Un modèle simplifié pour la transplantation valvulaire cardiaque hétérotopique chez les rongeurs

Résumé

Ce protocole décrit une méthode simple et efficace pour la transplantation de feuillets valvulaires aortiques sous la capsule rénale afin de permettre l’étude de l’alloréactivité des valves cardiaques.

Résumé

Il existe un besoin clinique urgent de remplacements valvulaires cardiaques qui peuvent se développer chez les enfants. La transplantation valvulaire cardiaque est proposée comme un nouveau type de greffe avec le potentiel de fournir des valves cardiaques durables capables de croissance somatique sans avoir besoin d’anticoagulation. Cependant, l’immunobiologie des greffes de valve cardiaque reste inexplorée, soulignant la nécessité pour des modèles animaux d’étudier ce nouveau type de greffe. Des modèles antérieurs chez le rat pour la transplantation de valve aortique hétérotopique dans l’aorte abdominale ont été décrits, bien qu’ils soient techniquement difficiles et coûteux. Pour relever ce défi, un modèle de greffe sous-capsulaire rénale a été développé chez les rongeurs comme une méthode pratique et plus simple pour étudier l’immunobiologie de la transplantation valvulaire cardiaque. Dans ce modèle, une seule feuillet valvulaire aortique est récoltée et insérée dans l’espace sous-capsulaire rénal. Le rein est facilement accessible et le tissu transplanté est solidement contenu dans un espace sous-capsulaire bien vascularisé et pouvant accueillir une variété de tailles de tissus. De plus, comme un seul rat peut fournir trois folioles aortiques de donneur et qu’un seul rein peut fournir plusieurs sites pour les tissus transplantés, moins de rats sont nécessaires pour une étude donnée. Ici, la technique de transplantation est décrite, offrant une étape importante dans l’étude de l’immunologie de la transplantation de valve cardiaque.

Introduction

Les malformations cardiaques congénitales sont l’incapacité congénitale la plus courante chez l’homme, touchant 7 enfants nés sur 1 000 chaque année¹. Contrairement aux patients adultes chez lesquels diverses valves mécaniques et bioprothétiques sont systématiquement implantées, les patients pédiatriques n’ont actuellement pas de bonnes options pour le remplacement de la valve. Ces implants conventionnels n’ont pas le potentiel de grandir chez les enfants receveurs. En conséquence, des réopérations morbides sont nécessaires pour échanger les implants valvulaires cardiaques contre des versions successivement plus grandes à mesure que les enfants grandissent, les enfants affectés nécessitant souvent jusqu’à cinq chirurgies à cœur ouvert ou plus au cours de leur vie ^2,3. Des études ont montré que l’absence d’intervention ou de décès est significativement plus faible pour les nourrissons que pour les enfants plus âgés, avec 60% des nourrissons avec des valves cardiaques prothétiques faisant face à une nouvelle opération ou à la mort dans les 3 ans suivant leur opération initiale⁴. Par conséquent, il est urgent de délivrer une valve cardiaque capable de se développer et de maintenir sa fonction chez les patients pédiatriques.

Pendant des décennies, les tentatives de remplacement des valves cardiaques en croissance ont été centrées sur l’ingénierie tissulaire et les cellules souches. Cependant, les tentatives de traduction de ces valves à la clinique ont été infructueuses ^jusqu’à présent 5,6,7,8. Pour résoudre ce problème, une transplantation de valve cardiaque est proposée comme une opération plus créative pour fournir des remplacements valvulaires cardiaques en croissance ayant la capacité de s’auto-réparer et d’éviter la thrombogenèse. Au lieu de transplanter tout le cœur, seule la valve cardiaque est transplantée et grandira ensuite avec l’enfant receveur, semblable aux transplantations cardiaques conventionnelles ou à un autographe pulmonaire Ross ^9,10,11. Après l’opération, les enfants receveurs recevront une immunosuppression jusqu’à ce que la valve transplantée puisse être échangée contre une prothèse mécanique de taille adulte lorsque la croissance de la valve n’est plus nécessaire. Cependant, la biologie de la transplantation des greffes de valve cardiaque reste inexplorée. Par conséquent, des modèles animaux sont nécessaires pour étudier ce nouveau type de greffe.

Plusieurs modèles de rats ont déjà été décrits pour la transplantation hétérotopique de la valve aortique dans l’aorte abdominale 12,13,14,15,16,17,18. Cependant, ces modèles sont extrêmement délicats, nécessitant souvent des chirurgiens formés pour opérer avec succès. De plus, ils sont coûteux et prennent beaucoup de temps¹⁹. Un nouveau modèle de rat a été développé pour créer un modèle animal plus simple pour étudier l’immunobiologie des greffes de valve cardiaque. Des feuillets valvulaires aortiques simples sont excisés et insérés dans l’espace sous-capsulaire rénal. Le rein est particulièrement adapté à l’étude du rejet de greffe car il est fortement vascularisé avec un accès aux cellules immunitaires circulantes^20,21. Alors que plusieurs autres ont utilisé un modèle sous-capsulaire rénal pour étudier la biologie de la transplantation d’autres greffes telles que le pancréas, le foie, les reins et la cornée 22,23,24,25,26,27, il s’agit de la première description de la transplantation de tissu cardiaque dans cette position. Ici, la technique de transplantation est décrite, offrant une étape importante dans l’étude de l’immunologie de la transplantation de valve cardiaque.

