In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Resumen

Aquí, presentamos tres protocolos de análisis de datos para imágenes de angiografía fluoresceínica (AF) y tomografía de coherencia óptica (OCT) en el estudio de la oclusión de la vena retiniana (OVR).

Resumen

Los avances en las herramientas de imágenes oftálmicas ofrecen un nivel de acceso sin precedentes a los investigadores que trabajan con modelos animales de lesión neurovascular. Para aprovechar adecuadamente esta mayor traducción, es necesario idear métodos reproducibles para extraer datos cuantitativos de estas imágenes. La tomografía de coherencia óptica (OCT) puede resolver la histología de la retina a una resolución micrométrica y revelar diferencias funcionales en el flujo sanguíneo vascular. Aquí, delineamos lecturas vasculares no invasivas que utilizamos para caracterizar el daño patológico después del insulto vascular en un modelo de ratón optimizado de oclusión de la vena retiniana (OVR). Estas lecturas incluyen análisis de imágenes en vivo de la morfología de la retina, desorganización de las capas internas de la retina (DRIL) medida de isquemia capilar y medidas de angiografía fluoresceínica del edema retiniano y la densidad vascular. Estas técnicas corresponden directamente a las utilizadas para examinar a los pacientes con enfermedad retiniana en la clínica. La estandarización de estos métodos permite la comparación directa y reproducible de modelos animales con fenotipos clínicos de enfermedad oftálmica, aumentando el poder de traducción de los modelos de lesión vascular.

Introducción

La enfermedad neurovascular es un importante problema de salud responsable de accidentes cerebrovasculares isquémicos, una de las principales causas de mortalidad y morbilidad, y enfermedades vasculares retinianas que conducen a la pérdida de visión ^1,2. Para modelar la enfermedad neurovascular, empleamos un modelo de ratón de oclusión de la vena retiniana (OVR). Este modelo no es invasivo y utiliza técnicas de imagen in vivo similares a las utilizadas para examinar a las personas con enfermedad vascular retiniana en un entorno clínico. Por lo tanto, el uso de este modelo aumenta el potencial traslacional de los estudios que utilizan este modelo. Al igual que con todos los modelos de ratón, es fundamental maximizar la reproducibilidad del modelo.

Las enfermedades vasculares de la retina son una causa importante de pérdida de visión en personas menores de 70 años. La OVR es la segunda enfermedad vascular retiniana más frecuente después de la retinopatía diabética³. Las características clínicas características de la OVR incluyen lesión isquémica, edema retiniano y pérdida de visión como consecuencia de la pérdida neuronal ^3,4. Se han desarrollado y refinado modelos de ratón de OVR utilizando fotocoagulación con láser de los principales vasos para replicar patologías clínicas clave observadas en la OVR humana ^5,6,7. Los avances en imágenes oftálmicas también permiten la replicación de herramientas de diagnóstico no invasivas utilizadas en humanos, a saber, la angiografía fluoresceínica (AF) y la tomografía de coherencia óptica (OCT)⁶. La angiografía fluoresceínica permite observar la fuga debida a la ruptura de la barrera hematoretiniana (BRB), así como la dinámica del flujo sanguíneo en la retina, incluidos los sitios de oclusión, utilizando la inyección de fluoresceína, un pequeño colorante fluorescente ^8,9. La imagen de OCT permite la adquisición de imágenes transversales de alta resolución de la retina y el estudio del grosor y la organización de las capas retinianas¹⁰. Históricamente, el análisis de las imágenes de AF ha sido en gran medida cualitativo, lo que limita el potencial de comparación directa y reproducible entre los estudios. Recientemente, se han desarrollado varios métodos para la cuantificación del espesor de la capa en imágenes OCT, aunque actualmente no existe un protocolo de análisis estandarizado y el sitio de adquisición de imágenes OCT varía¹¹. Para aprovechar adecuadamente estas herramientas, se necesita una metodología de análisis de datos estandarizada, cuantitativa y replicable. En este artículo, presentamos tres lecturas vasculares utilizadas para evaluar el daño patológico en un modelo de ratón de fuga de RVO-fluoresceína, grosor de la capa de OCT y desorganización de las capas de retina.

