Упрощенная модель трансплантации гетеротопного клапана сердца у грызунов

Резюме

Этот протокол описывает простой и эффективный метод трансплантации листочков аортального клапана под почечную капсулу, чтобы позволить исследовать аллореактивность сердечных клапанов.

Аннотация

Существует острая клиническая потребность в замене сердечного клапана, которая может расти у детей. Трансплантация сердечного клапана предлагается в качестве нового типа трансплантации с потенциалом доставки прочных сердечных клапанов, способных к соматическому росту без необходимости антикоагуляции. Тем не менее, иммунобиология трансплантации сердечных клапанов остается неисследованной, подчеркивая необходимость животных моделей для изучения этого нового типа трансплантации. Предыдущие модели крыс для трансплантации гетеротопного аортального клапана в брюшную аорту были описаны, хотя они технически сложны и дорогостоящи. Для решения этой проблемы была разработана модель субкапсулярной трансплантации почек у грызунов в качестве практического и более простого метода изучения иммунобиологии трансплантации сердечного клапана. В этой модели один листок аортального клапана собирается и вводится в почечное субкапсулярное пространство. Почка легко доступна, а пересаженная ткань надежно содержится в субкапсулярном пространстве, которое хорошо васкуляризировано и может вместить различные размеры тканей. Кроме того, поскольку одна крыса может предоставить три донорских листочка аорты, а одна почка может обеспечить несколько участков для пересаженной ткани, для данного исследования требуется меньше крыс. Здесь описана методика трансплантации, обеспечивающая значительный шаг вперед в изучении трансплантатной иммунологии трансплантации сердечного клапана.

Введение

Врожденные пороки сердца являются наиболее распространенной врожденной инвалидностью у людей, затрагивая 7 из 1000 живорожденных детей каждый год¹. В отличие от взрослых пациентов, у которых регулярно имплантируются различные механические и биопротезные клапаны, педиатрические пациенты в настоящее время не имеют хороших вариантов для замены клапанов. Эти обычные имплантаты не имеют потенциала для роста у детей-реципиентов. В результате, болезненные повторные операции требуются для замены имплантатов сердечного клапана на последовательно более крупные версии по мере роста детей, причем пострадавшим детям часто требуется до пяти или более операций на открытом сердце в течение их жизни ^2,3. Исследования показали, что свобода от вмешательства или смерти значительно хуже для младенцев, чем для детей старшего возраста, причем 60% младенцев с протезными клапанами сердца сталкиваются с повторной операцией или смертью в течение 3 лет после их первоначальной операции⁴. Поэтому существует острая необходимость в доставке сердечного клапана, который может расти и поддерживать функцию у педиатрических пациентов.

На протяжении десятилетий попытки доставить растущие заменители сердечных клапанов были сосредоточены на тканевой инженерии и стволовых клетках. Однако попытки перевести эти клапаны в клинику пока не увенчались успехом 5,6,7,8. Для решения этой проблемы трансплантация сердечного клапана предлагается как более творческая операция для доставки растущих замен сердечных клапанов, обладающих способностью к самовосстановлению и предотвращению тромбогенеза. Вместо того, чтобы пересаживать все сердце, пересаживается только сердечный клапан, который затем будет расти вместе с ребенком-реципиентом, подобно обычным пересадкам сердца или легочному автографу Росса ^9,10,11. После операции дети-реципиенты будут получать иммуносупрессию до тех пор, пока пересаженный клапан не будет заменен на механический протез взрослого размера, когда рост клапана больше не требуется. Тем не менее, биология трансплантации трансплантатов сердечного клапана остается неисследованной. Поэтому для изучения этого нового типа трансплантации необходимы животные модели.

Несколько моделей крыс были ранее описаны для гетеротопной трансплантации аортального клапана в брюшную аорту 12,13,14,15,16,17,18. Тем не менее, эти модели непомерно сложны, часто требуя обученных хирургов для успешной работы. Кроме того, они являются дорогостоящими и трудоемкими¹⁹. Новая модель крысы была разработана для создания более простой животной модели для изучения иммунобиологии трансплантации сердечных клапанов. Створки одиночного аортального клапана иссекают и вставляют в почечное субкапсулярное пространство. Почка особенно подходит для изучения отторжения трансплантата, так как она сильно васкуляризирована с доступом к циркулирующим иммунным клеткам^20,21. В то время как некоторые другие использовали почечную субкапсулярную модель для изучения биологии трансплантации других трансплантатов аллотрансплантатов, таких как поджелудочная железа, печень, почки и^{роговица} 22,23,24,25,26,27, это первое описание трансплантации сердечной ткани в этом положении. Здесь описана методика трансплантации, обеспечивающая значительный шаг вперед в изучении трансплантатной иммунологии трансплантации сердечного клапана.

