2에 명시된 바와 같이 래트를 준비하고 마취시킨다. 해부 가위를 사용하여 xiphoid에서 흉골 노치까지 피부를 절개하십시오. 심장에 대한 최적의 접근이 달성 될 때까지 흉골에 양쪽의 갈비뼈를 옆으로 절단하여 흉골 절제술을 수행하십시오.
2. 왼쪽 심방에 100 U / 100g의 주사로 쥐를 헤파리네이션하십시오.
3. exsanguination을 통해 기증자를 희생하십시오.
4. 큰 혈관의 시각화를 향상시키기 위해 흉선을 소비하십시오. 그런 다음, 불명타 동맥의 수준까지 상승하는 대동맥으로 심장 en bloc을 제거하십시오.

4. 대동맥판막 전단지의 제조

1. 기증자 심장을 cardiectomy 직후에 멸균 된 Petri 접시에 넣으십시오. 얼음처럼 차가운 냉장 저장 버퍼에서 기증자 심장을 해부하십시오 ( 재료 표 참조).
2. 포셉과 Vannas 스프링 가위를 사용하여 대동맥 뿌리 만 대동맥 판막에 근위에있는 1mm 심실 커프스로 남을 때까지 기증자 심장을 해부하십시오.
3. 왼쪽 및 비 관상 동맥 부비동 사이의 Valsalva의 부비동을 열어 세 개의 전단지를 모두 시각화하기 위해 세로 절단을 만들어 대동맥 밸브를 엽니 다.
   참고 : 컷은 Valsalva의 Sinus의 전체 길이가되어야합니다. 실제 치수는 쥐의 크기에 달려 있습니다.
4. 각 대동맥 판막 전단지를 개별적으로 소비하십시오. 특히, 무딘 포셉을 사용하여 전단지의 가장자리를 잡고 Vannas 스프링 가위를 사용하여 하나의 컴미스 슈어에서 환부로 자른 다음 다음 컴펌으로 절단하여 전단지를 소비하십시오.
   참고 : 판막 내피 세포의 파괴를 최소화하기 위해 전단지의 가장자리 만 파악하도록 특별한주의를 기울이십시오.
5. 전단지 절제 후 샘플을 수용자 쥐에 이식 할 준비가 될 때까지 얼음처럼 차가운 저장 완충 용액에 보관하십시오. 냉장 보관 후 4 시간 이내에 모든 전단지를 이식하십시오.

