Imágenes vasculares profundas en el ojo con ultrasonido con flujo mejorado

Resumen

Presentamos una técnica ecográfica no invasiva para generar angiografías tridimensionales en el ojo sin el uso de agentes de contraste.

Resumen

La retina dentro del ojo es uno de los tejidos más exigentes de energía en el cuerpo y, por lo tanto, requiere altas tasas de suministro de oxígeno de un rico suministro de sangre. La lámina capilar de la coroides recubre la superficie externa de la retina y es la fuente dominante de oxígeno en la mayoría de las retinas de los vertebrados. Sin embargo, este lecho vascular es difícil de visualizar con técnicas ópticas tradicionales debido a su posición detrás de la retina altamente absorbente de luz. Aquí describimos una técnica de ultrasonido de alta frecuencia con posterior mejora del flujo para obtener imágenes de lechos vasculares profundos (0,5-3 cm) del ojo con una alta resolución espaciotemporal. Este método no invasivo funciona bien en especies con glóbulos rojos nucleados (modelos animales no mamíferos y fetales). Permite la generación de angiografías tridimensionales no invasivas sin el uso de agentes de contraste, y es independiente de los ángulos de flujo sanguíneo con una sensibilidad más alta que las técnicas de imágenes de ultrasonido basadas en Doppler.

Introducción

El alto metabolismo en la retina de los vertebrados impone una compensación intrínseca entre dos necesidades contrastantes; altas tasas de flujo sanguíneo y un camino ligero desprovisto de vasos sanguíneos. Para evitar la alteración visual de la perfusión de los glóbulos rojos, la retina de todos los vertebrados recibe oxígeno y nutrientes a través de una lámina de capilares detrás de los fotorreceptores, los coriocapilaris1,2,3. Sin embargo, esta única fuente de nutrientes y oxígeno impone una limitación de difusión al grosor de la ^retina4,5, por lo que muchas especies visualmente activas poseen una variedad de elaboradas redes vasculares para proporcionar un suministro de sangre adicional a este órgano metabólicamente ^activo6. Estos lechos vasculares incluyen vasos sanguíneos que perfunden las capas internas de la retina en mamíferos y algunos peces4,7,8,9,10, vasos sanguíneos en el lado interno (orientado a la luz) de la retina que se encuentran en muchos peces, reptiles y aves4,11,12,13, y arreglos vasculares contracorrientes de la coroides de pescado, la coroides. mirabile, que permite la generación de presiones parciales de oxígeno sobrefosférico14,15,16,17,18,19,20. A pesar de que estas vías no coroideas adicionales para el suministro de nutrientes de la retina juegan un papel esencial en el fomento de los requisitos metabólicos de la visión ^superior4, la anatomía tridimensional de estas estructuras vasculares es poco conocida, lo que limita nuestra comprensión de la evolución morfológica del ojo vertebrado.