протокол

Исследование было одобрено Комитетом по исследованиям животных в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Информация о животной модели (Крысы)

1. Используйте операционный микроскоп (см. Таблицу материалов) с увеличением до 20 раз для всех хирургических процедур.
2. Используйте сингенные (например, Льюис-Льюис) или аллогенные (например, Льюис-Браун Норвегия) штаммы для трансплантации по мере необходимости для эксперимента.
3. Используют крыс возрастом от 5-7 недель и массой тела 100-200 г, которые подходят для экспериментального вопроса.

2. Удаление шерсти, подготовка кожи и анестезия

1. Выполнять все операции в стерильных условиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этап выполняется в специальном хирургическом помещении и в стерильных условиях.
2. Поместите крыс в индукционную камеру анестезии и индуцируйте анестезию с 5% изофлурана в кислороде. Поддерживайте анестезию с 3,5% изофлурана в кислороде на протяжении всей процедуры.
3. Для донорской операции удалите шерсть крысы от пупка до грудинной выемки с помощью меховых кусачек. Для операции реципиента обрежьте волосы над хирургическим полем на задней подмышечной линии от ребер до таза. Далее подготовьте кожу хирургическим дезинфицирующим средством.
4. Получите хирургическую плоскость анестезии перед началом процедуры. Подтвердите адекватную глубину анестезии, крепко сдавив пальцы ног крысы щипцами. Если крыса уходит от боли, титруйте анестетик по мере необходимости.
5. Контролировать частоту дыхания и глубину анестезии клинически на протяжении всей процедуры; уровень изофлурана регулируют по мере необходимости для поддержания частоты дыхания 55-65 вдохов/мин.

3. Донорская операция

1. Подготовьте и обезболите крысу, как указано в шаге 2. Разрезайте кожу от мечевидной до грудинной выемки с помощью рассекающих ножниц. Выполните стернэктомию, разрезав ребра с каждой стороны сбоку от грудины до тех пор, пока не будет достигнут оптимальный доступ к сердцу.
2. Гепаринизировать крысу инъекцией 100 Ед/100 г в левое предсердие.
3. Принесите донора в жертву через экссангинацию.
4. Иссечение тимуса для улучшения визуализации крупных сосудов. Затем удаляют сердце блоком с восходящей аорты до уровня безымянной артерии.

4. Подготовка листовок аортального клапана

1. Поместите донорское сердце в стерильную чашку Петри сразу после кардиэктомии. Рассечение донорского сердца в ледяном буфере холодного хранения (см. Таблицу материалов).
2. Используя щипцы и пружинные ножницы Vannas, рассекайте донорское сердце до тех пор, пока не останется только корень аорты с 1 мм желудочковой манжетой проксимально к аортальному клапану.
3. Откройте аортальный клапан, сделав продольный разрез, чтобы открыть синус Вальсальвы между левой и некоронической пазухами, чтобы визуализировать все три листочка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен быть по всей длине синуса Вальсальвы. Фактические размеры зависят от размера крысы.
4. Иссейте каждую створку аортального клапана по отдельности. В частности, используйте тупые щипцы, чтобы схватить край листка, и используйте пружинные ножницы Vannas, чтобы иссечь листок, разрезая от одной комиссуры до кольцевого кольца, а затем к следующему комиссару.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны, чтобы захватить только край листка, чтобы свести к минимуму разрушение клапанных эндотелиальных клеток.
5. Храните образцы после иссечения листовок в буферном растворе холодного хранения до тех пор, пока они не будут готовы к имплантации крысе-реципиенту. Имплантируйте все листочки в течение 4 часов после холодного хранения.

