Глубокая сосудистая визуализация в глазу с помощью ультразвука с усилением потока

Резюме

Представлена неинвазивная ультразвуковая методика генерации трехмерных ангиографий в глазу без использования контрастных веществ.

Аннотация

Сетчатка в глазу является одной из самых энергоемких тканей в организме и, таким образом, требует высоких скоростей доставки кислорода из богатого кровоснабжения. Капиллярная пластинка сосудистой оболочки выстилает внешнюю поверхность сетчатки и является доминирующим источником кислорода в большинстве сетчаток позвоночных. Тем не менее, это сосудистое русло сложно изобразить с помощью традиционных оптических методов из-за его положения позади сетчатки с высоким поглощением света. Здесь описана высокочастотная ультразвуковая методика с последующим увеличением потока до изображения глубоких сосудистых русл (0,5-3 см) глаза с высоким пространственно-временным разрешением. Этот неинвазивный метод хорошо работает у видов с ядерными эритроцитами (немлекопитающие и фетальные животные модели). Он позволяет генерировать неинвазивные трехмерные ангиографии без использования контрастных веществ и не зависит от углов кровотока с более высокой чувствительностью, чем методы ультразвуковой визуализации на основе допплера.

Введение

Высокий метаболизм на сетчатке позвоночных накладывает внутренний компромисс между двумя противоположными потребностями; высокая скорость кровотока и легкий путь, лишенный кровеносных сосудов. Чтобы избежать нарушения зрения перфузирующих эритроцитов, сетчатка всех позвоночных получает кислород и питательные вещества через лист капилляров за фоторецепторами, хориокапиллярий1,2,3. Однако этот единственный источник питательных веществ и кислорода накладывает диффузионное ограничение на толщину сетчатки4,5, поэтому многие визуально активные виды обладают различными сложными сосудистыми сетями, чтобы обеспечить дополнительное кровоснабжение этого метаболически активного ^{органа6}. Эти сосудистые русла включают кровеносные сосуды, перфузирующие внутренние слои сетчатки у млекопитающих и некоторых рыб4,7,8,9,10, кровеносные сосуды на внутренней (светлой) стороне сетчатки, обнаруженные у многих рыб, рептилий и птиц4,11,12,13, и противоточное сосудистое расположение сосудистой оболочки рыбы, сосудистой оболочки мирабиле, что позволяет генерировать суператмосферные парциальные давления кислорода14,15,16,17,18,19,20. Несмотря на то, что эти дополнительные нехироиоидальные пути для снабжения питательными веществами сетчатки играют важную роль в подпитке метаболических потребностей превосходного ^{зрения4}, трехмерная анатомия этих сосудистых структур плохо изучена, что ограничивает наше понимание морфологической эволюции глаза позвоночных.

Традиционно кровоснабжение сетчатки изучалось с использованием оптических методов, таких как офтальмоскопия глазного дна. Эта категория методов обеспечивает высокопроизводительную неразрушающую информацию об анатомии нехироиоидальных кровеносных сосудов в высоком ^{разрешении21} и поэтому легко используется в клинической диагностике аномалий в структуре сосудов сетчатки22. Однако пигментный эпителий сетчатки поглощает проходящий свет и ограничивает глубину обзора в этих оптических методах, обеспечивая уменьшенную информацию о структуре и функции хориоидальной кислоты без использования контрастного ^{вещества21}. Аналогичные ограничения глубины наблюдаются при оптической когерентной томографии (ОКТ). Этот метод может генерировать ангиографию глазного дна высокого разрешения с использованием световых волн за счет технического проникновения на ^{глубину23}, в то время как расширенная глубинная визуализация OCT может визуализировать сосудистую оболочку за счет качества визуализации сетчатки24. Магнитно-резонансная томография преодолевает оптические ограничения офтальмоскопии и ОКТ и может отображать сосудистые слои в сетчатке, хотя и с низким ^{разрешением25}. Гистология и микрокомпьютерная томография (μCT) поддерживают высокое разрешение оптических методов и предоставляют информацию о морфологии сосудов всего ^глаза4, но оба метода требуют забора глаз и поэтому невозможны в клинике или редких или исчезающих видах. Чтобы преодолеть некоторые из ограничений этих установленных методов визуализации сетчатки, в исследовании здесь представлен протокол ультразвука на анестезированных животных, где движение крови отображается in silico на серии равноразмерных двумерных ультразвуковых сканирований, охватывающих весь глаз, путем применения сопоставимой техники, описанной ранее для эмбриональной и сердечно-сосудистой ^{визуализации26,27, 28} и в ОКТ ангиографии29. Этот подход позволяет генерировать неинвазивные трехмерные глубокие глазные ангиографии без использования контрастного вещества и открывает новые возможности для картирования распределения кровотока в глазу между видами.