Tradicionalmente, el suministro de sangre retiniana se ha estudiado utilizando técnicas ópticas, como la oftalmoscopia del fondo de ojo. Esta categoría de técnicas proporciona información no destructiva de alto rendimiento sobre la anatomía no coroidea de los vasos sanguíneos en alta ^{resolución21} y, por lo tanto, se utiliza fácilmente en el diagnóstico clínico de anomalías en la estructura de los vasos retinianos22. Sin embargo, el epitelio pigmentario de la retina absorbe la luz transmitida y limita la profundidad de visión en estas técnicas ópticas, proporcionando información reducida sobre la estructura y función coroidea sin el uso de agente de ^contraste21. Se experimentan limitaciones de profundidad similares en la tomografía de coherencia óptica (OCT). Esta técnica puede generar angiografías de fondo de ojo de alta resolución utilizando ondas de luz a expensas técnicas de la penetración de ^{profundidad23}, mientras que la OCT de imagen de profundidad mejorada puede visualizar la coroides a expensas de la calidad de la imagen de la ^retina24. La resonancia magnética supera las limitaciones ópticas de la oftalmoscopia y la OCT y puede mapear las capas vasculares de la retina, aunque a baja ^{resolución25}. La histología y la tomografía microinformática (μCT) mantienen la alta resolución de las técnicas ópticas y proporcionan información sobre la morfología vascular de todo el ^ojo4, pero ambas técnicas requieren muestreo ocular y, por lo tanto, no son posibles en la clínica o en especies raras o en peligro de extinción. Para superar algunas de las limitaciones de estas técnicas de imagen retiniana establecidas, el estudio presenta aquí un protocolo de ultrasonido en animales anestesiados, donde el movimiento de la sangre se mapea in silico en una serie de ecografías bidimensionales igualmente espaciadas que abarcan todo un ojo mediante la aplicación de una técnica comparable a la descrita anteriormente para la imagen embrionaria y ^{cardiovascular26,27, 28} y en angiografía ^OCT29. Este enfoque permite la generación de angiografías oculares profundas tridimensionales no invasivas sin usar un agente de contraste y abre nuevas vías para mapear la distribución del flujo sanguíneo dentro del ojo a través de las especies.

Protocolo

El siguiente protocolo se realizó con el permiso de la Inspección Danesa de Experimentación Animal dentro del Ministerio Danés de Alimentación, Agricultura y Pesca, Administración Danesa de Veterinaria y Alimentos (número de permiso 2016-15-0201-00835).

1. Anestesia y medio de ultrasonido

1. Anestesiar al animal de investigación.
   NOTA: El tipo y la dosis de anestesia apropiada son altamente dependientes de la especie. En general, los anestésicos a base de inmersión como MS-222 (ácido metanosulfónico de etilo 3-aminobenzoato), benzocaína (4-aminobenzoato de etilo) y propofol (2,6-diisopropil fenol) son útiles en peces y anfibios que absorben fácilmente el anestésico sobre las branquias o la piel (por ejemplo, 0,05 mg · Benzocaína ^L-1 en trucha arco iris). Una gama de compuestos disueltos que se pueden administrar por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal está disponible para los amniotas, al igual que los anestésicos a base de gas. Alfaxalon administrado por vía intramuscular es útil en reptiles (por ejemplo, 30 mg·^kg-1 en lagartos), e isoflurano administrado como gas es útil en aves (por ejemplo, 2% en aire para palomas). Consulte la literatura publicada30,31,32 para obtener una visión general completa de los anestésicos disponibles en todas las especies.
2. Pruebe los reflejos en el animal para confirmar un nivel óptimo de anestesia. Asegúrese de que el animal esté completamente inmóvil durante el procedimiento, ya que el procedimiento de ultrasonido con flujo mejorado es sensible al ruido de movimiento.
   1. La anestesia demasiado profunda puede alterar los patrones de flujo sanguíneo, así que realice una titulación de la dosis en la fase inicial de un experimento.
   2. Aumente la dosis de anestesia en pasos y observe el flujo sanguíneo en el ojo con la ayuda de ultrasonido en modo de brillo simple (modo B).
      NOTA: Se obtiene un nivel óptimo de anestesia cuando el animal está inmóvil (excepto la respiración) con flujo sanguíneo ocular visible.
3. Si el tipo/dosis de anestésico no es permisivo para los movimientos respiratorios, asegúrese de una ventilación adecuada del animal, por ejemplo, utilizando una bomba de aire para oxigenar el agua para las especies acuáticas o un ventilador para las especies que respiran aire.
4. Coloque al animal en una postura que permita el acceso directo desde arriba al ojo.
   NOTA: Dependiendo de la especie, esto puede ser en posición supina o lateral. Puede ser útil construir un dispositivo de sujeción simple utilizando una pequeña pieza de metal no reactivo (por ejemplo, acero inoxidable) y bandas elásticas sueltas (ver Figura 1).
5. Coloque el medio de ultrasonido apropiado en el ojo del animal. Si los párpados escamosos (impermeables al ultrasonido) cubren el ojo, desplace estos suavemente con un hisopo de algodón.
   NOTA: Para las especies acuáticas, el mejor medio de ultrasonido es el agua limpia del tanque en el que generalmente vive el animal. Para las especies terrestres, una cantidad generosa de gel de ultrasonido garantiza movimientos libres e imágenes del transductor de ultrasonido (es decir, sonda de matriz lineal) en toda la superficie del ojo. Se requiere ungüento veterinario en el ojo contralateral para las especies terrestres.

