啮齿动物异位心脏瓣膜移植的简化模型

摘要

该协议描述了一种简单有效的方法，用于在肾囊下移植主动脉瓣叶，以允许研究心脏瓣膜的同种异性。

摘要

临床上迫切需要在儿童中生长的心脏瓣膜置换术。心脏瓣膜移植被提议为一种新型移植，具有提供能够体细胞生长的耐用心脏瓣膜的潜力，而不需要抗凝治疗。然而，心脏瓣膜移植的免疫生物学仍未被探索，这凸显了动物模型研究这种新型移植的必要性。已经描述了先前用于异位主动脉瓣移植到腹主动脉中的大鼠模型，尽管它们在技术上具有挑战性且成本高昂。为了应对这一挑战，在啮齿动物中开发了肾囊下移植模型，作为研究心脏瓣膜移植免疫生物学的实用且更直接的方法。在该模型中，收获单个主动脉瓣小叶并将其插入肾囊下间隙。肾脏易于接近，移植的组织安全地包含在血管化良好的囊下空间中，并且可以容纳各种组织大小。此外，由于一只大鼠可以提供三个供体主动脉瓣小叶，而单个肾脏可以为移植组织提供多个位点，因此给定研究所需的大鼠更少。这里描述了移植技术，为研究心脏瓣膜移植的移植免疫学提供了重要的一步。

引言

先天性心脏缺陷是人类最常见的先天性残疾，每年每1000名活产儿中就有7名受到影响¹。与常规植入各种机械和生物假体瓣膜的成年患者不同，儿科患者目前没有瓣膜置换的良好选择。这些传统的植入物没有在受体儿童中生长的潜力。因此，随着儿童的成长，需要病态的再手术来将心脏瓣膜植入物更换为连续更大的版本，受影响的儿童在其一生中通常需要多达五次或更多的心脏直视手术^2，3。研究表明，与年龄较大的儿童相比，婴儿免受干预或死亡的自由度明显较差，60%的心脏瓣膜假体婴儿在初始手术后3年内面临再手术或死亡⁴.因此，迫切需要提供一种能够在儿科患者中生长和维持功能的心脏瓣膜。

几十年来，提供不断增长的心脏瓣膜置换术的尝试一直集中在组织工程和干细胞上。然而，到目前为止，将这些瓣膜移植到诊所的尝试都没有成功^{5，6，7，8}。为了解决这个问题，心脏瓣膜移植被提议作为一种更具创造性的手术，用于提供具有自我修复和避免血栓形成能力的不断增长的心脏瓣膜置换术。而不是移植整个心脏，只有心脏瓣膜被移植，然后与受者的孩子一起生长，类似于传统的心脏移植或Ross肺签名^9，10，11。术后，受者儿童将接受免疫抑制，直到移植的瓣膜可以换成成人大小的机械假体，当不再需要瓣膜的生长时。然而，心脏瓣膜移植移植物的移植生物学仍未被探索。因此，需要动物模型来研究这种新型移植。

先前已经描述了几种大鼠模型将主动脉瓣异位移植到腹主动脉^{12，13，14，15，16，17，18}。然而，这些模型非常棘手，通常需要训练有素的外科医生才能成功操作。此外，它们既昂贵又耗时¹⁹.开发了一种新的大鼠模型，以创建一种更简单的动物模型，用于研究心脏瓣膜移植的免疫生物学。切除单主动脉瓣小叶并将其插入肾囊下间隙。肾脏特别适合研究移植排斥反应，因为它高度血管化，可进入循环免疫细胞^20，21。虽然其他几个人利用肾脏囊下模型来研究其他同种异体移植的移植生物学，如胰腺，肝脏，肾脏和角膜^{22，23，24，25，26，27}，但这是心脏组织移植的第一个描述。这里描述了移植技术，为研究心脏瓣膜移植的移植免疫学提供了重要的一步。

研究方案

该研究根据美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南，由动物研究委员会批准。

1. 动物模型信息（大鼠）

1. 所有外科手术均使用放大倍率高达20倍的手术显微镜（见 材料表）。
2. 根据实验需要使用同源（如刘易斯-刘易斯）或同种异体（如挪威刘易斯-布朗）菌株进行移植。
3. 使用年龄在5-7周之间，体重为100-200克的大鼠，适合实验问题。

2.去除毛皮，准备皮肤和麻醉

1. 在无菌条件下执行所有操作。
   注意:该步骤在专用的手术空间和无菌条件下进行。
2. 将大鼠放入麻醉诱导室中，用氧中5%异氟醚诱导麻醉。在整个过程中用氧气中的3.5%异氟醚维持麻醉。
3. 对于供体操作，使用毛皮剪将大鼠的皮毛从脐部移除到胸骨切口。对于受体手术，将头发夹在从肋骨到骨盆的腋窝后线的手术区域上。接下来，用手术消毒剂准备皮肤。
4. 在开始手术之前获得手术麻醉平面。通过用镊子牢牢地压缩大鼠的脚趾来确认足够的麻醉深度。如果大鼠止痛，根据需要滴定麻醉剂。
5. 在整个过程中临床上监测呼吸频率和麻醉深度;根据需要调整异氟醚的水平，以保持55-65次呼吸/分钟的呼吸速率。

