Um modelo simplificado para transplante de válvula cardíaca heterotópica em roedores

Resumo

Este protocolo descreve um método simples e eficiente para o transplante de folhetos de válvulas aórticas sob a cápsula renal para permitir o estudo da aoreatividade das válvulas cardíacas.

Resumo

Há uma necessidade clínica urgente de substituição de válvulas cardíacas que podem crescer em crianças. O transplante de válvula cardíaca é proposto como um novo tipo de transplante com potencial para fornecer válvulas cardíacas duráveis capazes de crescimento somático sem necessidade de anticoagulação. No entanto, a imunobiologia dos transplantes de válvulas cardíacas permanece inexplorada, destacando a necessidade de modelos animais estudarem esse novo tipo de transplante. Modelos anteriores de ratos para transplante de válvula aórtica heterotópica na aorta abdominal foram descritos, embora sejam tecnicamente desafiadores e caros. Para enfrentar esse desafio, um modelo de transplante subcapsular renal foi desenvolvido em roedores como um método prático e mais simples para estudar a imunobiologia do transplante de válvula cardíaca. Neste modelo, um único folheto de válvula aórtica é colhido e inserido no espaço subcapsular renal. O rim é facilmente acessível, e o tecido transplantado está firmemente contido em um espaço subcapsular que é bem vascularizado e pode acomodar uma variedade de tamanhos de tecido. Além disso, como um único rato pode fornecer três folhetos aórticos doadores e um único rim pode fornecer vários locais para tecido transplantado, menos ratos são necessários para um determinado estudo. Aqui, a técnica de transplante é descrita, proporcionando um avanço significativo no estudo da imunologia do transplante de válvulas cardíacas.

Introdução

Os defeitos cardíacos congênitos são a incapacidade congênita mais comum em humanos, afetando 7 em cada 1.000 crianças nascidas a cada^{ano 1}. Ao contrário de pacientes adultos em que várias válvulas mecânicas e bioprótesas são rotineiramente implantadas, pacientes pediátricos atualmente não têm boas opções para substituição de válvulas. Esses implantes convencionais não têm potencial para crescer em crianças beneficiárias. Como resultado, as re-operações mórbidas são necessárias para trocar os implantes da válvula cardíaca por versões sucessivamente maiores à medida que as crianças crescem, com crianças afetadas muitas vezes exigindo até cinco ou mais cirurgias de coração aberto em sua vida ^2,3. Estudos têm demonstrado que a liberdade de intervenção ou morte é significativamente ruim para bebês do que crianças mais velhas, com 60% dos bebês com válvulas cardíacas protéticas enfrentando a re-operação ou morte dentro de 3 anos após sua operação inicial⁴. Portanto, há uma necessidade urgente de entregar uma válvula cardíaca que possa crescer e manter a função em pacientes pediátricos.

Durante décadas, as tentativas de fornecer substituições crescentes de válvulas cardíacas foram centradas na engenharia de tecidos e células-tronco. No entanto, as tentativas de traduzir essas válvulas para a clínica não foram bem sucedidas até agora 5,6,7,8. Para lidar com isso, um transplante de válvula cardíaca é proposto como uma operação mais criativa para fornecer substituições crescentes de válvulas cardíacas com a capacidade de auto-reparar e evitar trombogênese. Em vez de transplantar todo o coração, apenas a válvula cardíaca é transplantada e crescerá com a criança receptora, semelhante a transplantes convencionais de coração ou um autógrafo pulmonar^{de Ross 9,10,11}. Após o funcionamento, as crianças receptoras receberão imunossupressão até que a válvula transplantada possa ser trocada por uma prótese mecânica de tamanho adulto quando o crescimento da válvula não for mais necessário. No entanto, a biologia do transplante de válvulas cardíacas permanece inexplorada. Portanto, modelos animais são necessários para estudar esse novo tipo de transplante.

Vários modelos de ratos foram descritos anteriormente para transplante heterotópico da válvula aórtica na aorta abdominal 12,13,14,15,16,17,18. No entanto, esses modelos são proibitivamente complicados, muitas vezes exigindo cirurgiões treinados para operar com sucesso. Além disso, são¹⁹ caros e demorados. Um novo modelo de rato foi desenvolvido para criar um modelo animal mais simples para estudar a imunobiologia dos transplantes de válvulas cardíacas. Folhetos de válvula aórtica simples são excisados e inseridos no espaço subcapsular renal. O rim é especialmente adequado para estudar a rejeição de transplantes, pois é altamente vascularizado com acesso a células imunes circulantes^20,21. Enquanto vários outros utilizaram um modelo subcapsular renal para estudar a biologia do transplante de outros transplantes de aloenxerto, como pâncreas, fígado, rim e córnea 22,23,24,25,26,27, esta é a primeira descrição do transplante de tecido cardíaco nesta posição. Aqui, a técnica de transplante é descrita, proporcionando um avanço significativo no estudo da imunologia do transplante de válvulas cardíacas.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal, seguindo o Guia Nacional de Atenção e Uso de Animais de Laboratório.

