Un modello semplificato per il trapianto di valvole cardiache eterotopiche nei roditori

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente per il trapianto di foglietti valvolari aortici sotto la capsula renale per consentire lo studio dell'alloreattività delle valvole cardiache.

Abstract

C'è un urgente bisogno clinico di sostituzioni delle valvole cardiache che possono crescere nei bambini. Il trapianto di valvole cardiache è proposto come un nuovo tipo di trapianto con il potenziale per fornire valvole cardiache durevoli in grado di crescere somaticamente senza necessità di anticoagulazione. Tuttavia, l'immunobiologia dei trapianti di valvole cardiache rimane inesplorata, evidenziando la necessità di modelli animali per studiare questo nuovo tipo di trapianto. Sono stati descritti precedenti modelli di ratto per il trapianto di valvola aortica eterotopica nell'aorta addominale, sebbene siano tecnicamente impegnativi e costosi. Per affrontare questa sfida, è stato sviluppato un modello di trapianto sottocapsulare renale nei roditori come metodo pratico e più semplice per studiare l'immunobiologia del trapianto di valvole cardiache. In questo modello, un singolo foglietto della valvola aortica viene raccolto e inserito nello spazio sottocapsulare renale. Il rene è facilmente accessibile e il tessuto trapiantato è contenuto in modo sicuro in uno spazio sottocapsulare che è ben vascolarizzato e può ospitare una varietà di dimensioni del tessuto. Inoltre, poiché un singolo ratto può fornire tre foglietti aortici donatori e un singolo rene può fornire più siti per il tessuto trapiantato, sono necessari meno ratti per un determinato studio. Qui viene descritta la tecnica del trapianto, fornendo un significativo passo avanti nello studio dell'immunologia del trapianto di valvole cardiache.

Introduzione

I difetti cardiaci congeniti sono la disabilità congenita più comune negli esseri umani, che colpisce 7 su 1.000 bambini nati vivi ogni anno¹. A differenza dei pazienti adulti in cui vengono impiantate di routine varie valvole meccaniche e bioprotesiche, i pazienti pediatrici attualmente non hanno buone opzioni per la sostituzione della valvola. Questi impianti convenzionali non hanno il potenziale per crescere nei bambini riceventi. Di conseguenza, sono necessarie ri-operazioni morbose per scambiare gli impianti della valvola cardiaca con versioni successive più grandi man mano che i bambini crescono, con i bambini affetti che spesso richiedono fino a cinque o più interventi chirurgici a cuore aperto nella loro vita ^2,3. Gli studi hanno dimostrato che la libertà dall'intervento o dalla morte è significativamente scarsa per i neonati rispetto ai bambini più grandi, con il 60% dei neonati con valvole cardiache protesiche che affrontano il rinogomento o la morte entro 3 anni dalla loro operazione iniziale⁴. Pertanto, vi è un urgente bisogno di fornire una valvola cardiaca in grado di crescere e mantenere la funzione nei pazienti pediatrici.

Per decenni, i tentativi di fornire sostituzioni delle valvole cardiache in crescita sono stati incentrati sull'ingegneria tissutale e sulle cellule staminali. Tuttavia, i tentativi di tradurre queste valvole nella clinica non hanno avuto successo finora 5,6,7,8. Per affrontare questo problema, un trapianto di valvole cardiache viene proposto come un'operazione più creativa per fornire sostituzioni della valvola cardiaca in crescita che hanno la capacità di autoripararsi ed evitare la trombogenesi. Invece di trapiantare l'intero cuore, solo la valvola cardiaca viene trapiantata e crescerà con il bambino ricevente, simile ai trapianti di cuore convenzionali o a un autografo polmonare di Ross ^9,10,11. Post-operatoriamente, i bambini riceventi riceveranno immunosoppressione fino a quando la valvola trapiantata non può essere sostituita con una protesi meccanica di dimensioni adulte quando la crescita della valvola non è più necessaria. Tuttavia, la biologia dei trapianti di trapianto di valvole cardiache rimane inesplorata. Pertanto, sono necessari modelli animali per studiare questo nuovo tipo di trapianto.

Diversi modelli di ratto sono stati precedentemente descritti per il trapianto eterotopico della valvola aortica nell'aorta addominale 12,13,14,15,16,17,18. Tuttavia, questi modelli sono proibitivamente complicati, spesso richiedono chirurghi addestrati per operare con successo. Inoltre, sono costosi e richiedono molto tempo¹⁹. Un nuovo modello di ratto è stato sviluppato per creare un modello animale più semplice per studiare l'immunobiologia dei trapianti di valvole cardiache. I singoli lembi della valvola aortica vengono asportati e inseriti nello spazio sottocapsulare renale. Il rene è particolarmente adatto per studiare il rigetto del trapianto in quanto è altamente vascolarizzato con accesso alle cellule immunitarie circolanti^20,21. Mentre molti altri hanno utilizzato un modello sottocapsulare renale per studiare la biologia del trapianto di altri trapianti di allotrapianto come pancreas, fegato, rene e cornea ^{22,23,24,25,26,27}, questa è la prima descrizione del trapianto di tessuto cardiaco in questa posizione. Qui viene descritta la tecnica del trapianto, fornendo un significativo passo avanti nello studio dell'immunologia del trapianto di valvole cardiache.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato di ricerca sugli animali a seguito della Guida nazionale degli istituti di salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Informazioni sul modello animale (Ratti)