5. 수신자 작업

1. 단계 2에 명시된 바와 같이 래트를 준비하고 마취시킨다. 36-38°C로 유지되는 가열 패드를 사용하여 수술을 수행한다.
2. 부프레노르핀 (0.03 mg / kg)을 수술 전에 모든 수혜자 쥐에게 피하 투여하고 통증을 완화하기 위해 필요에 따라 수술 후 6-12 시간마다 투여하십시오.
3. 쥐를 왼쪽 신장에 접근하기 위해 오른쪽 측면 재사용 위치에 놓습니다.
   참고 : 왼쪽 신장은 오른쪽 신장에 비해 더 많은 인과 적 위치 때문에 선호됩니다.
4. 가위를 사용하여 옆구리의 피부를 세로 방향으로 1 인치 이상 절개하십시오.
   참고: 절개는 신장의 크기보다 작게 유지되어야 신장이 시술 중에 복강으로 후퇴하는 것을 방지하기에 충분한 긴장을 제공할 수 있습니다.
5. 마찬가지로, 근본적인 복벽을 절개하십시오.
6. 신장 외부화
   1. 엄지와 검지를 사용하여 복부와 피부 절개를 통해 신장의 꼬리 극을 들어 올리기 위해 곡선 포셉을 사용하는 동안 등쪽과 심실로 가벼운 압력을 가하십시오. 유사하게 신장의 두개골 끝을 외부화하십시오.
   2. 대안으로, 신장은 주변 신장 지방을 파악하고 가벼운 긴장으로 위쪽으로 당겨서 외부화 될 수 있습니다.
      주의: 신장이나 신장 혈관을 직접 잡지 않도록 주의하십시오.
   3. 신장이 외부화되면 신장에 흘러 들어간 따뜻한 식염수로 촉촉하게 유지하십시오.
7. 피막 아래 포켓을 만듭니다.
   1. 한 세트의 무딘 포셉을 사용하여 신장 캡슐에 가볍게 압력을 가하여 신장 캡슐이 기본 실질과 명확하게 구별 될 수 있도록하십시오. 동시에 다른 무딘 포셉 세트를 사용하여 캡슐을 조심스럽게 잡고 부드럽게 위쪽으로 당겨 캡슐에 구멍을 만듭니다.
      참고 : 캡슐의 섬세한 특성으로 인해이 절개를 확립하기 위해서는 최소한의 힘이 필요합니다.
   2. 무딘 포셉을 계속 사용하여 대동맥 판막 전단지를 수용하기 위해 ~ 2mm 공간이 생성 될 때까지 절개를 연장하십시오.
   3. 밸브 전단지보다 약간 큰 얕은 피막 하부 포켓을 개발하면서 한 세트의 포셉으로 절개 가장자리를 들어 올리고 신장 캡슐 아래에서 무딘 프로브를 전진시킵니다.
8. 대동맥 판막을 피막 하부 주머니에 이식하십시오.
   1. 냉장 보관에서 대동맥 전단지를 회수하여 수술 현장에 보관하십시오.
   2. 가장자리 섬유질 캡슐을 들어 올리면서 대동맥 전단지를 무딘 포셉으로 피막 하부 주머니에 넣으십시오.
      참고: 조직이 절개에서 충분히 멀리 떨어져 있는지 확인하여 캡슐 아래에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. 근본적인 실질의 손상이나 섬유질 캡슐의 추가 찢어짐을 피하기 위해주의를 기울여야합니다.
   3. 신장 캡슐의 절개는 열어 둘 수 있습니다.
9. 절개 가장자리에 적용된 반대 견인을 사용하여 신장을 해부학 적 위치로 부드럽게 밀어 넣으십시오.
10. 실행 멸균 수술 봉합사로 복부 절개를 닫습니다. 스테이플로 피부를 닫으십시오.
11. 수술 후 치료
    1. 수술 후, 쥐를 음식과 물에 접근 할 수있는 가열 패드의 깨끗한 케이지에 넣으십시오.
    2. 일상적인 상처 치유와 통증이나 고통의 징후를 평가하기 위해 동물을 매일 모니터링하십시오. 7-10 일 후에 스테이플을 제거하십시오.

6. 분석을 위한 조직 수집

1. 이식 후 선택된 종점에서 삼출에 의해 동물을 안락사시킨다. 구체적으로, 중간 개복술을 수행하고 복부 대동맥을 산소 중 5% 이소플루란 하에 횡단한다.
2. 신장을 동원하고 신장 동맥, 정맥 및 요관을 가위로 절단하여 소비하십시오.
   참고 : 이식 된 전단지가 들어있는 영역을 파악하지 않도록주의하십시오.
3. 신장을 포르말린에 밤새 넣고 파라핀에 묻힌 다음 원하는 염색을 위해 절개하십시오. 신장 캡슐이 앞쪽을 향하고 신장 실질이 후방을 향하도록 표본을 향하게하십시오.

결과

쥐 모델에 대한 실험 설계의 그래픽 묘사가 제공됩니다 (그림 1). 또한, 기증자의 심장에서 해부된 대동맥 뿌리와 이식을 위해 준비된 개별 대동맥 판막 전단지도 도 2에 도시되어 있다. 다음으로, 이식용 신장 캡슐 아래의 대동맥판막 전단지의 위치에 대한 대표적인 이미지를 도 3A 및 수용자 랫트 내 3, 7, 및 28일 후(

토론

중요성 및 잠재적 응용 프로그램
기계 및 생체 보철 심장 판막은 판막 교체가 필요한 성인 환자에서 일상적으로 사용되지만, 이러한 판막은 성장할 잠재력이 부족하여 소아 환자에게 차선책입니다. 심장 판막 이식은 선천성 심장 질환을 앓고있는 신생아 및 유아에게 성장하는 심장 판막 대체물을 제공하도록 설계된 실험 수술입니다. 그러나 기존의 심장 이식의 이식 면역 생물학과...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C