흐름이 향상된 초음파로 눈의 깊은 혈관 이미징

요약

우리는 조영제를 사용하지 않고 눈에 입체 혈관 조영술을 생성하는 비 침습적 초음파 기술을 제시합니다.

초록

눈 안의 망막은 신체에서 가장 에너지를 많이 요구하는 조직 중 하나이므로 풍부한 혈액 공급으로 인한 높은 산소 전달이 필요합니다. 맥락막의 모세관 라미나는 망막의 외부 표면을 감싸고 대부분의 척추 동물 망막에서 산소의 지배적 인 원천입니다. 그러나이 혈관 침대는 고도로 광흡수성 망막 뒤에 위치하기 때문에 전통적인 광학 기술로 이미지화하기가 어렵습니다. 여기서 우리는 높은 시공간 해상도로 눈의 깊은 혈관 침대 (0.5-3cm)를 이미지화하기위한 후속 흐름 향상과 함께 고주파 초음파 기술을 설명합니다. 이 비 침습적 방법은 유핵화 된 적혈구 (비 포유류 및 태아 동물 모델)가있는 종에서 잘 작동합니다. 조영제를 사용하지 않고도 비침습적 입체 혈관조영술을 생성할 수 있으며, 도플러 기반 초음파 영상 기술보다 높은 감도를 갖는 혈류각과는 무관하다.

서문

척추 동물 망막의 높은 신진 대사는 두 가지 대조적 인 요구 사이의 본질적인 절충안을 부과합니다. 높은 혈류 속도와 혈관이없는 가벼운 경로. 관류 적혈구의 시각 장애를 피하기 위해, 모든 척추 동물의 망막은 광수용체 뒤의 모세 혈관 시트를 통해 산소와 영양분을 섭취합니다 (choriocapillaris1,2,3). 그러나, 이러한 영양소와 산소의 단일 공급원은 망막의 두께에 확산 제한을 부과한다^4,5, 그래서 많은 시각 활성 종들은 이러한 대사적으로 활성인 장기에 추가적인 혈액 공급을 제공하기 위해 다양한 정교한 혈관 네트워크를 보유한다⁶. 이러한 혈관 층에는 포유류 및 일부 어류의 내부 망막층을 관류하는 혈관4,7,8,9,10, 많은 물고기, 파충류 및 조류에서 발견되는 망막의 내측(빛을 향한) 측면의 혈관 4,11,12,13, 및 어질의 역류 혈관 배열^, 맥락막 레테가 포함된다. 미라빌레, 즉 초대기압 산소 분압14,15,16,17,18,19,20의 생성을 허용한다. 망막 영양소 공급을 위한 이러한 추가적인 비맥락막 경로가 우수한 시력의 대사 요건을 자극하는 데 필수적인 역할을 함에도 불구하고⁴, 이러한 혈관 구조의 입체 해부학은 잘 이해되지 않아 척추동물의 형태학적 진화에 대한 우리의 이해를 제한한다.

