מודל פשוט להשתלת מסתם לב הטרוטופי במכרסמים

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה להשתלת עלוני מסתם אבי העורקים מתחת לכמוסה הכליתית כדי לאפשר מחקר של אלוראקטיביות של מסתמי הלב.

Abstract

יש צורך קליני דחוף בתחליפי מסתמי לב שיכולים לגדול אצל ילדים. השתלת מסתם הלב מוצעת כסוג חדש של השתלה עם פוטנציאל לספק מסתמי לב עמידים המסוגלים לצמיחה סומטית ללא צורך בנוגדי קרישה. עם זאת, האימונוביולוגיה של השתלות מסתמי לב עדיין לא נחקרה, מה שמדגיש את הצורך במודלים של בעלי חיים כדי לחקור סוג חדש זה של השתלה. מודלים קודמים של חולדות להשתלת מסתם אבי העורקים ההטרוטופי באבי העורקים הבטני תוארו, אם כי הם מאתגרים מבחינה טכנית ויקרים. כדי להתמודד עם אתגר זה, פותח מודל השתלה תת-קפסולרית של הכליה במכרסמים כשיטה מעשית ופשוטה יותר לחקר אימונוביולוגיה של השתלת מסתמי לב. במודל זה, עלון שסתום אבי העורקים יחיד נקטף ומוכנס לחלל התת-קפסולרי הכלייתי. הכליה נגישה בקלות, והרקמה המושתלת מוכלת היטב בחלל תת-קפסולרי שהוא כלי דם היטב ויכול להכיל מגוון גדלי רקמות. יתר על כן, מכיוון שחולדה בודדת יכולה לספק שלושה עלוני אבי העורקים של התורם וכליה אחת יכולה לספק מספר אתרים לרקמות מושתלות, פחות חולדות נדרשות למחקר נתון. כאן מתוארת טכניקת ההשתלה, המספקת צעד משמעותי קדימה בחקר אימונולוגיה של השתלת מסתמי לב.

Introduction

מומי לב מולדים הם הנכות המולדת הנפוצה ביותר בבני אדם, המשפיעים על 7 מתוך 1,000 ילדים שנולדו חיים בכל שנה¹. בניגוד לחולים מבוגרים בהם מושתלים באופן שגרתי מסתמים מכניים וביו-פרוסטטיים שונים, למטופלים בילדים אין כיום אפשרויות טובות להחלפת מסתם. לשתלים קונבנציונליים אלה אין פוטנציאל לגדול אצל ילדים מושתלים. כתוצאה מכך, ניתוחים חוזרים חולניים נדרשים כדי להחליף את שתלי מסתם הלב בגרסאות גדולות יותר ברצף ככל שהילדים גדלים, כאשר ילדים מושפעים נזקקים לעתים קרובות לעד חמישה ניתוחי לב פתוח או יותר במהלך חייהם ^2,3. מחקרים הראו כי החופש מהתערבות או ממוות דל באופן משמעותי בתינוקות מאשר בילדים גדולים יותר, כאשר 60% מהתינוקות עם מסתמי לב תותבים עומדים בפני ניתוח חוזר או מוות תוך 3 שנים מהניתוח הראשוני שלהם⁴. לכן, יש צורך דחוף לספק מסתם לב שיכול לגדול ולשמור על תפקוד בחולי ילדים.

במשך עשרות שנים, ניסיונות לספק תחליפי מסתמי לב הולכים וגדלים התרכזו בהנדסת רקמות ובתאי גזע. עם זאת, הניסיונות לתרגם מסתמים אלה למרפאה לא צלחו עד כה ^5,6,7,7,8. כדי להתמודד עם זה, השתלת מסתם לב מוצעת כפעולה יצירתית יותר למתן תחליפי מסתמי לב הולכים וגדלים בעלי יכולת לתקן את עצמם ולהימנע מתרומבוגנזה. במקום להשתיל את כל הלב, רק מסתם הלב מושתל ואז יגדל עם הילד המושתל, בדומה להשתלת לב קונבנציונלית או לחתימה ריאתית של רוס ^9,10,11. לאחר הניתוח, ילדים מושתלים יקבלו דיכוי חיסוני עד שניתן יהיה להחליף את המסתם המושתל בתותבת מכנית בגודל מבוגר כאשר צמיחת המסתם אינה נדרשת עוד. עם זאת, הביולוגיה של ההשתלות של השתלות מסתמי הלב נותרה ללא בדיקה. לכן, יש צורך במודלים של בעלי חיים כדי לחקור סוג חדש זה של השתלה.