3. 捐赠者操作

1. 按照步骤2所述准备和麻醉大鼠。使用解剖剪刀将皮肤从剑突切到胸骨切口。通过切除胸骨外侧两侧的肋骨进行胸骨切除术，直到达到进入心脏的最佳途径。
2. 用100 U / 100g注射到左心房中肝化大鼠。
3. 通过流血牺牲捐赠者。
4. 切除胸腺以改善大血管的可视化。然后，将心脏与上升的主动脉整体移除，直到无名动脉的水平。

4. 主动脉瓣单的制备

1. 将供体心脏放在心脏切除术后立即的无菌培养皿中。在冰冷的储存缓冲液中解剖供体心脏（见 材料表）。
2. 使用镊子和Vannas弹簧剪刀，解剖供体心脏，直到只有主动脉根部保留，主动脉瓣近端有1毫米的心室袖带。
3. 通过纵向切开打开主动脉瓣，以打开左侧和非冠状动脉窦之间的Valsalva窦，以可视化所有三个小叶。
   注意:切口应该是瓦尔萨尔瓦窦的整个长度。实际尺寸取决于大鼠的大小。
4. 单独切除每个主动脉瓣叶。具体来说，使用钝镊子抓住传单的边缘，并使用Vannas弹簧剪刀从一个副本向下切除小叶，然后向下切到环，然后向下一个副本。
   注意:特别注意仅抓住小叶的边缘，以尽量减少瓣膜内皮细胞的破坏。
5. 将小叶切除后的样品储存在冰冷储存缓冲溶液中，直到它们准备好植入受体大鼠体内。在冷藏4小时内植入所有传单。

5. 收件人操作

1. 按照步骤2所述准备和麻醉大鼠。使用保持在36-38°C的加热垫进行手术。
2. 手术前向所有受体大鼠施用丁丙诺啡（皮下注射0.03mg / kg），术后根据需要每6-12小时一次以减轻疼痛。
3. 将大鼠置于右侧侧卧位以进入左侧肾脏。
   注意:左肾是首选，因为它相对于右肾的尾部位置更多。
4. 用剪刀将皮肤纵向切入两侧，超过1英寸。
   注意:切口必须小于肾脏的大小，以提供足够的张力，以防止肾脏在手术过程中缩回腹腔。
5. 同样，切入下面的腹壁。
6. 肾脏外化
   1. 使用拇指和食指，在背部和腹侧施加轻压，同时使用弯曲的镊子通过腹部和皮肤切口抬起肾脏的尾极。类似地将肾脏的颅端外化。
   2. 或者，肾脏可以通过抓住肾周脂肪并以轻微的张力向上拉来外化。
      注意:注意不要直接抓住肾脏或肾脏血管。
   3. 一旦肾脏外化，用温热的盐水滴到肾脏上保持湿润。
7. 创建一个囊下口袋。
   1. 使用一组钝镊子轻轻地对肾囊施加压力，以便可以清楚地将肾囊与下面的实质区分开来。同时使用另一组钝镊子，小心地抓住胶囊并轻轻向上拉，在胶囊上形成一个洞。
      注意:由于胶囊的微妙性质，建立这个切口需要最小的力。
   2. 继续使用钝镊子延长切口，直到产生约2mm的空间以容纳主动脉瓣叶。
   3. 形成一个比瓣膜小叶稍大的浅囊下袋，同时用一组镊子抬起切口的边缘，并在肾囊下方推进钝探针。
8. 将主动脉瓣移植到囊下袋中。
   1. 从冷藏库中取出主动脉瓣传单并将其放置在手术室中。
   2. 在抬起边缘纤维囊的同时，用钝镊子将主动脉瓣小叶推进到包膜下袋中。
      注意:确保组织离切口足够远，以便将其牢固地固定在胶囊下方。应注意避免损伤下层实质或纤维囊的进一步撕裂。
   3. 肾囊中的切口可以保持打开状态。
9. 使用施加在切口边缘的反向牵引力将肾脏轻轻推回其解剖位置。
10. 用运行的无菌手术缝合线关闭腹部切口。用订书钉闭合皮肤。
11. 术后护理
    1. 手术后，将老鼠放在干净的笼子里，放在加热垫上，以获得食物和水。
    2. 每天监测动物，以评估常规伤口愈合和疼痛或痛苦的迹象。7-10天后取下订书钉。

6. 收集用于分析的组织

1. 在移植后的选定终点，通过放血对动物实施安乐死。具体而言，进行正中剖腹手术，并在氧中异氟醚低于5%的腹主动脉。
2. 动员肾脏，并用剪刀切开肾动脉、静脉和输尿管。
   注意:注意不要抓住包含移植传单的区域。
3. 将肾脏置于福尔马林中过夜，将其包埋在石蜡中，然后将其切片以进行所需的染色。标本的方向为肾囊朝前，肾实质朝后。

结果

为大鼠模型提供了实验设计的图形描述（图1）。此外，从供体心脏解剖的主动脉根部和准备植入的单个主动脉瓣叶也如图2所示。接下来，图3A显示了主动脉瓣叶在肾囊下植入的位置的代表性图像，并在受体大鼠内3，7和28天后（图3B-D），表明易于定位和恢复移植的组织。

讨论

重要性和潜在应用
虽然机械和生物假体心脏瓣膜常规用于需要瓣膜置换术的成年患者，但这些瓣膜缺乏生长潜力，因此对于儿科患者来说并不理想。心脏瓣膜移植是一项实验性手术，旨在为患有先天性心脏病的新生儿和婴儿提供不断增长的心脏瓣膜置换术。然而，与传统心脏移植的移植免疫生物学不同，这种新型移植的移植免疫生物学仍然没有得到很好的探索。本文介绍了一种独?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C