протокол

Приведенный ниже протокол был выполнен с разрешения Датской инспекции по экспериментам на животных в рамках Министерства продовольствия, сельского хозяйства и рыболовства Дании, Датского управления ветеринарии и продовольствия (номер разрешения 2016-15-0201-00835).

1. Анестезия и ультразвуковая среда

1. Обезболить исследуемого животного.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тип и доза соответствующей анестезии сильно зависят от вида. В целом, иммерсионные анестетики, такие как MS-222 (этил-3-аминобензоат метансульфоновая кислота), бензокаин (этил4-аминобензоат) и пропофол (2,6-диизопропилфенол), полезны у рыб и амфибий, которые легко поглощают анестетик над жабрами или кожей (например, 0,05 мг· ^L-1 бензокаин в радужной форели). Для амниотов доступен ряд растворенных соединений, которые можно вводить внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, как и анестетики на газовой основе. Альфаксалон, вводимый внутримышечно, полезен у рептилий (например, 30 мг·^кг-1 у ящериц), а изофлуран, вводимый в виде газа, полезен птицам (например, 2% в воздухе для голубей). Обратитесь к опубликованной ^{литературе30,31,32} для полного обзора доступных анестетиков по видам.
2. Проверка рефлексов у животного для подтверждения оптимального уровня анестезии. Убедитесь, что животное полностью неподвижно во время процедуры, так как ультразвуковая процедура с усиленным потоком чувствительна к шуму движения.
   1. Слишком глубокая анестезия может изменить характер кровотока, поэтому проведите титрование дозы на начальном этапе эксперимента.
   2. Увеличивайте дозировку анестезии поэтапно и наблюдайте за кровотоком в глазу с помощью ультразвукового исследования в режиме простой яркости (B-режим).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный уровень анестезии получается, когда животное неподвижно (кроме дыхания) с видимым глазным кровотоком.
3. Если тип/доза анестетика не является разрешительной для дыхательных движений, то обеспечьте адекватную вентиляцию животного, например, используя воздушный насос для насыщения кислородом воды для водных видов или вентилятор для дышащих воздухом видов.
4. Расположите животное в позе, которая обеспечивает прямой доступ сверху к глазу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от вида, это может быть как в лежачем, так и в боковом положении. Может быть полезно сконструировать простое удерживающее устройство с использованием небольшого куска нереактивного металла (например, нержавеющей стали) и свободных резиновых лент (см. Рисунок 1).
5. Поместите соответствующую ультразвуковую среду на глаз животного. Если чешуйчатые веки (ультразвуковые непроницаемые) закрывают глаза, то аккуратно смещайте их ватным тампоном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для водных видов лучшей ультразвуковой средой является чистая резервуарная вода, в которой обычно живет животное. Для наземных видов большое количество ультразвукового геля обеспечивает свободные движения и визуализацию ультразвукового преобразователя (т. Е. Зонда линейной решетки) по всей поверхности глаза. Ветеринарная мазь на контралатеральный глаз требуется наземным видам.