5. Операция с получателем

1. Подготовьте и обезболите крысу, как указано в шаге 2. Используйте грелку при температуре 36-38 °C для выполнения операции.
2. Вводят бупренорфин (0,03 мг/кг подкожно) всем крысам-реципиентам перед операцией и каждые 6-12 ч после операции по мере необходимости для облегчения боли.
3. Поместите крысу в правое боковое лежачее положение, чтобы получить доступ к левой почке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Левая почка предпочтительна из-за ее более каудального положения относительно правой почки.
4. Разрезайте кожу по бокам продольно более 1 дюйма с помощью ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен оставаться меньше размера почки, чтобы обеспечить достаточное напряжение, чтобы предотвратить втягивание почки обратно в брюшную полость во время процедуры.
5. Аналогично разрезать нижележащую брюшную стенку.
6. Экстернализация почек
   1. Используя большой и указательный пальцы, применяйте легкое давление дорсально и вентрально, используя изогнутые щипцы, чтобы поднять каудальный полюс почки через брюшной и кожный разрез. Аналогичным образом экстернализуют краниальный конец почки.
   2. Альтернативно, почка может быть экстернализована путем захвата периренального жира и вытягивания вверх с легким напряжением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не захватывать почку или почечные сосуды напрямую.
   3. Как только почка будет экстернализована, держите ее влажной с теплым физиологическим раствором, просачивающимся на почку.
7. Создайте подкапсулярный карман.
   1. Слегка надавите на почечную капсулу с помощью одного набора тупых щипцов, чтобы почечную капсулу можно было четко отличить от нижележащей паренхимы. Одновременно используя еще один набор тупых щипцов, осторожно схватите капсулу и осторожно потяните вверх, чтобы создать отверстие в капсуле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за деликатного характера капсулы требуется минимальное усилие для установки этого разреза.
   2. Продолжайте использовать тупые щипцы для расширения разреза до тех пор, пока не будет создано пространство ~ 2 мм для размещения листа аортального клапана.
   3. Развивайте неглубокий субкапсулярный карман, который немного больше, чем створка клапана, поднимая край разреза одним набором щипцов и продвигая тупой зонд под почечной капсулой.
8. Пересадите аортальный клапан в подкапсулярный карман.
   1. Извлеките листок аорты из холодного хранилища и поместите его в хирургическое поле.
   2. Поднимая край волокнистой капсулы, выдвиньте листок аорты в субкапсулярный карман тупыми щипцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань находится достаточно далеко от разреза, чтобы она прочно закрепилась под капсулой. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать повреждения нижележащей паренхимы или дальнейшего разрыва фиброзной капсулы.
   3. Разрез в почечной капсуле можно оставить открытым.
9. Осторожно верните почку обратно в анатомическое положение, используя встречное вытяжение, приложенное к краям разреза.
10. Закройте разрез брюшной полости бегущим стерильным хирургическим швом. Закройте кожу скобами.
11. Послеоперационный уход
    1. После операции поместите крысу в чистую клетку на грелку с доступом к пище и воде.
    2. Ежедневно контролируйте животное, чтобы оценить регулярное заживление ран и признаки боли или дистресса. Удалите скобы через 7-10 дней.

6. Сбор ткани для анализа

1. В выбранных конечных точках после трансплантации усыпляют животное путем экссангинации. В частности, выполняют срединную лапаротомию и трансецируют брюшную аорту под 5% изофлурана в кислороде.
2. Мобилизуйте почку и иссекните ее, разрезав ножницами почечную артерию, вену и мочеточник.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не захватить область, содержащую пересаженный листок.
3. Поместите почку в формалин на ночь, вставьте ее в парафин и разделите для нужного окрашивания. Ориентируйте образец с почечной капсулой, обращенной к передней части, и паренхимой почки, обращенной кзади.

Результаты

Графическое изображение экспериментальной конструкции предусмотрено для модели крысы (рисунок 1). Кроме того, корень аорты, рассеченный из сердца донора, и индивидуальный листок аортального клапана, подготовленный для имплантации, также показаны на рисунке ...

Обсуждение

Важность и потенциальные области применения
В то время как механические и биопротезные сердечные клапаны обычно используются у взрослых пациентов, нуждающихся в замене клапанов, эти клапаны не имеют потенциала для роста и, следовательно, являются неоптимальными для педиат?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C