전통적으로 망막 혈액 공급은 안저 안과 검사와 같은 광학 기술을 사용하여 연구되어 왔습니다. 이 범주의 기술은 고해상도²¹에서 비맥락막 혈관 해부학에 대한 고처리량 비파괴 정보를 제공하므로 망막 혈관 구조의 이상에 대한 임상 진단에 쉽게 사용됩니다²². 그러나, 망막 색소 상피는 투과된 광을 흡수하고 이들 광학 기술에서 시야의 깊이를 제한하여, 조영제를 사용하지 않고 맥락막 구조 및 기능에 대한 감소된 정보를 제공한다²¹. 유사한 깊이 한계는 광학 간섭 단층 촬영 (OCT)에서 경험됩니다. 이 기술은 깊이 침투²³의 기술적 비용으로 광파를 사용하여 고해상도 안저 혈관 조영술을 생성 할 수 있으며, 향상된 깊이 이미징 OCT는 망막 이미징 품질을 희생하여 맥락막을 시각화 할 수 있습니다²⁴. 자기 공명 영상은 안과 및 OCT의 광학적 한계를 극복하고 낮은 해상도임에도 불구하고 망막의 혈관층을 매핑할 수 있습니다²⁵. 조직학 및 미세 컴퓨터 단층 촬영 (μCT)은 광학 기술의 고해상도를 유지하고 전체 안구 혈관 형태학에 대한 정보를 제공하지만⁴ 두 기술 모두 안구 샘플링이 필요하므로 클리닉이나 희귀하거나 멸종 위기에 처한 종에서는 불가능합니다. 이러한 확립 된 망막 영상 기술의 한계 중 일부를 극복하기 위해, 여기 연구는 마취 된 동물에 대한 초음파 프로토콜을 제시하며, 여기서 혈액 운동은 배아 및 심혈관 영상에 대해 이전에 설명 된 것과 유사한 기술을 적용하여 전체 눈에 걸쳐 일련의 동등한 간격의 이차원 초음파 스캔에 실리코로 매핑됩니다.^{26,27, 28} 및 OCT 혈관 조영술²⁹. 이 접근법은 조영제를 사용하지 않고 비 침습적 입체 심부 안구 혈관 조영술의 생성을 허용하고 종에 걸쳐 눈 내의 혈류 분포를 매핑하기위한 새로운 길을 열어줍니다.

프로토콜

아래 프로토콜은 덴마크 식품수산부, 덴마크 수의학 및 식품청 (허가 번호 2016-15-0201-00835) 내에서 덴마크 동물 실험 검사원의 허가를 받아 수행되었습니다.

1. 마취 및 초음파 매체

1. 연구 동물을 마취하십시오.
   참고 : 적절한 마취의 유형과 용량은 종에 따라 크게 다릅니다. 일반적으로 MS-222(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설폰산), 벤조카인(에틸 4-아미노벤조에이트) 및 프로포폴(2,6-디이소프로필페놀)과 같은 침지 기반 마취제는 아가미나 피부에 마취제를 쉽게 흡수하는 생선 및 양서류에 유용합니다(예: 0.05 mg· ^L-1 레인보우 송어에 벤조카인). 정맥내, 근육내, 복강내로 투여될 수 있는 용해된 화합물의 범위는 가스계 마취제와 마찬가지로 암니오트에 사용할 수 있다. 근육 내로 투여되는 알팍살론은 파충류(예를 들어, 도마뱀에서 30mg·^kg-1)에 유용하고, 가스로서 투여되는 이소플루란은 조류에서 유용하다(예를 들어, 비둘기의 경우 공기 중 2%). 종에 걸쳐 이용 가능한 마취제에 대한 전체 개요를 보려면 출판 된 문헌^30,31,32를 참조하십시오.
2. 최적의 마취 수준을 확인하기 위해 동물의 반사 신경을 테스트하십시오. 흐름이 강화된 초음파 절차가 동작 소음에 민감하므로 시술 중에 동물이 완전히 움직이지 않는지 확인하십시오.
   1. 너무 깊은 마취는 혈류 패턴을 바꿀 수 있으므로 실험의 시작 단계에서 용량 적정을 수행하십시오.
   2. 마취 복용량을 단계적으로 늘리고 간단한 밝기 모드 (B 모드) 초음파로 도움을받는 눈의 혈류를 관찰하십시오.
      참고 : 최적의 마취 수준은 동물이 안구 혈류가 보이는 움직임이 없을 때 (호흡 제외) 얻어집니다.
3. 마취제의 유형 / 복용량이 호흡 운동에 허용되지 않는 경우, 예를 들어 공기 펌프를 사용하여 수생 종의 물을 산소화하거나 공기 호흡 종을위한 인공 호흡기를 사용하는 등 동물의 적절한 환기를 보장하십시오.
4. 위에서 눈에 직접 접근 할 수있는 자세로 동물을 배치하십시오.
   참고 : 종에 따라 이것은 수핀 또는 측면 위치에있을 수 있습니다. 작은 비반응성 금속(예: 스테인리스강)과 느슨한 고무 밴드를 사용하여 간단한 유지 장치를 구성하는 것이 유용할 수 있습니다( 그림 1 참조).
5. 동물의 눈에 적절한 초음파 매체를 놓습니다. 스케일이 조정 된 눈꺼풀 (초음파 불투과성)이 눈을 덮으면 면봉으로 부드럽게 대체하십시오.
   참고 : 수생 종의 경우, 가장 좋은 초음파 매체는 동물이 보통 사는 깨끗한 탱크 물입니다. 육상 종의 경우, 넉넉한 양의 초음파 젤은 눈의 전체 표면에 걸쳐 초음파 변환기 (즉, 선형 배열 프로브)의 자유로운 움직임과 이미징을 보장합니다. 대측 눈의 수의사 연고는 육상 종에 필요합니다.