Protocolo

Este protocolo sigue la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los experimentos con roedores fueron aprobados y monitoreados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia.

NOTA: Las imágenes se realizaron en ratones machos C57BL / 6J de 2 meses de edad que pesaban aproximadamente 23 g.

1. Preparación de reactivos para imágenes de la retina

1. Preparación de solución inyectable de fluoresceína.
   NOTA: La fluoresceína es muy sensible a la luz. Protéjalo de la luz y úselo poco después de la preparación.
   1. Diluir la fluoresceína a una concentración del 1% en solución salina estéril.
2. Preparación de ketamina/xilazina
   1. Diluir ketamina y xilazina en solución salina estéril en consecuencia para la siguiente concentración: ketamina (80-100 mg / kg) y xilazina (5-10 mg / kg).
3. Solución salina estéril
   1. Prepare una jeringa de 5 ml con una aguja de 26 g con solución salina estéril.

2. OCT e imágenes con fluoresceína

1. Encienda la caja de luz del microscopio de imágenes de retina, la máquina OCT y la plataforma de ratón calentado.
2. Encienda el equipo y abra el programa de imágenes.
3. Agregue una gota de fenilefrina y tropicamida a cada ojo.
4. Inyecte 150 μL de anestesia (ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg)) por vía intraperitoneal (IP). Determine la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie y espere hasta que el animal no responda. Aplique ungüento oftálmico o lágrimas artificiales en ambos ojos.
5. Coloque el ratón en la plataforma.
6. Ajuste la altura y el ángulo de la plataforma hasta que la vista del fondo de ojo de la retina sea clara y enfocada. Tome una foto del fondo de ojo.
7. Abra el software de imágenes y OCT. En el programa OCT, ajuste el empujón a 5.
8. Tome una imagen de OCT a 75 μm distal de la quemadura. Repita para los otros tres cuadrantes de la retina.
9. Inyectar 100 μL de fluoresceína al 1% IP.
10. Cambie la cámara a un filtro de 488 nm. Aumente la ganancia de la cámara a 5.
11. Tome una foto del fondo de ojo exactamente 5 minutos después de la inyección de fluoresceína.
    NOTA: Evite la exposición prolongada del ojo a la luz de la cámara en el ajuste máximo, ya que la fluoresceína puede exacerbar el fotodaño retiniano. Mantenga la fuente de luz apagada hasta que haya transcurrido el tiempo de espera de 5 minutos y el mouse esté listo para la obtención de imágenes.

3. Cuidados posteriores

1. Inyecte 1 ml de solución salina IP estéril. Aplique gotas lubricantes para los ojos en ambos ojos. Aplique ungüento oftálmico o lágrimas artificiales en ambos ojos.
2. Observe al ratón mientras se recupera de la anestesia. Regrese a la jaula con otros animales solo cuando esté completamente recuperado, generalmente después de unos 40 minutos.