מספר מודלים של חולדות תוארו בעבר להשתלה הטרוטופית של המסתם אבי העורקים לתוך אבי העורקים הבטני^{12,13,14,15,16,17,18}. עם זאת, מודלים אלה הם מסובכים מאוד, ולעתים קרובות דורשים מנתחים מיומנים לנתח בהצלחה. בנוסף, הם יקרים וגוזלים זמן^{רב 19}. מודל חדש של חולדות פותח כדי ליצור מודל חייתי פשוט יותר לחקר האימונוביולוגיה של השתלות מסתמי לב. עלוני מסתם אבי העורקים הבודדים נכרתים ומוכנסים לחלל התת-קפסולרי הכלייתי. הכליה מתאימה במיוחד לחקר דחיית ההשתלה מכיוון שהיא מאוד וסקולרית עם גישה לתאי חיסון במחזור^20,21. בעוד שכמה אחרים השתמשו במודל תת-קפסולרי כלייתי כדי לחקור את הביולוגיה של ההשתלות של השתלות אלוגרפט אחרות כגון לבלב, כבד, כליה וקרנית 22,23,24,25,26,27, זהו התיאור הראשון של השתלת רקמת לב במצב זה. כאן מתוארת טכניקת ההשתלה, המספקת צעד משמעותי קדימה בחקר אימונולוגיה של השתלת מסתמי לב.

Protocol

המחקר אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים בעקבות המדריך הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן.

1. מידע על מודל החיה (חולדות)

1. השתמש במיקרוסקופ ניתוח (ראה טבלת חומרים) עם הגדלה של עד פי 20 עבור כל ההליכים הכירורגיים.
2. השתמש בזנים סינגניים (כגון לואיס-לואיס) או אלוגניים (כגון לואיס-בראון נורבגיה) עבור ההשתלות לפי הצורך לניסוי.
3. השתמש בחולדות בגיל בין 5-7 שבועות ומשקל גוף של 100-200 גרם המתאימים לשאלת הניסוי.

2. הסרת פרווה, הכנת העור והרדמה

1. בצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים.
   הערה: הצעד מבוצע בחלל כירורגי ייעודי ובתנאים סטריליים.
2. מכניסים את החולדות לתא אינדוקציה להרדמה וגורמים להרדמה עם 5% איזופלורן בחמצן. יש לשמור על הרדמה עם 3.5% איזופלורן בחמצן לאורך כל ההליך.
3. לצורך ניתוח התורם, יש להסיר את פרוות החולדה מהטבור אל חריץ החזה באמצעות קוצץ פרווה. עבור הניתוח המקבל, מקצצים את השיער מעל שדה הניתוח בקו בית השחי האחורי מהצלעות לאגן. לאחר מכן, להכין את העור עם חיטוי כירורגי.
4. קבל מישור כירורגי של הרדמה לפני תחילת ההליך. לאשר עומק נאות של הרדמה על ידי דחיסה חזקה של בהונות החולדה עם מלקחיים. אם החולדה נסוגה מכאבים, תעבירו את חומר ההרדמה לפי הצורך.
5. לפקח על קצב הנשימה ואת עומק ההרדמה באופן קליני לאורך ההליך; רמת האיזופלורן מותאמת לפי הצורך כדי לשמור על קצב נשימה של 55-65 נשימות לדקה.