2. Adquisición de imágenes de ultrasonido ocular 2D y 3D

1. Coloque el transductor de ultrasonido medial al ojo en una orientación dorsal / ventral o rostral / caudal dependiendo de la orientación de la imagen deseada.
2. En el modo B, con una profundidad de campo máxima, tome una imagen de la parte medial y más profunda del ojo y asegúrese de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen.
   NOTA: En algunas especies, el cristalino ocupa una proporción comparativamente grande del humor vítreo, que puede absorber el ultrasonido, especialmente a frecuencias más altas.
3. Traduzca lentamente el transductor a cada lado mientras inspecciona las imágenes en tiempo real. Asegúrese de que todas las estructuras de interés sean visibles en el campo de la imagen; de lo contrario, cambie a un transductor con una frecuencia más baja y una mayor profundidad de campo.
   NOTA: Las siguientes frecuencias centrales permiten la siguiente profundidad máxima de campo: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (véase la Tabla 1). Sin embargo, estos valores máximos de profundidad de campo pueden ser marcadamente más bajos si el ojo contiene estructuras calcificadas u otras estructuras impermeables al ultrasonido.
4. Ajuste la profundidad de la imagen, el desplazamiento de profundidad (distancia desde la parte superior de la imagen hasta la estructura de interés), el ancho de la imagen, así como el número y la posición de las zonas focales para cubrir la región de interés deseada en las tres dimensiones espaciales (por ejemplo, profundidad de imagen de 1 cm, desplazamiento de profundidad de 2 mm, ancho de imagen de 1 cm, una zona focal).
   NOTA: Aunque la nomenclatura específica de los botones que ajustan estos parámetros puede variar entre los sistemas de ultrasonido, la mayoría de los sistemas tendrán botones con nombres lógicos para estos ajustes. Estos ajustes de parámetros de imagen generalmente afectan el rango de posibles resoluciones temporales de la adquisición de ultrasonido.
5. Establezca la velocidad de fotogramas en el rango de 50-120 fotogramas·^s-1.
   NOTA: La resolución temporal (es decir, el intervalo de tiempo entre las sucesivas exploraciones B) debe ser adecuada para mostrar una gran variabilidad de la intensidad de píxeles en los vasos sanguíneos fotografiados, es decir, la resolución temporal no debe ser demasiado alta. Por otro lado, para completar una grabación 3D completa del ojo en un tiempo razonable, la resolución temporal no puede ser demasiado baja. Una resolución temporal que oscila entre 50-120 fotogramas·^s-1 suele ser adecuada para el procedimiento de flujo mejorado en la mayoría de las especies. En algunos sistemas de ultrasonido, esta resolución temporal deseada se puede obtener cambiando entre los modos de "imagen general" (alta resolución espacial / baja resolución temporal) y "cardiología" (baja resolución espacial / alta resolución temporal).
6. Ajuste la ganancia 2D a un nivel (~ 5 dB), de modo que las estructuras anatómicas solo sean visibles en la adquisición del modo B para aumentar la relación señal-ruido en la posterior reconstrucción mejorada del flujo.
7. Para adquirir una imagen mejorada con flujo 2D en una sola posición de corte, traduzca el transductor a esta posición y continúe en el paso 3.1.
8. Para adquirir una grabación 3D de toda una región de interés, por ejemplo, la retina, traduzca el transductor a un extremo de la región de interés.
   1. Para determinar la posición exacta del extremo de la región de interés, aumente brevemente la ganancia 2D.
   2. Una vez completada la colocación correcta del transductor, reduzca la ganancia 2D antes de grabar para garantizar la máxima relación señal-ruido en la posterior reconstrucción mejorada del flujo.
9. Para cada paso (slice) en la grabación 3D, adquiera ≥100 fotogramas (óptimamente ≥1000 fotogramas).
10. Usando un micromanipulador o un motor de transductor incorporado, traduzca el transductor a través de toda la región de interés en pasos de, por ejemplo, 25 μm o 50 μm (recuerde anotar el tamaño del paso) y repita la adquisición de ≥100 cuadros para cada paso.
11. Sacrificar al animal de investigación de acuerdo con las pautas de cuidado animal de la institución.