4. Evaluación de los criterios de exclusión

1. Abra la imagen del fondo de ojo tomada a las 24 h después del procedimiento para evaluar los criterios de exclusión. Excluya el ojo si se identifica alguno de los siguientes criterios.
2. Evaluar si la imagen tiene cero oclusiones
   1. Evalúe la imagen para el número de vasos ocluidos.
      NOTA: Una oclusión exitosa generalmente tiene algo de pigmentación púrpura en o alrededor de la quemadura, vaso muy delgado o discontinuo a través de la quemadura, apariencia débil o inexistente del vaso fuera del área de la quemadura y decoloración retiniana por hipoxia. Si todo el recipiente se puede ver a través de la quemadura blanca por el láser, el recipiente no pudo ocluir. A veces, el vaso aparecerá parcialmente obstruido, pero si parece ininterrumpido fuera de la quemadura, es probable que el vaso no ocluya.
   2. Para casos ambiguos, use imágenes de AF en el mismo punto de tiempo para evaluar las oclusiones. En estas imágenes, una oclusión aparecerá como una ruptura en la continuidad de un recipiente, a menudo con una estrechación del vaso circundante.
   3. Si se identifican cero oclusiones, excluir el ojo del análisis, ya que la OVR se considera ineficaz.
      NOTA: Las oclusiones generalmente se resuelven a las 48-72 h después de la OVR, y la presencia de oclusiones ya no debe usarse como criterio de exclusión en estos puntos temporales.
3. Evaluar las imágenes del fondo de ojo y la OCT para detectar un desprendimiento excesivo de retina
   NOTA: La acumulación de líquido subretiniano es común después de la inducción de la RVO y causa la separación de la retina neural del EPR. Los criterios de exclusión para el desprendimiento excesivo de retina se definen de la siguiente manera: OCT será completamente invisible o algunas capas aparecerán increíblemente distorsionadas. La calidad de imagen es pobre, con una pérdida de resolución de las capas plexiformes externas y RPE. La separación entre la retina neural y la coroides es mayor de lo que permite el campo de visión de la OCT. En la imagen del fondo de ojo, el tono de la retina será casi completamente blanco, con algunas manchas púrpuras. Parte de la retina puede aparecer distorsionada y desenfocada. Esto se debe a que se ha desprendido y está a una distancia focal diferente que el resto de la retina.
   1. Si la evaluación de las imágenes de un ojo determina un desprendimiento periférico o completo de la retina, excluir el ojo del análisis.
4. Excluir imágenes con evidencia de catarata corneal
   NOTA: Una catarata corneal aparece como un punto blanco opaco en la córnea del ratón. Las cataratas generalmente ocurren debido a una lubricación insuficiente de los ojos mientras el animal está anestesiado y pueden evitarse en gran medida teniendo cuidado de aplicar ungüento para los ojos generosamente. Las cataratas generalmente se pueden identificar antes de la obtención de imágenes mediante la inspección del animal. Los ratones que han desarrollado cataratas deben ser excluidos del conjunto de datos sin necesidad de someterse al proceso de imagen. En las imágenes, las cataratas oscurecerán la retina de la cámara y la OCT aparecerá deformada.
5. Evaluar la imagen para detectar hemorragia excesiva
   NOTA: La hemorragia excesiva se puede identificar como cantidades de líquido rojo en la imagen, que generalmente oscurecen el fondo retiniano, el vaso y la quemadura. Estas áreas de líquido rojo serán de un rojo más brillante y opaco que las manchas púrpuras que son normales en la OVR exitosa. Las hemorragias aparecen en la capa de células ganglionares en las imágenes de OCT e interfieren con la capacidad de visualizar otras capas de la retina debajo de la hemorragia.
   1. Si se determina que la imagen tiene una hemorragia excesiva, excluya el ojo del análisis.

5. Procesamiento de imágenes con fluoresceína

1. Abra la imagen de fluoresceína en el software de procesamiento de imágenes.
2. Duplicar la imagen
3. Usando una herramienta de selección, rastree cuidadosamente los vasos principales.
   1. Los vasos principales son las venas y arterias más gruesas que irradian desde el disco óptico. Ignore cualquier vaso que se ramifique de estos recipientes.
   2. Si la fuga impide que el contorno del recipiente se vea cerca del sitio de oclusión, trace a través de la fuga en la ubicación aproximada del recipiente (mantenga el espesor, conecte el último punto visible al siguiente punto visible).
4. En la primera imagen, elimine la selección, dejando solo el fondo. Guarde esta imagen enmascarada.
5. Mueva la selección a la segunda imagen, invierta la selección y elimine, aislando los vasos. Guarde esta imagen enmascarada.
6. Abra las dos imágenes en ImageJ. Abra la imagen de fondo y mida la densidad integrada.
7. Abra la imagen del recipiente, seleccione el contorno de los recipientes y luego mida la intensidad media.
8. Divida la densidad integrada del fondo por la intensidad media de los vasos, generando la relación de fuga para el ojo.
9. Registre esta relación de fuga para cada ojo en una cohorte experimental.
10. Para controlar aún más el fondo, normalice los ojos experimentales a la proporción media de fugas de los ojos de control no lesionados.
    NOTA: Para crear una cuantificación estandarizada de la fuga de fluoresceína en la imagen FA, este cálculo utiliza una relación de la densidad de fondo (donde estará presente la fuga) con el brillo de los vasos principales para crear resultados que controlan la variación en el brillo de una imagen a otra y se pueden cuantificar de manera confiable. Los ojos que no están dañados no tienen fugas y teóricamente deberían tener proporciones de cero. Las relaciones calculadas a partir de estos ojos de control no dañados, por lo tanto, representan ruido de fondo, y este valor se utiliza para normalizar aún más los valores experimentales.