2. 2D 및 3D 안구 초음파 이미지 수집

1. 초음파 트랜스듀서의 내측을 원하는 이미지 방향에 따라 등쪽/복부 또는 로스트랄/코달 방향으로 눈 중앙에 배치합니다.
2. B 모드에서는 최대 피사계 심도로 눈의 중간 및 가장 깊은 부분을 이미지화하고 관심 있는 모든 구조가 이미지 필드에 표시되는지 확인합니다.
   참고 : 일부 종에서는 크리스탈 렌즈가 유리체 유머의 비교적 큰 비율을 차지하며, 특히 높은 주파수에서 초음파를 흡수 할 수 있습니다.
3. 실시간 이미지를 검사하는 동안 트랜스듀서를 각 면으로 천천히 변환합니다. 관심있는 모든 구조가 이미지 필드에 표시되는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 주파수가 낮고 피사계 심도가 더 큰 변환기로 전환하십시오.
   참고: 다음 중심 주파수는 21MHz: 3cm, 40MHz: 1.5cm, 50MHz: 1cm( 표 1 참조)의 최대 피사계 심도를 허용합니다. 그러나 이러한 최대 피사계 심도 값은 눈이 석회화 또는 기타 초음파 불투과성 구조를 포함하는 경우 현저하게 낮아질 수 있습니다.
4. 이미지 깊이, 깊이 오프셋(이미지의 상단에서 관심 구조까지의 거리), 이미지 폭, 초점 영역의 수 및 위치를 조정하여 세 가지 공간 차원 모두에서 원하는 관심 영역을 커버합니다(예: 이미지 깊이 1cm, 깊이 오프셋 2mm, 이미지 너비 1cm, 1초점 영역).
   참고: 이러한 매개 변수를 조정하는 단추의 특정 이름은 초음파 시스템마다 다를 수 있지만 대부분의 시스템에는 이러한 조정에 대한 논리적 이름을 가진 단추가 있습니다. 이러한 이미지 매개 변수 설정은 일반적으로 초음파 획득의 가능한 시간 해상도 범위에 영향을 미칩니다.
5. 프레임 속도를 50-120 프레임 · ^s-1 범위로 설정합니다.
   참고: 시간 해상도(즉, 연속적인 B-스캔 사이의 시간 간격)는 이미지화된 혈관에서 큰 픽셀 강도 변동성을 표시하기에 적합해야 합니다. 즉, 시간 해상도가 너무 높지 않아야 합니다. 반면에, 적당한 시간 내에 눈의 완전한 3D 레코딩을 완료하기 위해, 시간 해상도는 너무 낮을 수 없다. 50-120 프레임 · ^s-1 범위의 시간 분해능은 일반적으로 대부분의 종에서 흐름이 강화 된 절차에 적합합니다. 일부 초음파 시스템에서, 이 원하는 시간 분해능은 "일반 영상"(높은 공간적/낮은 시간적 해상도)과 "심장학"(낮은 공간적/높은 시간적 해상도) 모드 사이를 전환함으로써 얻을 수 있다.
6. 2D 게인을 레벨(~5dB)로 조정하여 해부학적 구조가 B 모드 획득에서만 볼 수 있도록 하여 후속 흐름 강화 재구성에서 신호 대 잡음비를 증가시킵니다.
7. 단일 슬라이스 위치에서 2D 흐름 향상 이미지를 획득하려면 트랜스듀서를 이 위치로 변환하고 단계 3.1에서 계속하십시오.
8. 전체 관심 영역, 예를 들어, 망막의 3D 기록을 획득하기 위해, 트랜스듀서를 관심 영역의 하나의 극단으로 변환한다.
   1. 관심 영역의 극단적 끝의 정확한 위치를 결정하려면 2D 게인을 간단히 늘립니다.
   2. 올바른 트랜스듀서 배치가 완료된 후, 레코딩 전에 2D 게인을 낮추어 후속 흐름 향상 재구성에서 최대 신호 대 잡음비를 보장합니다.
9. 3D 녹화의 각 단계(슬라이스)에 대해 ≥100프레임(최적 ≥1000프레임)을 획득합니다.
10. 마이크로 매니퓰레이터 또는 내장 트랜스듀서 모터를 사용하여, 예를 들어, 25 μm 또는 50 μm(스텝 크기에 유의해야 함)의 단계로 관심 영역 전체에 걸쳐 트랜스듀서를 변환하고 각 단계에 대해 ≥100 프레임 획득을 반복한다.
11. 기관의 동물 관리 지침에 따라 연구 동물을 안락사시킵니다.