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité de recherche animale à la suite du Guide des nationals de santé pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Informations sur le modèle animal (rats)

1. Utilisez un microscope opératoire (voir tableau des matériaux) avec un grossissement jusqu’à 20x pour toutes les interventions chirurgicales.
2. Utilisez des souches syngéniques (telles que Lewis-Lewis) ou allogéniques (telles que Lewis-Brown Norway) pour les greffes au besoin de l’expérience.
3. Utilisez des rats âgés de 5 à 7 semaines et d’un poids corporel de 100 à 200 g appropriés pour la question expérimentale.

2. Enlèvement de la fourrure, préparation de la peau et anesthésie

1. Effectuer toutes les opérations dans des conditions stériles.
   REMARQUE: L’étape est effectuée dans un espace chirurgical dédié et dans des conditions stériles.
2. Placez les rats dans une chambre d’induction anesthésique et induisez une anesthésie avec 5% d’isoflurane dans l’oxygène. Maintenir l’anesthésie avec 3,5% d’isoflurane dans l’oxygène tout au long de la procédure.
3. Pour l’opération du donneur, retirez la fourrure du rat de l’ombilic à l’encoche sternale à l’aide de tondeuses à fourrure. Pour l’opération receveuse, clipser les cheveux sur le champ chirurgical à la ligne axillaire postérieure des côtes au bassin. Ensuite, préparez la peau avec un désinfectant chirurgical.
4. Obtenir un plan chirurgical d’anesthésie avant de commencer la procédure. Confirmez une profondeur d’anesthésie adéquate en comprimant fermement les orteils du rat avec une pince. Si le rat se retire à cause de la douleur, titrez l’anesthésique au besoin.
5. Surveiller cliniquement la fréquence respiratoire et la profondeur de l’anesthésie tout au long de la procédure; le niveau d’isoflurane est ajusté au besoin pour maintenir un rythme respiratoire de 55 à 65 respirations / min.

3. Opération du donateur

1. Préparez et anesthésiquez le rat comme indiqué à l’étape 2. Inciser la peau du xiphoïde à l’encoche sternale à l’aide de ciseaux disséquants. Effectuez une sternectomie en coupant les côtes de chaque côté latéral au sternum jusqu’à ce qu’un accès optimal au cœur soit obtenu.
2. Hépariniser le rat avec une injection de 100 U/100 g dans l’oreillette gauche.
3. Sacrifiez le donneur par exsanguination.
4. Excisez le thymus pour améliorer la visualisation des grands vaisseaux. Ensuite, retirez le cœur en bloc avec l’aorte ascendante jusqu’au niveau de l’artère nominale.

4. Préparation des feuillets de la valve aortique

1. Placez le cœur du donneur dans une boîte de Petri stérile immédiatement après la cardiectomie. Disséquez le cœur du donneur dans un tampon d’entreposage frigorifique glacé (voir tableau des matériaux).
2. À l’aide de pinces et de ciseaux à ressort Vannas, disséquez le cœur du donneur jusqu’à ce qu’il ne reste que la racine aortique avec un brassard ventriculaire de 1 mm proximal à la valve aortique.
3. Ouvrez la valve aortique en faisant une coupe longitudinale pour ouvrir le sinus de Valsalva entre les sinus gauche et non coronaire pour visualiser les trois folioles.
   REMARQUE: La coupe doit être sur toute la longueur du sinus de Valsalva. Les dimensions réelles dépendent de la taille du rat.
4. Exciser chaque notice de valve aortique individuellement. Plus précisément, utilisez une pince émoussée pour saisir le bord de la feuillet et utilisez des ciseaux à ressort Vannas pour exciser la feuillette en coupant d’une commissure jusqu’à l’anneau, puis vers la commissure suivante.
   REMARQUE: Prenez des précautions particulières pour ne saisir que le bord de la foliole afin de minimiser la perturbation des cellules endothéliales valvulaires.
5. Conservez les échantillons après l’excision de la notice dans une solution tampon de stockage glacé jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être implantés chez le rat receveur. Implantez toutes les notices dans les 4 h suivant le stockage frigorifique.