1. Informações sobre o modelo animal (Ratos)

1. Use um microscópio operacional (ver Tabela de Materiais) com ampliação de até 20x para todos os procedimentos cirúrgicos.
2. Use cepas síngênicas (como Lewis-Lewis) ou aogenéricas (como Lewis-Brown Noruega) para os transplantes, conforme necessário para o experimento.
3. Use ratos de idade entre 5-7 semanas e peso corporal de 100-200 g que são apropriados para a questão experimental.

2. Remoção de pele, preparação da pele e anestesia

1. Realizar todas as operações em condições estéreis.
   NOTA: A etapa é realizada em um espaço cirúrgico dedicado e em condições estéreis.
2. Coloque os ratos em uma câmara de indução anestésico e induza a anestesia com 5% de isoflurano em oxigênio. Mantenha a anestesia com 3,5% de isoflurane em oxigênio durante todo o procedimento.
3. Para a operação do doador, remova a pele do rato do umbigo para o entalhe severo usando cortadores de pele. Para a operação do receptor, corte o cabelo sobre o campo cirúrgico na linha axilar posterior das costelas até a pélvis. Em seguida, prepare a pele com um desinfetante cirúrgico.
4. Obtenha um plano cirúrgico de anestesia antes de iniciar o procedimento. Confirme a profundidade adequada da anestesia comprimindo firmemente os dedos do rato com fórceps. Se o rato se retirar para a dor, titula o anestésico conforme necessário.
5. Monitorar a taxa respiratória e a profundidade da anestesia clinicamente durante todo o procedimento; o nível de isoflurane é ajustado conforme necessário para manter uma taxa de respiração de 55-65 respirações/min.

3. Operação de doadores

1. Prepare-se e anestesia o rato como indicado na etapa 2. Incise a pele do xifoide ao entalhe severo usando tesouras dissecando. Realize uma esteectomia cortando as costelas de cada lado lateralmente para o esterno até que o acesso ideal ao coração seja alcançado.
2. Heparinize o rato com 100 U/100 g de injeção no átrio esquerdo.
3. Sacrifique o doador através da hemorragia.
4. Extite o timo para melhorar a visualização dos grandes vasos. Em seguida, remova o coração em bloco com a aorta ascendente até o nível da artéria innominada.

4. Preparação de folhetos de válvula aórtica

1. Coloque o coração doador em uma placa de Petri estéril imediatamente após a cardiectomia. Dissecar o coração do doador em um tampão de armazenamento frio e frio (ver Tabela de Materiais).
2. Usando fórceps e tesouras de mola Vannas, disseca o coração doador até que apenas a raiz aórtica permaneça com um manguito ventricular de 1 mm proximal à válvula aórtica.
3. Abra a válvula aórtica fazendo um corte longitudinal para abrir o Seio de Valsalva entre os seios esquerdo e não-coronário para visualizar os três folhetos.
   NOTA: O corte deve ser todo o comprimento do Sinus de Valsalva. As dimensões reais dependem do tamanho do rato.
4. Extir nosso imposto cada folheto de válvula aórtica individualmente. Especificamente, use fórceps contundentes para agarrar a borda do folheto e use a tesoura de mola Vannas para extirir o folheto cortando de um comissure até o anulo e, em seguida, em direção à próxima comissura.
   NOTA: Tome cuidado especial para apenas agarrar a borda do folheto para minimizar a interrupção das células endoteliais valvulares.
5. Armazene as amostras após a excisão do folheto na solução de tampão de armazenamento gelado até que estejam prontas para serem implantadas no rato receptor. Implante todos os folhetos dentro de 4h de armazenamento frio.