1. Utilizzare un microscopio operatorio (vedi Tabella dei materiali) con ingrandimento fino a 20x per tutte le procedure chirurgiche.
2. Utilizzare ceppi singenici (come Lewis-Lewis) o allogenici (come Lewis-Brown Norway) per i trapianti secondo necessità per l'esperimento.
3. Utilizzare ratti di età compresa tra 5-7 settimane e peso corporeo di 100-200 g che sono appropriati per la domanda sperimentale.

2. Rimozione della pelliccia, preparazione della pelle e anestesia

1. Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili.
   NOTA: Il passaggio viene eseguito in uno spazio chirurgico dedicato e in condizioni sterili.
2. Posizionare i ratti in una camera di induzione anestetica e indurre l'anestesia con il 5% di isoflurano in ossigeno. Mantenere l'anestesia con il 3,5% di isoflurano in ossigeno durante tutta la procedura.
3. Per l'operazione del donatore, rimuovere la pelliccia del ratto dall'ombelico alla tacca sternale usando tagliacapelli. Per l'operazione ricevente, tagliare i capelli sul campo chirurgico sulla linea ascellare posteriore dalle costole al bacino. Quindi, preparare la pelle con un disinfettante chirurgico.
4. Ottenere un piano chirurgico di anestesia prima di iniziare la procedura. Confermare un'adeguata profondità di anestesia comprimendo saldamente le dita dei piedi del ratto con una pinza. Se il ratto si ritira al dolore, titolare l'anestetico secondo necessità.
5. Monitorare clinicamente la frequenza respiratoria e la profondità dell'anestesia durante la procedura; il livello di isoflurano viene regolato secondo necessità per mantenere una frequenza respiratoria di 55-65 respiri/min.

3. Operazione del donatore

1. Preparare e anestetizzare il ratto come indicato nel passaggio 2. Incidere la pelle dallo xifoide alla tacca sternale usando le forbici di dissezione. Eseguire una sternectomia tagliando le costole su ciascun lato lateralmente allo sterno fino a raggiungere un accesso ottimale al cuore.
2. Eparino il ratto con 100 U/100 g di iniezione nell'atrio sinistro.
3. Sacrifica il donatore attraverso il dissanguamento.
4. Asportare il timo per migliorare la visualizzazione dei grandi vasi. Quindi, rimuovere il cuore in blocco con l'aorta ascendente fino al livello dell'arteria innominata.

4. Preparazione dei foglietti della valvola aortica

1. Mettere il cuore donatore in una capsula di Petri sterile immediatamente dopo la cardiectomia. Sezionare il cuore del donatore in un tampone di conservazione a freddo ghiacciato (vedere Tabella dei materiali).
2. Usando pinze e forbici a molla Vannas, sezionare il cuore del donatore fino a quando rimane solo la radice aortica con un bracciale ventricolare di 1 mm prossimale alla valvola aortica.
3. Aprire la valvola aortica effettuando un taglio longitudinale per aprire il seno di Valsalva tra i seni sinistro e non coronarico per visualizzare tutti e tre i volantini.
   NOTA: Il taglio deve essere dell'intera lunghezza del seno di Valsalva. Le dimensioni effettive dipendono dalle dimensioni del ratto.
4. Asportare singolarmente ogni foglietto della valvola aortica. In particolare, utilizzare pinze smussate per afferrare il bordo del volantino e utilizzare le forbici a molla Vannas per asportare il volantino tagliando da una commessura fino all'anulus, e poi verso la commessura successiva.
   NOTA: Prestare particolare attenzione a cogliere solo il bordo del foglietto illustrativo per ridurre al minimo l'interruzione delle cellule endoteliali valvolari.
5. Conservare i campioni dopo l'escissione del foglio illustrativo in soluzione tampone di conservazione ghiacciata fino a quando non sono pronti per essere impiantati nel ratto ricevente. Impiantare tutti i foglietti entro 4 ore dalla conservazione a freddo.