6. Grosor de la capa retiniana

1. Abra la imagen de OCT en el software de procesamiento de imágenes.
2. Trazar los bordes de la capa de células ganglionares, la capa plexiforme interna, la capa nuclear interna, la capa plexiforme externa, la capa fotorreceptora y la capa de EPR. Mide el grosor medio de cada capa.
3. Repita para las imágenes de OCT de los otros tres cuadrantes de la retina. Promedie los espesores medios de la capa en los cuatro cuadrantes para obtener el grosor medio de cada capa retiniana para el ojo.
4. Repita para cada ojo en la cohorte experimental.

7. Desorganización de las capas internas de la retina (DRIL)

1. Abra la imagen de OCT en ImageJ.
2. Con la herramienta de línea, mida la distancia donde el borde superior de la capa plexiforme externa es indistinto.
   NOTA: Es importante diferenciar entre DRIL y áreas de visibilidad deficiente de la capa causadas por artefactos de imágenes. La mala calidad de imagen de la OCT puede invalidar un ojo para el análisis DRIL si no es posible una resolución de imagen suficiente. Las imágenes con DRIL suelen tener otras regiones o capas retinianas que están claramente resueltas y organizadas, lo que puede ser un buen indicador de una calidad de imagen suficiente.
   1. Mida horizontalmente desde la latitud donde comienza la desorganización hasta la latitud donde el borde superior de la capa plexiforme externa vuelve a ser visible, si es que lo hace. Incluso si la capa plexiforme externa se desplaza hacia arriba o hacia abajo verticalmente, mida perfectamente horizontalmente.
   2. Puede haber múltiples áreas de desorganización separadas por áreas sin desorganización. Mide estos individualmente y calcula la suma de las distancias.
3. Divida la duración de la desorganización por la longitud total de la retina visible en cada imagen de OCT para obtener la proporción de desorganización de la imagen.
4. Repita la medición y el cálculo de las imágenes de OCT de los otros tres cuadrantes de la retina.
5. Tome la media de las proporciones de desorganización de las cuatro imágenes de OCT. Este número representa la desorganización promedio para toda la retina. Repita para cada ojo en la cohorte experimental.

Resultados

Estos métodos de análisis permiten la cuantificación de la patología retiniana capturada por imágenes de AF y OCT. Los experimentos de los que se extraen los datos representativos utilizaron ratones machos C57BL / 6J que sirvieron como controles no lesionados o se sometieron al procedimiento RVO y recibieron gotas para los ojos de tratamiento Pen1-XBir3 o gotas para vehículos Pen1-Saline para vehículos. El modelo de lesión RVO involucró la irradiación láser (532 nm) de las venas principales en cada ojo de un r...

Discusión

Las imágenes no invasivas de la retina de roedores presentan una vía para estudiar la patología y desarrollar intervenciones. Estudios previos han desarrollado y optimizado un modelo de ratón de OVR, limitando la variabilidad y permitiendo la traducción fiable de patologías clínicas comunes en la retina murina ^5,7,13. Los desarrollos en la tecnología de imagen oftálmica permiten además el uso de técnicas clínicas de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AK-Fluor 10%	Akorn	NDC: 17478-253-10	light-sensitive
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
GenTeal	Alcon	00658 06401
Image J	NIH
InSight 2D	Phoenix Technology Group		OCT analysis software
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoenix Micron IV	Phoenix Technology Group		Retinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian Module	Phoenix Technology Group		Laser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module	Phoenix Technology Group		OCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix Module	Phoenix Technology Group		Fundus imaging and acquisition targeting
Photoshop	Adobe
Refresh	Allergan	94170
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20