5. Operação do destinatário

1. Prepare-se e anestesia o rato como indicado na etapa 2. Use uma almofada de aquecimento mantida a 36-38 °C para realizar a cirurgia.
2. Administre buprenorfina (0,03 mg/kg subcutâneamente) a todos os ratos receptores antes da cirurgia e a cada 6-12 h pós-operatório conforme necessário para aliviar a dor.
3. Coloque o rato em posição lateral direita para acessar o rim esquerdo.
   NOTA: O rim esquerdo é preferido devido à sua posição mais caudal em relação ao rim direito.
4. Incise a pele sobre o flanco longitudinalmente mais de 1 polegada usando tesouras.
   NOTA: A incisão deve permanecer menor do que o tamanho do rim para proporcionar tensão suficiente para evitar que o rim volte para a cavidade abdominal durante o procedimento.
5. Da mesma forma, inciso a parede abdominal subjacente.
6. Externalizar o rim
   1. Usando o polegar e o indicador, aplique pressão leve dorsal e ventrally ao usar fórceps curvos para levantar o polo caudal do rim através da incisão abdominal e da pele. Externalize a extremidade craniana do rim da mesma forma.
   2. Alternativamente, o rim pode ser externalizado agarrando a gordura perirenal e puxando para cima com a tensão da luz.
      NOTA: Tome cuidado para não compreender diretamente o rim ou os vasos renais.
   3. Uma vez que o rim é externalizado, mantenha-o úmido com soro fisiológico quente escorrendo sobre o rim.
7. Crie um bolso subcapsular.
   1. Aplique levemente pressão na cápsula renal usando um conjunto de fórceps contundentes para que a cápsula renal possa ser claramente distinguida do parenchyma subjacente. Simultaneamente usando outro conjunto de fórceps contundentes, segure cuidadosamente a cápsula e puxe suavemente para cima para criar um orifício na cápsula.
      NOTA: Devido à natureza delicada da cápsula, é necessária força mínima para estabelecer esta incisão.
   2. Continue usando fórceps contundentes para estender a incisão até que um espaço ~2mm tenha sido criado para acomodar o folheto da válvula aórtica.
   3. Desenvolva um bolso subcapsular raso que é ligeiramente maior que o folheto da válvula enquanto levanta a borda da incisão com um conjunto de fórceps e avança uma sonda sem corte sob a cápsula renal.
8. Transplante da válvula aórtica no bolso subcapsular.
   1. Recupere o folheto aórtico do armazenamento frio e coloque-o no campo cirúrgico.
   2. Ao levantar a cápsula fibrosa da borda, avance o folheto aórtico para o bolso subcapsular com fórceps contundentes.
      NOTA: Certifique-se de que o tecido está longe o suficiente da incisão para que esteja firmemente fixado sob a cápsula. Deve-se tomar cuidado para evitar danos ao parenchyma subjacente ou posterior rasgo da cápsula fibrosa.
   3. A incisão na cápsula renal pode ser deixada aberta.
9. Empurre o rim suavemente de volta para sua posição anatômica usando tração contrária aplicada nas bordas de incisão.
10. Feche a incisão abdominal com uma sutura cirúrgica estéril. Feche a pele com grampos.
11. Cuidados pós-operatórios
    1. Após a operação, coloque o rato em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento com acesso a comida e água.
    2. Monitore o animal diariamente para avaliar a cicatrização de feridas de rotina e sinais de dor ou angústia. Remova os grampos após 7-10 dias.

6. Coleta de tecido para análise

1. Em pontos finais selecionados após o transplante, eutanize o animal por exsanguinação. Especificamente, realize uma laparotomia mediana e transecte a aorta abdominal sob 5% de isoflurane em oxigênio.
2. Mobilize o rim e extite-o cortando a artéria renal, veia e ureter com uma tesoura.
   NOTA: Tome cuidado para não entender a área que contém o folheto transplantado.
3. Coloque o rim em formalina durante a noite, incorpore-o em parafina, e se section-o para a coloração desejada. Oriente a amostra com a cápsula renal voltada anteriormente e o parênquim renal voltado posteriormente.

Resultados

Uma representação gráfica do design experimental é fornecida para o modelo de rato (Figura 1). Além disso, uma raiz aórtica dissecada do coração do doador e um folheto de válvula aórtica individual preparado para implantação também é mostrado na Figura 2. Em seguida, uma imagem representativa da posição do folheto da válvula aórtica sob a cápsula renal para implantação é mostrada na Figura 3A e após 3, 7 e 28 ...

Discussão

Importância e aplicações potenciais
Embora as válvulas cardíacas mecânicas e bioprotéticas sejam rotineiramente usadas em pacientes adultos que necessitam de substituição de válvulas, essas válvulas não têm potencial para crescer e, portanto, são subótimas para pacientes pediátricos. O transplante de válvula cardíaca é uma operação experimental projetada para fornecer substituições crescentes de válvulas cardíacas para recém-nascidos e bebês com doença cardíaca congênita....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C