5. Operazione del destinatario

1. Preparare e anestetizzare il ratto come indicato nel passaggio 2. Utilizzare una piastra riscaldante mantenuta a 36-38 °C per eseguire l'intervento chirurgico.
2. Somministrare buprenorfina (0,03 mg/kg per via sottocutanea) a tutti i ratti riceventi prima dell'intervento chirurgico e ogni 6-12 ore post-operatoriamente secondo necessità per alleviare il dolore.
3. Posizionare il ratto in una posizione sdraiata laterale destra per accedere al rene sinistro.
   NOTA: Il rene sinistro è preferito a causa della sua posizione più caudale rispetto al rene destro.
4. Incidere la pelle sul fianco longitudinalmente oltre 1 pollice usando le forbici.
   NOTA: L'incisione deve rimanere più piccola della dimensione del rene per fornire una tensione sufficiente per impedire al rene di ritrarsi nella cavità addominale durante la procedura.
5. Allo stesso modo, incidere la parete addominale sottostante.
6. Esternalizzare il rene
   1. Usando il pollice e l'indice, applicare una leggera pressione dorsale e ventrale mentre si utilizza una pinza curva per sollevare il polo caudale del rene attraverso l'incisione addominale e cutanea. Esternalizzare l'estremità cranica del rene in modo simile.
   2. In alternativa, il rene può essere esternalizzato afferrando il grasso perirenale e tirando verso l'alto con leggera tensione.
      NOTA: Fare attenzione a non afferrare direttamente il rene o i vasi renali.
   3. Una volta che il rene è esternalizzato, tenerlo umido con soluzione salina calda gocciolata sul rene.
7. Creare una tasca sottocapsulare.
   1. Applicare leggermente la pressione sulla capsula renale utilizzando una serie di pinze smussate in modo che la capsula renale possa essere chiaramente distinta dal parenchima sottostante. Contemporaneamente utilizzando un altro set di pinze smussate, afferrare con attenzione la capsula e tirare delicatamente verso l'alto per creare un foro nella capsula.
      NOTA: A causa della natura delicata della capsula, è necessaria una forza minima per stabilire questa incisione.
   2. Continuare a utilizzare pinze smussate per estendere l'incisione fino a quando non è stato creato uno spazio di ~ 2 mm per ospitare il lembo della valvola aortica.
   3. Sviluppare una tasca sottocapsulare poco profonda che sia leggermente più grande del lembo della valvola mentre si solleva il bordo dell'incisione con una serie di pinze e si avanza una sonda smussata sotto la capsula renale.
8. Trapiantare la valvola aortica nella tasca sottocapsulare.
   1. Recuperare il foglietto aortico dalla cella frigorifera e posizionarlo nel campo chirurgico.
   2. Mentre si solleva la capsula fibrosa del bordo, far avanzare il foglietto aortico nella tasca sottocapsulare con pinza smussata.
      NOTA: Assicurarsi che il tessuto sia abbastanza lontano dall'incisione in modo che sia saldamente fissato sotto la capsula. Bisogna fare attenzione per evitare danni al parenchima sottostante o ulteriori strappi della capsula fibrosa.
   3. L'incisione nella capsula renale può essere lasciata aperta.
9. Spingere delicatamente il rene nella sua posizione anatomica usando la controtrazione applicata ai bordi dell'incisione.
10. Chiudere l'incisione addominale con una sutura chirurgica sterile in esecuzione. Chiudere la pelle con le graffette.
11. Assistenza post-operatoria
    1. Dopo l'operazione, posizionare il topo in una gabbia pulita su una piastra riscaldante con accesso a cibo e acqua.
    2. Monitorare l'animale ogni giorno per valutare la guarigione delle ferite di routine e segni di dolore o angoscia. Rimuovere le graffette dopo 7-10 giorni.

6. Raccolta del tessuto per l'analisi

1. A endpoint selezionati dopo il trapianto, l'eutanasia dell'animale mediante dissanguamento. In particolare, eseguire una laparotomia mediana e transettare l'aorta addominale sotto il 5% di isoflurano in ossigeno.
2. Mobilitare il rene e asportare tagliando l'arteria renale, la vena e l'uretere con le forbici.
   NOTA: Fare attenzione a non afferrare l'area contenente il foglietto illustrativo trapiantato.
3. Posizionare il rene in formalina durante la notte, incorporarlo nella paraffina e sezionarlo per la colorazione desiderata. Orientare il campione con la capsula renale rivolta anteriormente e il parenchima renale rivolto posteriormente.

Risultati

Una rappresentazione grafica del disegno sperimentale è fornita per il modello di ratto (Figura 1). Inoltre, una radice aortica sezionata dal cuore del donatore e un singolo foglietto della valvola aortica preparato per l'impianto sono mostrati anche nella Figura 2. Successivamente, un'immagine rappresentativa della posizione del foglietto della valvola aortica sotto la capsula renale per l'impianto è mostrata nella Figura 3A e do...

Discussione

Importanza e potenziali applicazioni
Mentre le valvole cardiache meccaniche e bioprotesiche sono abitualmente utilizzate nei pazienti adulti che richiedono la sostituzione della valvola, queste valvole non hanno il potenziale per crescere e, quindi, non sono ottimali per i pazienti pediatrici. Il trapianto di valvole cardiache è un'operazione sperimentale progettata per fornire sostituzioni valvolari cardiache in crescita per neonati e neonati con cardiopatia congenita. Tuttavia, a differenza dell'im...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C