3. Reconstrucción de imagen mejorada por flujo

1. Exporte las grabaciones al formato de archivo de imágenes digitales y comunicaciones en medicina (DICOM) (little-endian).
2. Para producir una sola imagen mejorada de flujo basada en una grabación de cine de ≥100 fotogramas (T), calcule la desviación estándar en el nivel de píxeles (STD(x,y)) utilizando la fórmula:
   
   Donde _It(x,y) es la intensidad del píxel en la coordenada del píxel (x,y) en el tiempo t, e _Īt(x,y) es el valor medio aritmético de I a lo largo del tiempo.
3. Repita el paso 3.2 para cada segmento de la grabación 3D.
4. Para automatizar el proceso de cálculo de ETS y reconstrucción de imágenes para múltiples segmentos en una grabación 3D, realice esta operación en modo por lotes utilizando, por ejemplo, ImageJ y el script de macro suplementario (Archivo suplementario 1).
5. Combine todos los sectores reconstruidos en una pila de imágenes (comando Images to Stack en ImageJ).
6. Especifique el grosor del segmento a partir del tamaño de paso utilizado durante la adquisición (comando Properties en ImageJ).
7. Guarde la pila de imágenes como un archivo TIF 3D.
   NOTA: Los registros tridimensionales ponderados por flujo de los vasos sanguíneos oculares se pueden utilizar posteriormente para crear representaciones de volumen y construir modelos anatómicos digitales y físicos de las estructuras vasculares del ojo. Estas opciones de procesamiento de imágenes están fuera del alcance de este protocolo; consulte los artículos publicados anteriormente para obtener más detalles33,34,35.

Resultados

La técnica de ultrasonido de flujo mejorado para obtener imágenes de los lechos vasculares del ojo se puede aplicar en una variedad de especies y actualmente se ha utilizado en 46 especies diferentes de vertebrados (Figura 1, Tabla 1). La presencia de glóbulos rojos nucleados en vertebrados de mamíferos no adultos proporciona un contraste positivo de la sangre que fluye en comparación con el tejido estático en las grabaciones de cine (Archivo complementario 2

Discusión

Las imágenes vasculares que utilizan ultrasonido de flujo mejorado proporcionan un nuevo método para la obtención de imágenes no invasivas de la vasculatura del ojo que ofrece varias ventajas sobre las técnicas actuales, pero tiene sus limitaciones intrínsecas. La principal ventaja del ultrasonido con flujo mejorado es la capacidad de generar angiografías oculares con una profundidad de campo que excede el epitelio pigmentario de la retina, lo que limita la profundidad de campo en las técnicas ópticas. En las im...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MS-222	Sigma	E10521-50G
Benzocaine	Sigma	E-1501
Propofol	B Braun	12260470_0320
Alfaxalon	Jurox	NA
Isoflurane	Zoetis	50019100
Ultrasound scanner	VisualSonics	Vevo 2100