3. פעולת התורם

1. להכין ולהרדים את החולדה כאמור בשלב 2. מכניסים את העור מהחריץ ה-xiphoid לחריץ החזה באמצעות מספריים מנתחים. בצע כריתת עצם על ידי חיתוך הצלעות מכל צד לרוחב עצם החזה עד להשגת גישה אופטימלית ללב.
2. הפרין את החולדה עם זריקה של 100 U/100 גרם לאטריום השמאלי.
3. להקריב את התורם באמצעות אקסנגווינציה.
4. לבלות את התימוס כדי לשפר את ההדמיה של הכלים הגדולים. לאחר מכן, הסר את גוש הלב עם אבי העורקים העולה עד לרמת העורק המועמד.

4. הכנת עלוני מסתם אבי העורקים

1. מניחים את לב התורם בצלחת פטרי סטרילית מיד לאחר כריתת הלב. נתחו את לב התורם במאגר אחסון קר כקרח (ראו טבלת חומרים).
2. באמצעות מלקחיים ומספריים קפיציים של Vannas, מנתחים את לב התורם עד שנותר רק שורש אבי העורקים עם שרוול חדרי בקוטר 1 מ"מ פרוקסימלי למסתם אבי העורקים.
3. פתח את המסתם אבי העורקים על ידי ביצוע חתך אורכי כדי לפתוח את הסינוסים של Valsalva בין הסינוסים השמאליים והלא כליליים כדי לדמיין את כל שלושת העלונים.
   הערה: החתך צריך להיות לכל אורכו של הסינוס של Valsalva. הממדים בפועל תלויים בגודל החולדה.
4. בלו כל עלון שסתום אבי העורקים בנפרד. באופן ספציפי, השתמש במלקחיים קהים כדי לתפוס את קצה העלון והשתמש במספריים של קפיצי Vannas כדי לכרות את העלון על ידי חיתוך מאחד הקומיסורים עד האנולוס, ולאחר מכן לכיוון הקומיסורה הבאה.
   הערה: הקפידו במיוחד לתפוס רק את קצה העלון כדי למזער את ההפרעה לתאי האנדותל הוולולריים.
5. אחסנו את הדגימות לאחר כריתת העלון בתמיסת מאגר אחסון קר כקרח עד שיהיו מוכנות להשתלה בחולדה המקבלת. שתלו את כל העלונים תוך 4 שעות מאחסון קר.