2. Получение 2D и 3D глазных ультразвуковых изображений

1. Расположите ультразвуковой преобразователь медиально к глазу в дорсальной/вентральной или ростральной/каудальной ориентации в зависимости от желаемой ориентации изображения.
2. В B-режиме, с максимальной глубиной резкости, визуализируйте медиальную и самую глубокую часть глаза и убедитесь, что все интересующие структуры видны в поле изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: У некоторых видов хрусталик занимает сравнительно большую долю стекловидного тела, которое может поглощать ультразвук, особенно на более высоких частотах.
3. Медленно переводите преобразователь в каждую сторону, проверяя изображения в режиме реального времени. Убедитесь, что все интересующие структуры видны в поле изображения; если нет, переключитесь на преобразователь с более низкой частотой и большей глубиной резкости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие центральные частоты допускают следующую максимальную глубину резкости: 21 МГц: 3 см, 40 МГц: 1,5 см, 50 МГц: 1 см (см. Таблицу 1). Однако эти максимальные значения глубины резкости могут быть заметно ниже, если глаз содержит кальцинированные или другие ультразвуковые непроницаемые структуры.
4. Настройте глубину изображения, смещение глубины (расстояние от верхней части изображения до интересующей структуры), ширину изображения, а также количество и положение фокусных зон для охвата желаемой области интереса во всех трех пространственных измерениях (например, глубина изображения 1 см, смещение глубины 2 мм, ширина изображения 1 см, одна фокусная зона).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя конкретные названия кнопок, которые регулируют эти параметры, могут варьироваться в зависимости от ультразвуковых систем, большинство систем будут иметь кнопки с логическими именами для этих настроек. Эти настройки параметров изображения обычно влияют на диапазон возможных временных разрешений получения ультразвука.
5. Установите частоту кадров в диапазоне 50-120 кадров·^с-1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Временное разрешение (т.е. временной интервал между последовательными B-сканированиями) должно быть достаточным для отображения большой изменчивости интенсивности пикселей в изображенных кровеносных сосудах, т.е. временное разрешение не должно быть слишком высоким. С другой стороны, чтобы завершить полную 3D-запись глаза за разумное время, временное разрешение не может быть слишком низким. Временное разрешение в диапазоне от 50-120 кадров·^с-1 обычно достаточно для процедуры с усилением потока у большинства видов. На некоторых ультразвуковых системах это желаемое временное разрешение может быть получено путем переключения между режимами «общая визуализация» (высокое пространственное / низкое временное разрешение) и «кардиология» (низкое пространственное / высокое временное разрешение).
6. Отрегулируйте коэффициент усиления 2D до уровня (~5 дБ), чтобы анатомические структуры были видны только в B-режиме, чтобы увеличить отношение сигнал/шум при последующей реконструкции с усилением потока.
7. Чтобы получить 2D-изображение с улучшенным потоком в положении одного среза, переведите преобразователь в это положение и продолжите на шаге 3.1.
8. Чтобы получить 3D-запись целой интересующей области, например, сетчатки, переведите преобразователь в одну крайность интересующей области.
   1. Чтобы определить точное положение крайнего конца интересующей области, кратко увеличьте коэффициент усиления 2D.
   2. После завершения правильного размещения датчика уменьшите коэффициент усиления 2D перед записью, чтобы обеспечить максимальное соотношение сигнал/шум при последующей реконструкции с увеличением потока.
9. Для каждого шага (среза) в 3D-записи приобретайте ≥100 кадров (оптимально ≥1000 кадров).
10. Используя микроманипулятор или встроенный двигатель преобразователя, переведите преобразователь по всей интересующей области на ступени, например, 25 мкм или 50 мкм (не забудьте отметить размер шага) и повторите получение ≥100 кадров для каждого шага.
11. Усыплите исследуемое животное в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными учреждения.

3. Реконструкция изображения с улучшенным потоком

1. Экспортируйте записи в формат цифровых изображений и коммуникаций в медицине (DICOM) (младший порядковый номер).
2. Чтобы получить одно изображение с улучшенным потоком на основе кинозаписи ≥100 кадров (T), вычислите стандартное отклонение на уровне пикселей (STD(x,y)) по формуле:
   
   Где _It(x,y) — интенсивность пикселя в координате пикселя (x,y) в момент времени t, а _Īt(x,y) — среднее арифметическое значение I с течением времени.
3. Повторите шаг 3.2 для каждого фрагмента в 3D-записи.
4. Чтобы автоматизировать процесс STD-вычисления и реконструкции изображения для нескольких срезов в 3D-записи, проведите эту операцию в пакетном режиме, используя, например, ImageJ и дополнительный макроскрипт (Дополнительный файл 1).
5. Объедините все реконструированные фрагменты в один стек изображений (команда «Изображения в стек» в ImageJ).
6. Укажите толщину фрагмента из размера шага, используемого при получении (команда «Свойства» в ImageJ).
7. Сохраните стек изображений в виде 3D-файла TIF.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Взвешенные потоком трехмерные записи глазных кровеносных сосудов впоследствии могут быть использованы для создания объемных рендеров и построения цифровых и физических анатомических моделей сосудистых структур глаза. Эти параметры обработки изображений выходят за рамки данного протокола; обратитесь к ранее опубликованным статьям для получения более ^{подробной информации33,34,35}.

Результаты

Ультразвуковой метод с усилением потока для изображения сосудистых русл глаза может применяться у целого ряда видов и в настоящее время используется у 46 различных видов позвоночных (рисунок 1, таблица 1). Наличие ядерных эритроцитов у позвоночных, не являющихся...

Обсуждение

Визуализация сосудов с использованием ультразвука с усилением потока обеспечивает новый метод неинвазивной визуализации сосудистой системы глаза, который предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, но имеет свои внутренние ограничения. Основным преимущ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MS-222	Sigma	E10521-50G
Benzocaine	Sigma	E-1501
Propofol	B Braun	12260470_0320
Alfaxalon	Jurox	NA
Isoflurane	Zoetis	50019100
Ultrasound scanner	VisualSonics	Vevo 2100