5. Opération du destinataire

1. Préparez et anesthésiquez le rat comme indiqué à l’étape 2. Utilisez un coussin chauffant maintenu à 36-38 °C pour effectuer la chirurgie.
2. Administrer la buprénorphine (0,03 mg/kg par voie sous-cutanée) à tous les rats receveurs avant la chirurgie et toutes les 6 à 12 heures après l’opération, au besoin, pour soulager la douleur.
3. Placez le rat dans une position couchée latérale droite pour accéder au rein gauche.
   REMARQUE: Le rein gauche est préféré en raison de sa position plus caudale par rapport au rein droit.
4. Inciser la peau sur le flanc longitudinalement sur 1 pouce à l’aide de ciseaux.
   REMARQUE: L’incision doit rester plus petite que la taille du rein pour fournir suffisamment de tension pour empêcher le rein de se rétracter dans la cavité abdominale pendant la procédure.
5. De même, inciser la paroi abdominale sous-jacente.
6. Extérioriser le rein
   1. À l’aide du pouce et de l’index, appliquez une légère pression dorsale et ventrale tout en utilisant une pince incurvée pour soulever le pôle caudal du rein à travers l’incision abdominale et cutanée. Extérioriser l’extrémité crânienne du rein de la même manière.
   2. Alternativement, le rein peut être extériorisé en saisissant la graisse périrénale et en tirant vers le haut avec une légère tension.
      REMARQUE: Veillez à ne pas saisir directement le rein ou les vaisseaux rénaux.
   3. Une fois le rein extériorisé, gardez-le humide avec une solution saline chaude ruisselée sur le rein.
7. Créez une poche sous-capsulaire.
   1. Appliquez légèrement une pression sur la capsule rénale à l’aide d’un ensemble de pinces contondantes afin que la capsule rénale puisse être clairement distinguée du parenchyme sous-jacent. Simultanément, à l’aide d’un autre ensemble de pinces contondantes, saisissez soigneusement la capsule et tirez doucement vers le haut pour créer un trou dans la capsule.
      REMARQUE: En raison de la nature délicate de la capsule, une force minimale est nécessaire pour établir cette incision.
   2. Continuez à utiliser des pinces contondantes pour prolonger l’incision jusqu’à ce qu’un espace d’environ 2 mm ait été créé pour accueillir le feuillet de la valve aortique.
   3. Développez une poche sous-capsulaire peu profonde légèrement plus grande que le feuillet valvulaire tout en soulevant le bord de l’incision avec un ensemble de pinces et en avançant une sonde contondante sous la capsule rénale.
8. Transplantez la valve aortique dans la poche sous-capsulaire.
   1. Récupérez la notice aortique de l’entrepôt frigorifique et placez-la dans le champ chirurgical.
   2. Tout en soulevant la capsule fibreuse de bord, avancez la foliole aortique dans la poche sous-capsulaire avec une pince émoussée.
      REMARQUE: Assurez-vous que le tissu est suffisamment éloigné de l’incision pour qu’il soit fermement fixé sous la capsule. Des précautions doivent être prises pour éviter d’endommager le parenchyme sous-jacent ou de déchirer davantage la capsule fibreuse.
   3. L’incision dans la capsule rénale peut être laissée ouverte.
9. Repoussez doucement le rein à sa position anatomique en utilisant une contre-traction appliquée sur les bords de l’incision.
10. Fermez l’incision abdominale avec une suture chirurgicale stérile courante. Fermez la peau avec des agrafes.
11. Soins postopératoires
    1. Après l’opération, placez le rat dans une cage propre sur un coussin chauffant avec accès à la nourriture et à l’eau.
    2. Surveillez l’animal quotidiennement pour évaluer la cicatrisation de routine des plaies et les signes de douleur ou de détresse. Retirez les agrafes après 7-10 jours.

6. Prélèvement de tissus à des fins d’analyse

1. Aux critères d’évaluation sélectionnés après la transplantation, euthanasier l’animal par exsanguination. Plus précisément, effectuez une laparotomie médiane et transectez l’aorte abdominale sous 5% d’isoflurane en oxygène.
2. Mobilisez le rein et excisez-le en coupant l’artère rénale, la veine et l’uretère avec des ciseaux.
   REMARQUE: Veillez à ne pas saisir la zone contenant la feuillet transplantée.
3. Placez le rein dans le formol pendant la nuit, incorporez-le dans de la paraffine et coupez-le pour la coloration souhaitée. Orienter l’échantillon avec la capsule rénale orientée vers l’avant et le parenchyme rénal vers l’arrière.

Résultats

Une représentation graphique de la conception expérimentale est fournie pour le modèle de rat (Figure 1). De plus, une racine aortique disséquée du cœur du donneur et une feuillet valvulaire aortique individuelle préparée pour l’implantation sont également montrées à la figure 2. Ensuite, une image représentative de la position de la feuillet valvulaire aortique sous la capsule rénale pour l’implantation est montrée à la f...

Discussion

Importance et applications potentielles
Alors que les valves cardiaques mécaniques et bioprothétiques sont couramment utilisées chez les patients adultes nécessitant un remplacement valvulaire, ces valves n’ont pas le potentiel de croissance et, par conséquent, sont sous-optimales pour les patients pédiatriques. La transplantation valvulaire cardiaque est une opération expérimentale conçue pour fournir des remplacements valvulaires cardiaques en croissance aux nouveau-nés et aux nourrisson...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C