3. 흐름이 향상된 이미지 재구성

1. 녹음을 의학(DICOM) 파일 형식(리틀 엔디안)의 디지털 이미징 및 통신으로 내보냅니다.
2. ≥100프레임(T) 시네 레코딩을 기반으로 단일 흐름 향상 이미지를 생성하려면 다음 공식을 사용하여 픽셀 레벨의 표준 편차(STD(x,y))를 계산합니다.
   
   여기서 It(x,y)는 시간 t에서의 (x,y) 픽셀 좌표에서의 픽셀의 강도이고, _Īt(x,y)는 시간에 따른 I의 산술 평균값이다.
3. 3D 녹화의 각 슬라이스에 대해 3.2단계를 반복합니다.
4. 3D 레코딩에서 여러 슬라이스에 대한 STD 계산 및 이미지 재구성 프로세스를 자동화하려면 ImageJ 및 보조 매크로 스크립트(보충 파일 1)를 사용하여 배치 모드에서 이 작업을 수행합니다.
5. 재구성된 모든 슬라이스를 하나의 이미지 스택으로 결합합니다(ImageJ에서 이미지 스택으로 명령 참조).
6. 획득 중에 사용되는 단계 크기에서 슬라이스 두께를 지정합니다(ImageJ의 속성 명령).
7. 이미지 스택을 3D TIF 파일로 저장합니다.
   참고: 안구 혈관의 유동 가중 입체 기록은 볼륨 렌더링을 생성하고 눈의 혈관 구조에 대한 디지털 및 물리적 해부학 모델을 구축하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 이미지 처리 옵션은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 자세한 내용은 이전에 게시된 문서를 참조하십시오.^33,34,35.

결과

눈의 혈관 침대를 영상화하기 위한 유동 강화 초음파 기술은 다양한 종에 적용될 수 있으며 현재 46종의 척추동물에서 사용되고 있다(도 1, 표 1). 비 성인 포유류 척추 동물에서 유핵화 된 적혈구의 존재는 시네 기록에서 정적 조직과 비교하여 흐르는 혈액의 긍정적 인 대조를 제공합니다 (보충 파일 2). 그러나 프레임별로 분석하면 혈액과 주변 조직 ...

토론

흐름이 강화된 초음파를 이용한 혈관 영상화는 눈의 혈관구조의 비침습적 영상화를 위한 새로운 방법을 제공하며, 이는 현재의 기술에 비해 몇 가지 장점을 제공하지만 본질적인 한계를 가지고 있다. 흐름이 강화된 초음파의 주요 장점은 망막 색소 상피를 초과하는 피사계 심도를 갖는 안구 혈관조영술을 생성할 수 있다는 것인데, 이는 광학 기술에서 피사계 심도를 제한한다. 초음파 이미징에서...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MS-222	Sigma	E10521-50G
Benzocaine	Sigma	E-1501
Propofol	B Braun	12260470_0320
Alfaxalon	Jurox	NA
Isoflurane	Zoetis	50019100
Ultrasound scanner	VisualSonics	Vevo 2100