5. פעולת הנמען

1. להכין ולהרדים את החולדה כאמור בשלב 2. השתמש בכרית חימום המתוחזקת בטמפרטורה של 36-38 מעלות צלזיוס כדי לבצע את הניתוח.
2. יש לתת בופרנורפין (0.03 מ"ג/ק"ג תת עורי) לכל החולדות המושתלות לפני הניתוח וכל 6-12 שעות לאחר הניתוח לפי הצורך כדי להקל על הכאב.
3. מניחים את החולדה בתנוחת משענת צידית ימנית כדי לגשת לכליה השמאלית.
   הערה: הכליה השמאלית עדיפה בשל מיקומה הקאודאלי יותר ביחס לכליה הימנית.
4. העבירו את העור מעל האגף לאורך לאורך 1 אינץ' באמצעות מספריים.
   הערה: החתך חייב להישאר קטן מגודל הכליה כדי לספק מספיק מתח כדי למנוע מהכליה לסגת בחזרה לחלל הבטן במהלך ההליך.
5. באופן דומה, יש לנטות את דופן הבטן הבסיסית.
6. החצינו את הכליה
   1. באמצעות האגודל והאצבע הקדמית, הפעילו לחץ קל באופן דורסלי וגחוני תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כדי להרים את הקוטב הקאודלי של הכליה דרך חתך הבטן והעור. להחצין את קצה הגולגולת של הכליה באופן דומה.
   2. לחלופין, הכליה עשויה להיות מוחצנת על ידי אחיזת השומן הפרירני ומשיכה כלפי מעלה במתח קל.
      הערה: היזהרו שלא לתפוס את הכליה או את כלי הכליה ישירות.
   3. לאחר שהכליה מוחצנת, יש לשמור אותה לחה עם מלח חם המטפטף על הכליה.
7. צור כיס תת-קפסולרי.
   1. הפעילו לחץ קלות על הקפסולה הכליתית באמצעות קבוצה אחת של מלקחיים קהים, כך שניתן להבחין בבירור בין הקפסולה הכליתית לבין הפרנכימה הבסיסית. בו זמנית באמצעות קבוצה נוספת של מלקחיים קהים, תפסו בזהירות את הקפסולה ומשכו בעדינות כלפי מעלה כדי ליצור חור בקפסולה.
      הערה: בשל האופי העדין של הקפסולה, נדרש כוח מינימלי כדי לבסס חתך זה.
   2. המשך להשתמש במלקחיים קהים כדי להאריך את החתך עד שייווצר רווח של כ-2 מ"מ כדי להכיל את עלון המסתם של אבי העורקים.
   3. לפתח כיס תת-קפסולרי רדוד שהוא מעט גדול יותר מעלון השסתום תוך הרמת קצה החתך עם קבוצה אחת של מלקחיים וקידום גשושית קהה מתחת לקפסולת הכליה.
8. השתלת המסתם אבי העורקים בכיס התת-קפסולרי.
   1. שלפו את עלון אבי העורקים מאחסון קר והניחו אותו בשדה הניתוח.
   2. תוך כדי הרמת הקפסולה הסיבית בקצה, מקדמים את עלון אבי העורקים לכיס התת-קפסולרי עם מלקחיים קהים.
      הערה: ודא שהרקמה רחוקה מספיק מהחתך, כך שהיא מאובטחת היטב מתחת לקפסולה. יש להקפיד כדי למנוע נזק לפרנכימה הבסיסית או לקריעה נוספת של הקפסולה הסיבית.
   3. את החתך בקפסולת הכליה ניתן להשאיר פתוח.
9. דוחפים את הכליה בעדינות בחזרה למקומה האנטומי באמצעות מתיחה נגדית המופעלת על קצוות החתך.
10. סגור את חתך הבטן עם תפר כירורגי סטרילי רץ. סגור את העור עם סיכות.
11. טיפול לאחר הניתוח
    1. לאחר הניתוח, הניחו את החולדה בכלוב נקי על משטח חימום עם גישה למזון ולמים.
    2. עקוב אחר בעל החיים מדי יום כדי להעריך ריפוי פצעים שגרתי וסימני כאב או מצוקה. הסר את המצרכים לאחר 7-10 ימים.

6. איסוף רקמות לניתוח

1. בנקודות קצה נבחרות לאחר ההשתלה, המתת החסד את החיה על ידי אקסנגווינציה. באופן ספציפי, לבצע לפרוטומיה חציונית ולהעביר את אבי העורקים הבטני מתחת 5% isoflurane בחמצן.
2. גייסו את הכליה וכרתו אותה על ידי חיתוך עורק הכליה, הווריד והשופכן במספריים.
   הערה: היזהרו שלא לתפוס את האזור המכיל את העלון המושתל.
3. מניחים את הכליה בפורמלין למשך הלילה, מטמיעים אותה בפרפין, וחותכים אותה לצורך הכתם הרצוי. כוון את הדגימה כאשר קפסולת הכליה פונה קדמית ופרנכימה הכליה פונה לאחור.

תוצאות

תיאור גרפי של העיצוב הניסיוני מסופק עבור מודל החולדה (איור 1). בנוסף, שורש אבי העורקים המנותק מלבו של התורם ועלון מסתם אבי העורקים הבודד המוכן להשתלה מוצגים גם הם באיור 2. לאחר מכן, תמונה מייצגת של מיקום עלון המסתם האאורטלי מתחת לקפסולת הכליה לצורך השתלה מוצג?...

Discussion

חשיבות ויישומים פוטנציאליים
בעוד שמסתמי לב מכניים וביו-פרוסטטיים משמשים באופן שגרתי בחולים מבוגרים הזקוקים להחלפת מסתם, מסתמים אלה חסרים פוטנציאל לגדול, ולכן הם אינם אופטימליים עבור מטופלים ילדים. השתלת מסתמי לב היא פעולה ניסיונית שנועדה לספק תחליפי מסתמי לב הולכים וגדלים לי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x - 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C